一种基于流式细胞术的构建基因敲除细胞系的方法与流程

本发明提供了一种改进的构建基因敲除细胞系的方法，该方法中使用到了流式细胞术，属于生物工程技术领域。

背景技术：

crispr/cas9是目前应用广泛的基因组标记工具，该系统利用一段rna引导cas9核酸酶可对多种细胞以及动植物基因组实现特定位点的切割和修饰，具有操作简单、作用高效等优点。利用该系统建立敲除基因细胞系，现在大多数实验室都是将设计好的sg-rna与某一crispr相关的载体(如px458或者lenticrisprv2等)连接，构建载体-sgrna敲除重组质粒，再将该重组质粒导入病毒包装细胞中，收集病毒上清液转染细胞。然后用嘌呤霉素或者g418等抗生素进行筛选。接着通过提基因组测序，筛选出敲除成功的细胞，再对敲除成功的细胞通过有限稀释法将细胞分成单克隆，最后在96孔板中培养。这个方法操作起来过于繁琐，需要比较全面的技术和高要求的实验平台，如慢病毒侵染的方法需要操作病毒，不能在一般的实验室内进行，有限稀释法不仅需要大量的重复性工作，也不能保证能将细胞全部分为单克隆。

技术实现要素：

本发明提供了一种基于流式细胞术的构建基因敲除细胞系的方法，该方法中用流式细胞术来解决构建敲除细胞系过程中的转染效率及慢病毒包装两个瓶颈，从而提供了一种简便的构建敲除细胞系的方法。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种基于流式细胞术的构建基因敲除细胞系的方法，包括以下步骤：

(1)、细胞系的转染：构建带有gfp的序列的px458-sgrna重组质粒，然后将px458-sgrna重组质粒用lipo2000转染到细胞中，使细胞带上绿色荧光；

(2)、流式细胞术分选阳性细胞：然后利用流式细胞仪将带绿色荧光的细胞分选为单细胞；

(3)、单细胞培养：将分选后的带有绿色荧光的单细胞用细胞培养板进行培养；

(4)、测序检测：将培养完毕后的细胞提取基因组并测序，筛选出基因敲除后的细胞系。

步骤(1)中，首先将293t细胞培养在6孔板中，培养至细胞密度长到70％时，将细胞培养液换成opti-mem培养液，并将细胞饥饿处理，然后将构建好的px458-sgrna重组质粒和lipo2000进行混合，并加入到opti-mem培养液中，3小时后，换上完全培养液继续培养，培养48小时后观察荧光，同时准备一个空载体作为阴性对照。

步骤(2)中，首先将转染后细胞消化下来，用pbs缓冲液清洗，将其转入灭菌后的流式管中并混匀；流式细胞仪开始分选的时候选择single模式，然后根据阴性对照调节电压，设置阳性门后，开始将带有绿色荧光的细胞单个打到96孔板中。

步骤(3)中，将筛选出来的带有绿色荧光的单细胞用含有20％血清的完全培养基培养在96孔板中，培养15天后转到24孔板中，继续培养至细胞密度长到80％，然后将细胞转入12孔板中，最后将细胞转到6孔板中继续培养。

步骤(4)中，收取6孔板中的细胞提基因组，测序，筛选出基因敲除后的细胞系，并将该细胞扩大培养，并冻存一部分。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明中先建立px458-sgrna的重组质粒，然后用lipo2000转染到细胞中，再利用流式细胞仪将带绿色荧光的细胞分选为单细胞并直接打到96孔板中培养3周左右，然后将培养起来的细胞提基因组测序，筛选出编辑过的细胞。这种方法解决了构建敲除细胞系过程中的转染效率及慢病毒包装两个瓶颈，更为简便、省时。

附图说明

图1为px458-sgrna质粒转染细胞检测图；

图2为单克隆细胞系序列与野生型序列比对图；

图3为单克隆细胞系序列与野生型序列的测序峰图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。

1细胞系的转染

将293t细胞培养在6孔板中，等细胞密度长到70％准备开始做转染。首先将细胞培养液换成opti-mem将细胞饥饿2小时，然后将构建好的2.5ug的px458-sgrna重组质粒和8ul的lipo2000按照一定比例混合，并加入到细胞培养液中。3小时后，换上完全培养液继续培养。48小时后观察荧光。同时准备一个空载体作为阴性对照。荧光检测结果如图1所示，图1中左上为px458-sgrna1^#转染荧光图，右上为px458-sgrna2^#转染荧光图，左下为px458-sgrna3^#转染荧光图，右下为px458空载体转染荧光图。

2流式细胞术分选阳性细胞

首先将细胞消化下来，用pbs洗2次，准备含10％胎牛血清的pbs到灭好菌的流式管中，上机前轻轻混匀。流式细胞仪开始分选的时候选择single模式，然后根据阴性对照调节电压，设置阳性门后，开始将带有绿色荧光的细胞单个打到96孔板中。

3单细胞培养

将筛选出来的细胞用含有20％血清的完全培养基培养在96孔板中，大约15天就可以将培养的细胞转到24孔板中，等细胞密度长到80％就可以将细胞转入12孔板中，最后将细胞转到6孔板中继续培养。

4测序检测

收取6孔板中的细胞提基因组，测序。测序结果如图2和图3所示。筛选出编辑过的细胞系，并将该细胞扩大培养，冻存一批，然后进行后续相关的实验研究。

技术特征：

技术总结
本发明提供了一种基于流式细胞术的构建基因敲除细胞系的方法，包括以下步骤：(1)、细胞系的转染：构建带有GFP的序列的PX458‑sgRNA重组质粒，然后将PX458‑sgRNA重组质粒用lipo3000转染到细胞中，使细胞带上绿色荧光；(2)、流式细胞术分选阳性细胞：然后利用流式细胞仪将带绿色荧光的细胞分选为单细胞；(3)、单细胞培养：将分选后的带有绿色荧光的单细胞用细胞培养板进行培养；(4)、测序检测：将培养完毕后的细胞提取基因组并测序，筛选出基因敲除后的细胞系。本发明中解决了现有技术中构建敲除细胞系过程中的转染效率及慢病毒包装两个瓶颈，更为简便、省时。

技术研发人员：薛璐;欧阳聪;周婉;刘庆华;沈金花;彭勇波;赵平;马立群;于孟飞;陈微微
受保护的技术使用者：中南民族大学
技术研发日：2017.06.26
技术公布日：2017.10.10