本发明属于微生物领域，具体涉及一种发酵巨菌草生物基及其制备方法。
背景技术：
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巨菌草(pennisetumgiganteumz.x.lin)是多年生禾本科直立丛生型植物，粗蛋白和糖分含量高。巨菌草经过接种植物乳杆菌、副干酪乳杆菌等菌种发酵后，ph值降低、乳酸、乙酸等成分增加，乳酸菌菌数同时大量增加，有效的提高了巨菌草的使用价值。发酵后的巨菌草可整包投入养殖水体中，其作用是，发酵巨菌草含有大量兼性厌氧的益生菌，在水体环境中可利用巨菌草中的蛋白质、糖分以及池塘中有机物等成分进行繁殖生长，有效降解水体中的氨氮、亚硝酸盐、抑制水体中藻类生长，同时促进水体中其他微生物的生长，改善水质。
植物乳杆菌和副干酪乳杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的菌株之一,其已被越来越多地研制成饲用微生物制剂。
发酵巨菌草生物基是以具有活性乳酸菌的巨菌草为主要成分，通过简单，易于工业化生产的生产工艺，制备一种水产养殖用益生菌制剂。本发明创造的产品能有效降解养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐，抑制水体中藻类生长，减少抗生素的使用，促进水产养殖业的健康发展。
技术实现要素：
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本发明的是提供一种有效活性乳酸菌菌数高的发酵巨菌草生物基及其制备方法。
本发明的发酵巨菌草生物基是通过以下方法制备的，其包括以下步骤：
将混合菌液添加到巨菌草草料上，接种量为每kg草料30-100g混合菌液，密封发酵，在温度为20-35℃下发酵10-30天，至发酵草料的ph值达到3.5-4.5之间时，发酵结束，由此得到发酵巨菌草生物基；
所述的混合菌液每毫升含有副干酪乳杆菌5×107-1×109个和植物乳杆菌9×107-1.25×109个。
所述的巨菌草草料是将新鲜收割的巨菌草成熟菌株粉碎至3-10cm而得到。
本发明的发酵巨菌草生物基，其有效活性乳酸菌菌数在5×108-5×109cfu/g，能够在养殖水体中利用巨菌草中的蛋白质、糖分以及池塘中有机物等成分进行繁殖生长，有效降解水体中的氨氮、亚硝酸盐、抑制水体中藻类生长，改善水质，减少抗生素的使用，促进水产养殖业的健康发展。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1发酵巨菌草生物基的制备方法
(1)副干酪乳杆菌菌液的制备
从斜面上挑取副干酪乳杆菌菌种的单菌落，分别接种至一个装有100ml改良mc培养基的250ml三角瓶中，37℃静置培养24h，进行活化；再将活化后的菌液以体积分数4％接种量，接种到三个装有350ml的500ml三角瓶中37℃静置培养24h，制备摇瓶种子液。
将上述摇瓶种子液以体积分数5％的接种量接到装有糖蜜液体培养基的30l种子罐中进行发酵，装液量为体积分数75％，发酵温度37℃，静置培养，培养至发酵液ph为4.0左右，此发酵液即为第二级种子液。
将上述30l的第二级种子液以8％的接种量接到装有糖蜜液体培养基的300l种子罐中进行发酵，装液量为体积分数80％，发酵温度37℃，静置培养，培养至发酵液ph为4.0，得到副干酪乳杆菌菌液，检测发酵液活菌数。
(2)按照与上述副干酪乳杆菌菌液同样的方法制备植物乳杆菌菌液
1、改良mc培养基：
加水至1000ml，调节ph至6.0±0.2。固体培养基加质量分数2％琼脂。灭菌备用
2、糖蜜液体培养基：
加水至1000ml，调节ph至6.8±0.2，灭菌备用。
(3)发酵巨菌草的制备
取新鲜收割的巨菌草成熟菌株，鲜重约2000kg，将巨菌草粉碎至3cm左右，然后将副干酪乳杆菌菌液和植物乳杆菌菌液按体积比1：9比例混合的混合菌液接种到粉碎后的草料上，所述的混合菌液每毫升含有副干酪乳杆菌5×107个，植物乳杆菌9×107个，接种量为每kg草料接种30g混合菌液，搅拌均匀，立即装入专用的发酵袋，每袋装30kg，置于20摄氏度下发酵30天。期间检测物料ph值以及活菌数。待ph4.5时发酵结束，由此得到发酵巨菌草生物基，最后成品阴凉处储存。测得植物乳杆菌和副干酪乳杆菌活菌总数达到5×108cfu/g，
(4)发酵巨菌草生物基活菌数的测定
1平板菌落计数法
1.1称取发酵巨菌草生物基样品10g，放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇床200rpm振荡20min，静置20～30s，制成样品悬液。
1.2用1ml无菌吸管吸取1ml样品悬液，放入盛有9ml灭菌水的试管中，充分振摇使混合均匀，即制成1：100均匀稀释液。
1.3用1ml无菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌水试管内，振摇试管，混合均匀，做成1：1000的稀释液。另取1ml灭菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增稀释液，分别制成10-4、10-5、10-6……10-9梯度稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
1.4选择2-3个适宜稀释度(一般取10-6、10-7、10-8)，用灭菌100μl微量移液器，各取0.1ml注射至灭菌的空白平板上，用无菌推棒均匀涂于整个表面，然后倒入已经冷却至45℃左右的改良mc培养基，每个稀释度做3个平板。
1.5将平皿倒置于37℃±1℃恒温培养箱内培养48h±2h后，选取菌落数在30-300之间的平板计数。
2植物乳杆菌、副干酪乳杆菌菌落形态
形态特征：植物乳杆菌落凸起，呈圆形，表面光滑，细密，呈米白色或浅黄色；副干酪乳杆菌菌落白色或灰白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起。
3菌落计数
3.1稀释度的选择
3.1.1应选择平均菌落在30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之
3.1.2若有两个稀释度。其生长的菌落数均在30-300之间，则视两者之间如何来决定若其比小于或等于2，应报告其平均数；若大于2，则报告其中较小的数字。
3.1.3若所有稀释度的平均菌落数均大于300。则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
3.1.4若所有稀释度平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
3.2计算：
植物乳杆菌和副干酪乳杆菌活菌总数(cfu/g)＝同一稀释度三个平板菌落平均数×稀释倍数×10
(5)发酵巨菌草生物基在水产养殖中的应用效果
将上述所得的发酵巨菌草生物基按10kg/亩·米水深的用量投入黄颡鱼养殖塘中，每个月使用一次，养殖池塘水深1.5m，面积10亩，在投入巨菌草前测得水样ph8.2，氨氮初始浓度为0.55mg/l，亚硝酸盐浓度为0.65mg/l，第90天取水样分析，氨氮浓度为0.2mg/l，亚硝酸盐浓度为0.1mg/l，氨氮降解率为63.63％，亚硝酸盐降解率为84.61％。
实施例2发酵巨菌草生物基的制备方法
(1)副干酪乳杆菌菌液的制备
从斜面上挑取菌种的副干酪乳杆菌单菌落，分别接种至一个装有100ml改良mc培养基(同实施例1)的250ml三角瓶中，37℃静置培养24h，进行活化；再将活化后的菌液以体积分数4％接种量，接种到三个装有350ml的500ml三角瓶中37℃静置培养24h，制备摇瓶种子液。
将上述摇瓶种子液以体积分数5％的接种量接到装有糖蜜液体培养基的30l种子罐中进行发酵，装液量为体积分数75％，发酵温度37℃，静置培养，培养至发酵液ph为4.0左右，得到第二级种子液。
将上述30l的第二级种子液以体积分数8％的接种量接到装有糖蜜液体培养基的300l种子罐中进行发酵，装液量为体积分数80％，发酵温度37℃，静置培养，培养至发酵液ph为4.0，得到副干酪乳杆菌菌液，检测发酵液活菌数。
(2)按照与副干酪乳杆菌菌液同样的方法制备植物乳杆菌菌液
(3)发酵巨菌草的制备
取新鲜收割的巨菌草成熟菌株，鲜重约2000kg，将巨菌草粉碎至6cm左右，然后将副干酪乳杆菌菌液和植物乳杆菌菌液按体积比3：7的混合菌液接种到粉碎后的草料上，所述的混合菌液每毫升含有副干酪乳杆菌3×108个，植物乳杆菌7×108个，接种量每kg草料接种60g混合菌液，搅拌均匀，立即装入专用的发酵袋，每袋装40kg，置于28摄氏度下发酵20天。期间检测物料ph值以及活菌数。待ph4.0时发酵结束，由此得到发酵巨菌草生物基，最后成品阴凉处储存。测得发酵巨菌草生物基中植物乳杆菌和副干酪乳杆菌活菌总数达到1.0×109cfu/g。
(4)发酵巨菌草生物基在水产养殖中的应用效果
将上述所得的发酵巨菌草生物基按10kg/亩·米水深的用量投入草鱼养殖塘中，每个月使用一次，养殖池塘水深1m，面积10亩，在投入巨菌草前测得水样ph8.0，氨氮初始浓度为0.52mg/l，亚硝酸盐浓度为1.65mg/l，第90天取水样分析，氨氮浓度为0.1mg/l，亚硝酸盐浓度为0.3mg/l，氨氮降解率为80.76％，亚硝酸盐降解率为81.82％。
实施例3发酵巨菌草生物基的制备方法
(1)副干酪乳杆菌菌液的制备
从斜面上挑取菌种的副干酪乳杆菌单菌落，分别接种至一个装有100ml改良mc培养基的250ml三角瓶中，37℃静置培养24h，进行活化；再将活化后的菌液以体积分数4％接种量，接种到三个装有350ml的500ml三角瓶中37℃静置培养24h，制备摇瓶种子液。
将上述摇瓶种子液以体积分数5％的接种量接到装有糖蜜液体培养基的30l种子罐中进行发酵，装液量为体积分数75％，发酵温度37℃，静置培养，培养至发酵液ph为4.0左右，由此得到第二级种子液。
将上述30l的种子液以体积分数8％的接种量接到装有糖蜜液体培养基的300l种子罐中进行发酵，装液量为体积分数80％，发酵温度37℃，静置培养，培养至发酵液ph为4.0，由此得到副干酪乳杆菌菌液，检测发酵液活菌数。
(2)按照与副干酪乳杆菌菌液同样的方法制备植物乳杆菌菌液
(3)发酵巨菌草的制备
取新鲜收割的巨菌草成熟菌株，鲜重约2000kg，将巨菌草粉碎至10cm左右，然后将副干酪乳杆菌菌液和植物乳杆菌菌液按体积比5：5的混合菌液接种到粉碎后的草料上，所述的混合菌液每毫升含有副干酪乳杆菌1×109个，植物乳杆菌1.25×109个，接种量每kg草料接种100g混合菌液，搅拌均匀，立即装入专用的发酵袋，每袋装50kg，置于35摄氏度下发酵10天。期间检测物料ph值以及活菌数。待ph3.5发酵结束，由此得到发酵巨菌草生物基，测得此发酵巨菌草生物基植物乳杆菌和副干酪乳杆菌活菌总数达到5×109cfu/g。
(4)发酵巨菌草生物基在水产养殖中的应用效果
将上述所得的发酵巨菌草生物基按10kg/亩·米水深的用量投入虾养殖塘中，每个月使用一次，养殖池塘水深1m，面积10亩，在投入巨菌草前测得水样ph7.5，氨氮初始浓度为0.42mg/l，亚硝酸盐浓度为0.75mg/l，第90天取水样分析，氨氮浓度为0.1mg/l，亚硝酸盐浓度为0.2mg/l，氨氮降解率为76.19％，亚硝酸盐降解率为73.33％。