本发明涉及生物工程领域，尤其是涉及一种提高昆虫细胞瞬时转染和稳定表达蛋白表达量的方法。
背景技术：
：：昆虫细胞表达系统已被用于包括组织因子和抗体等在内的许多人类重组蛋白的表达(kost等，1997)。目前，昆虫表达系统主要用于表达亚单位疫苗，除了兽用疫苗还用于生产部分人类疫苗以及重组病毒(maranga等，2002；ryan和walsh等，2012；yang等，2013；miller等，2012)。果蝇s2(drosophilaschneider2)细胞和草地贪夜蛾sf9(spodopterafrugiperda)细胞是常用于异源基因表达的昆虫细胞，可通过构建稳定细胞池的方法进行重组蛋白表达。近年来昆虫细胞已成功用于表达一些具有生物活性的受体蛋白、离子通道蛋白、细胞骨架蛋白、转录因子、激素和凝血因子等(millar等，1995；millar等1994；tota等1995；towers和sattelle等2002；mennella等，2005；winslow等，1989；change等，2005；zmora等，2007；vatandoost等，2012)。但稳定细胞池每升的产量也只能达到几毫克，且尚未有发现简单可行的提高产量方法。瞬时转染在哺乳动物中用于重组蛋白的快速表达的工艺已非常完善，近年来也逐渐应用到昆虫表达系统中(geisse等，2009；hopkins等，2012；loomis等，2005；shen等2013)。昆虫细胞的瞬时转染常用于构建稳定细胞池之前对表达载体的检验(vatandoost等，2012)。近年来，s2、sf9等细胞的瞬时转染开始采用低成本的阳离子聚合物转染试剂，如聚乙烯亚胺，也可在短时间内获得重组蛋白，但其产量也亟待提高。技术实现要素：基于此，有必要提供一种提高昆虫细胞瞬时转染和稳定表达蛋白表达量的方法。一种提高昆虫细胞瞬时转染和稳定表达蛋白表达量的方法，包括如下步骤：配制转染试剂溶液：将线性聚乙烯亚胺溶于ph3-10的无菌水中，配制成浓度为0.1-10g/ml的转染试剂溶液；配制转染复合物：按照线性聚乙烯亚胺与待转染的含目的dna的质粒的质量比为1-20:1的比例将所述转染试剂溶液与待转染的含目的dna的质粒溶液加入无菌水中，震荡混匀，形成转染复合物；瞬时转染：将所述转染复合物加入已传代培养的果蝇s2细胞或草地贪夜蛾sf9细胞的细胞悬液中，摇晃培养，得到已转染含目的dna的质粒的昆虫细胞，将所述昆虫细胞于16-40℃、120-300rpm、2％-10％co2培养箱中摇晃培养，或者于16-40℃、120-300rpm培养箱中以密封盖封住密封培养；稳定细胞池蛋白表达：以所述瞬时转染构建的所述昆虫细胞构建稳定细胞池，以1-8×106个昆虫细胞/ml的密度接种后，于16-40℃、120-300rpm、2％-10％co2培养箱中摇晃培养，或者于16-40℃、120-300rpm培养箱中以密封盖封住密封培养。在其中一个实施例中，昆虫细胞或稳定细胞池的培养温度优选20-32℃，更优选25-29℃。在其中一个实施例中，所述线性聚乙烯亚胺的分子量范围为2.5-40kd，优选25kd。在其中一个实施例中，在所述配制转染试剂溶液过程中，所述无菌水的ph为5.0-7.0，优选ph为6.1。在其中一个实施例中，在所述配制转染试剂溶液过程中，配制的转染试剂溶液中线性聚乙烯亚胺的浓度为0.1-2g/ml，优选1g/ml。在其中一个实施例中，在所述配制转染复合物过程中，对于果蝇s2细胞是按照线性聚乙烯亚胺与待转染的含目的dna的质粒的质量比为2:1的比例配制；对于草地贪夜蛾sf9细胞是按照线性聚乙烯亚胺与待转染的含目的dna的质粒的质量比为3:1的比例配制。在其中一个实施例中，在所述瞬时转染过程中，将所述转染复合物加入已传代培养的果蝇s2细胞或草地贪夜蛾sf9细胞的细胞悬液中是按照每106个细胞转染0.1-3μg含目的dna的质粒的比例添加。在其中一个实施例中，在所述瞬时转染过程中，对于果蝇s2细胞是按照每106个果蝇s2细胞转染0.6μg含目的dna的质粒的比例添加，并于28℃、180rpm、5％co2培养箱中摇晃培养，或者于28℃、180rpm培养箱中以密封盖封住密封培养，并在12-72小时，优选48小时后更换为透气盖子；对于草地贪夜蛾sf9细胞是按照每106个草地贪夜蛾sf9细胞转染1.5μg含目的dna的质粒的比例添加，并于28℃、180rpm、5％co2培养箱中摇晃培养，或者于28℃、180rpm培养箱中以密封盖封住密封培养，并在12-72小时，优选48小时后更换为透气盖子。在其中一个实施例中，在果蝇s2细胞或草地贪夜蛾sf9细胞传代培养时，传代细胞的密度为0.1-2×106个细胞/ml，优选1×106个细胞/ml。在其中一个实施例中，在所述瞬时转染过程中，当传代培养的细胞密度达到2-50×106个细胞/ml时，进行瞬时转染，优选是达到5×106个细胞/ml时，进行瞬时转染。在其中一个实施例中，在所述稳定细胞池蛋白表达过程中，以4×106个昆虫细胞/ml的密度接种，于28℃、180rpm、5％co2培养箱中摇晃培养，或者于28℃、180rpm培养箱中以密封盖封住密封培养，并在12-72小时，优选48小时后更换为透气盖子。传统的在昆虫细胞培养时多采用的是磷酸盐缓冲系统，不同于哺乳动物细胞的碳酸盐缓冲体系，其培养过程中无需添加co2来调节缓冲体系的ph，然而，目的蛋白的表达量比较低。本发明创造性的发现在昆虫细胞培养时，无论是在瞬时转染还是在稳定细胞池的蛋白表达生产过程中，在培养箱中添加co2或通过转染后将透气盖子换成密封盖以通过昆虫细胞自身呼吸作用增加瓶中co2浓度的方法都可以提高蛋白的表达量，并且提升效果显著。并且通过进一步研究发现，co2浓度对蛋白的表达量也是有一定影响的，co2浓度太低对蛋白表达量的提升帮助不大，但浓度过高也会影响蛋白的表达，因此，本发明选用浓度为2％-10％co2培养环境，或者在培养开始后就用密封盖密封，一段时间后再打开或换用透气盖子，以保证培养环境中的co2的浓度满足最大化促进蛋白表达的要求。本发明的在昆虫细胞培养过程中在培养箱中添加co2或将培养瓶盖子换成密封盖简单易行，成本低，是可以广泛使用的并可显著提高昆虫细胞蛋白表达量的方法。附图说明图1为本发明一实施方式的工艺流程图。图2为在sf9的瞬时转染中，与对照组转染后在不含co2培养箱中培养相比，转染后在5％co2培养箱中培养的egfp阳性细胞比例在转染后1-5天都更高。图3为在sf9的瞬时转染中，与对照组转染后在不含co2培养箱中培养相比，转染后在5％co2培养箱中培养的sf9细胞tnfr-fc蛋白的单位产量在转染后1-5天都更高。图4为在s2细胞瞬时转染中，在培养箱不添加co2的情况下，转染后用密封盖封住培养瓶可通过细胞自身的呼吸作用在培养瓶中积累更多co2，在转染后培养箱不添加co2的情况下，与对照组转染后使用透气盖子相比，转染后分别封闭盖子至24h、48h、72h后再换成透气盖子，s2细胞的蛋白1单位产量都更高，其中封闭盖子至48h的最高。图5为在s2细胞稳定细胞池的培养过程中，与对照组在不含co2培养箱中培养相比，在5％co2培养箱中培养和封闭盖子培养s2细胞在第1天、3天、5天的蛋白1单位产量都更高，其中在第5天在5％co2培养箱中培养的蛋白1单位产量显著高于对照组和用密封盖密封培养组。图6为在s2细胞稳定细胞池的培养过程中，与对照组在不含co2培养箱中培养相比，在5％co2培养箱中培养和用密封盖密封培养s2细胞在第1天、3天、5天的蛋白2单位产量都更高。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。如图1所示，一实施方式的提高昆虫细胞瞬时转染和稳定表达蛋白表达量的方法，包括如下步骤：配制转染试剂溶液：将线性聚乙烯亚胺溶于ph3-10的无菌水中，配制成浓度为0.1-10g/ml的转染试剂溶液；配制转染复合物：按照线性聚乙烯亚胺与待转染的含目的dna的质粒的质量比为1-20:1的比例将转染试剂溶液与待转染的含目的dna的质粒溶液加入无菌水中，震荡混匀，形成转染复合物；瞬时转染：将转染复合物加入已传代培养的果蝇s2细胞或草地贪夜蛾sf9细胞的细胞悬液中，摇晃培养，得到已转染含目的dna的质粒的昆虫细胞，将昆虫细胞于16-40℃、120-300rpm、2％-10％co2培养箱中摇晃培养，或者于16-40℃、120-300rpm培养箱中以密封盖封住密封培养；稳定细胞池蛋白表达：以瞬时转染构建的昆虫细胞构建稳定细胞池，以1-8×106个昆虫细胞/ml的密度接种后，于16-40℃、120-300rpm、2％-10％co2培养箱中摇晃培养，或者于16-40℃、120-300rpm培养箱中以密封盖封住密封培养。在其中一个实施方式中，线性聚乙烯亚胺的分子量范围为2.5-40kd，优选25kd。在其中一个实施方式中，在配制转染试剂溶液过程中，无菌水的ph为5.0-7.0，优选ph为6.1。在其中一个实施方式中，在配制转染试剂溶液过程中，配制的转染试剂溶液中线性聚乙烯亚胺的浓度为0.1-2g/ml，优选1g/ml。在其中一个实施方式中，在配制转染复合物过程中，对于果蝇s2细胞是按照线性聚乙烯亚胺与待转染的含目的dna的质粒的质量比为2:1的比例配制；对于草地贪夜蛾sf9细胞是按照线性聚乙烯亚胺与待转染的含目的dna的质粒的质量比为3:1的比例配制。在其中一个实施方式中，在瞬时转染过程中，将转染复合物加入已传代培养的果蝇s2细胞或草地贪夜蛾sf9细胞的细胞悬液中是按照每106个细胞转染0.1-3μg含目的dna的质粒的比例添加。在其中一个实施方式中，在瞬时转染过程中，对于果蝇s2细胞是按照每106个果蝇s2细胞转染0.6μg含目的dna的质粒的比例添加，并于28℃、180rpm、5％co2培养箱中摇晃培养，或者于28℃、180rpm培养箱中以密封盖封住密封培养，并在12-72小时，优选48小时后更换为透气盖子；对于草地贪夜蛾sf9细胞是按照每106个草地贪夜蛾sf9细胞转染1.5μg含目的dna的质粒的比例添加，并于28℃、180rpm、5％co2培养箱中摇晃培养，或者于28℃、180rpm培养箱中以密封盖封住密封培养，并在12-72小时，优选48小时后更换为透气盖子。在其中一个实施方式中，在果蝇s2细胞或草地贪夜蛾sf9细胞传代培养时，传代细胞的密度为0.1-2×106个细胞/ml，优选1×106个细胞/ml。在其中一个实施方式中，在瞬时转染过程中，当传代培养的细胞密度达到2-50×106个细胞/ml时，进行瞬时转染，优选是达到5×106个细胞/ml时，进行瞬时转染。在其中一个实施方式中，在稳定细胞池蛋白表达过程中，以4×106个昆虫细胞/ml的密度接种，于28℃、180rpm、5％co2培养箱中摇晃培养，或者于28℃、180rpm培养箱中以密封盖封住密封培养，并在12-72小时，优选48小时后更换为透气盖子。传统的在昆虫细胞培养时多采用的是磷酸盐缓冲系统，其培养过程中无需添加co2，目的蛋白的表达量比较低。本发明创造性的发现在昆虫细胞培养时，无论是在瞬时转染还是在稳定细胞池的蛋白表达生产过程中，在培养箱中添加co2或通过转染后将透气盖子换成密封盖以通过昆虫细胞自身呼吸作用增加瓶中co2浓度的方法都可以提高蛋白的表达量，并且提升效果显著。在昆虫细胞培养过程中在培养箱中添加co2或将培养瓶盖子换成密封盖简单易行，成本低，是可以广泛使用的并可显著提高昆虫细胞蛋白表达量的方法。以下结合具体实施例对提高昆虫细胞瞬时转染和稳定表达蛋白表达量的方法作进一步详细的说明。以下实施例所用的浓度等数值均为优选的数值，可理解，在其他实施例中，不限于此，如可以以前面所述的数据范围中的任意数据。1.果蝇s2细胞来源及传代果蝇s2细胞从tcmetrix公司(epalinges，瑞士)获得，来自果蝇的drosophilaschneider2细胞系，并在sf900iisfm培养基中(lifetechnologies公司，巴塞尔，瑞士)进行悬浮培养。细胞在tubespin生物反应器50(ts50)或在tubespin生物反应器600(ts600)(tpp，trasadingen，瑞士)中培养，其各自培养基的量分别为5-10ml或300ml。细胞每周传代2次，传代细胞密度为1×106个细胞/ml。所有培养物在isf1-x振荡培养器(kühnerag，birsfelden，瑞士)中保持在28℃温度下，摇晃速度为180rpm，摇动直径5cm。细胞密度和活性通过台盼蓝排除法使用血细胞计数器测定。2.草地贪夜蛾细胞sf9的来源及传代sf9细胞购买至invitrogen公司(巴塞尔，瑞士)，并在sf900iisfm培养基中(lifetechnologies公司，巴塞尔，瑞士)进行悬浮培养。细胞在tubespin生物反应器50(ts50)或在tubespin生物反应器600(ts600)(tpp，trasadingen，瑞士)中培养，其各自培养基的量分别为5-10ml或300ml。细胞每周传代2次，传代细胞密度为1×106个细胞/ml。所有培养物在isf1-x振荡培养器(kühnerag，birsfelden，瑞士)中保持在28℃温度下，摇晃速度为180rpm，摇动直径5cm。细胞密度和活性通过台盼蓝排除法使用血细胞计数器测定。3.瞬时转染配置转染试剂溶液：将分子量为25kd的线性聚乙烯亚胺(polyscienceseuropegmbh,eppelheim，germany)溶于ph6.1的无菌水中，配置成浓度为1mg/ml的转染试剂溶液。在转染两天前将细胞离心后按照1×106个细胞/ml的密度传代，当细胞密度达到5×106个细胞/ml时转染。果蝇s2细胞按照每106个细胞转染质量为0.6μg含目的dna的质粒比例准备质粒，将聚乙烯亚胺与含目的dna的质粒按照质量比为2:1的比例加入无菌水中震荡混匀，以形成转染复合物。草地贪夜蛾sf9细胞按照每106个细胞转染质量为1.5μg含目的dna的质粒比例准备质粒，将聚乙烯亚胺与含目的dna的质粒按照质量比为3:1的比例加入无菌水中震荡混匀，以形成转染复合物。对于小规模转染，将细胞离心并重悬于含培养基的ts50管中，将转染复合物加入培养基中。对于300ml的转染，将细胞离心并重悬于含培养基的ts600管中，将转染复合物加入培养基中。将转染复合物加入已传代培养的昆虫细胞s2或sf9细胞悬液中，得到已转染含目的dna的质粒的细胞，于28℃、180rpm，5％co2培养箱中摇晃培养，或于转染后在28℃、180rpm，无co2培养箱中培养但将瓶盖换成不透气密封盖以增加瓶中co2含量，48h后换回透气盖子。4.稳定细胞池生产稳定细胞池的构建方法可参考现有技术文献(matascim,baldil,hackerdl,wurmfm.2011a.thepiggybactransposonenhancesthefrequencyofchostablecelllinegenerationandyieldsrecombinantlineswithsuperiorproductivityandstability.biotechnolbioeng108(9):2141-50)。构建好的s2或sf9细胞稳定细胞池以1-8×106个细胞/ml的密度接种后，，于28℃、180rpm，5％co2培养箱中摇晃培养，或于转染后在28℃、180rpm，无co2培养箱中培养但将瓶盖换成不透气密封盖以增加瓶中co2含量，48h后换回透气盖子。5.蛋白质定量含目的dna的质粒包括导入有egfp(绿色荧光蛋白)基因、tnfr-fc基因、蛋白1基因和蛋白2基因的质粒，从而表达出egfp、tnfr-fc、蛋白1和蛋白2的蛋白。piex-xegfp、piex-tnfr-fc、piex-protein1和piex-protein2分别携带egfp基因、人tnfr-fc基因、蛋白1基因和蛋白2基因，并且受autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus(acmnpv)同源区5(hr5)增强子以及极早期基因1(ie1)启动子的控制，质粒的构建参考申请号为cn201510708368.8的中国专利申请。egfp阳性细胞的百分比通过guavaeasycyte流式细胞仪(guavatechnologies,hayward,美国)测定。激发光和发射光分别为488nm和532nm。tnfr-fc、蛋白1和蛋白2的浓度通过elisa方法确定。分别使用羊抗人fcγ抗体、蛋白1鼠源抗体和蛋白2鼠源抗体进行包被，并通过碱性磷酸酶共聚羊抗人iggγ链来检测tnf-fc，碱性磷酸酶羊抗鼠抗体来检测蛋白1和蛋白2。加入底物后，在405nm和490nm下用读板器检测吸收值。6.实验结果如图2-图6所示，图2sf9的瞬时转染中，与对照组转染后在不含co2培养箱中培养相比，转染后在5％co2培养箱中培养的egfp阳性细胞比例在转染后1-5天都更高。图3在sf9的瞬时转染中，与对照组转染后在不含co2培养箱中培养相比，转染后在5％co2培养箱中培养的sf9细胞tnfr-fc蛋白的单位产量在转染后1-5天都更高。图4在s2细胞瞬时转染中，在培养箱不添加co2的情况下，转染后用密封盖封住培养瓶可通过细胞自身的呼吸作用在培养瓶中积累更多co2，在转染后培养箱不添加co2的情况下，与对照组转染后使用透气盖子相比，转染后分别封闭盖子至24h、48h、72h后再换成透气盖子，s2细胞的蛋白1单位产量都更高，其中封闭盖子至48h的最高。图5在s2细胞稳定细胞池的培养过程中，与对照组在不含co2培养箱中培养相比，在5％co2培养箱中培养和封闭盖子培养s2细胞在第1天、3天、5天的蛋白1单位产量都更高，其中在第5天在5％co2培养箱中培养的蛋白1单位产量显著高于对照组和用密封盖密封培养组。图6在s2细胞稳定细胞池的培养过程中，与对照组在不含co2培养箱中培养相比，在5％co2培养箱中培养和用密封盖密封培养s2细胞在第1天、3天、5天的蛋白2单位产量都更高。本实施例研究发现在昆虫细胞的瞬时转染和稳定细胞池生产中，通过在培养箱中添加co2或通过封闭盖子增加培养瓶中co2浓度的方法来提高蛋白产量，此操作方法简单易行且效果显著，可应用于昆虫细胞瞬时转染和稳定细胞池的蛋白生产中。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12当前第1页12