专利名称：昆虫抗菌肽dsp融合蛋白及其在植物抗病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及昆虫抗菌肽DSP融合蛋白及其在植物抗病中的应用。
背景技术：
转基因植物是采用基因工程的手段将外源基因导入植物细胞基因组中，使新的基因在植物体内表达，能够稳定遗传，同时使植物增强抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等性状。转基因植物技术及其产品是当今世界农业生物技术研究与产业化开发的重点和热点，也是我国农业科技革命的核心内容之一，对我国农业科技手段的更新换代以及农业产业结构的调整具有重要的战略意义。由植物病害所造成农作物产量的损失全世界每年高达300-500亿美元。传统育种对抗病品种选育做出了最为重要的贡献，但由于植物本身抗病基因有限和单个抗病基因所介导的抗病性具有高度专化性，抗病谱比较窄，只能抗有限的小种，以致病原菌群体发生变化时，就面临抗性丧失的风险，从而无法满足农作物病害防治的需要。抗病转基因植物研究具有广阔前景，人类为寻找新抗病基因正在不懈努力，抗病谱宽、抗病性强、不易产生耐受性的转基因植物将为获得新的抗病品种提供了更为强大的手段。抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在 2000 7000左右，由20 60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。植物本身可产生多种抗菌肽，但研究发现植物来源的抗菌肽基因的表达只对病原菌产生中等程度抗性，这是由于经过长期的病原与寄主的相互作用和进化，植物病原菌已经对这些植物抗菌肽产生了耐受性。因此，非植物来源的抗菌肽基因在植物抗病中的应用越来越受到重视。昆虫抗菌肽昆虫免疫的效应物，对细菌、真菌、病毒等表现广谱抗性，抗菌性强、抗菌效果快。据aiai-Matsuzaki-Huanf模型，多数抗菌肽的作用机制都是基于多肽与磷脂互作导致细胞膜破裂而引起细胞损伤。由于抗菌肽作用于磷脂类而非酶类，因此，很少有病原对抗菌肽产生抗性，这些特点正是理想的外源抗病基因所需要具有的。因此，昆虫抗菌肽在植物抗病基因工程方面的应用具有强大的潜力。目前已发现昆虫抗菌肽可以抑制许多农业生产中非常重要的植物病原真菌和细菌，如白粉病菌、稻瘟病菌、灰葡萄孢等真菌和丁香假单孢菌、胡萝卜软腐欧氏杆菌、水稻白叶枯病菌等细菌。通过转基因技术将抗菌肽导入植物中表达，可使作物对植物病原细菌和真菌产生有效抗性、烟草、水稻、辣椒、番茄等植物中成功表达并获得抗病株系的报道。然而，目前在植物转基因中应用的主要是天蚕素基因，而其他绝大多数抗菌肽在转基因植物中的抗病功能还没有测试。Diapause-specific peptide (DSP)产生于蓼蓝齿胫叶甲(Gastrophysa atrocyanea)，含有41个氨基酸残基，其中有6个Cys，具有抗真菌活性(Hiromasa Tanaka, et al. , 2003 ；Hiromasa Tanaka and Koichi Suzuki, 2005 ；Takahide Kouno,M. Μ. et al., 2007)。其氨基酸序列为 AVRIGPCDQVCPRIVPERHECCRAHGRSGYAYCSGGGMYCN。关于 DSP 的研究在医学领域较多，在植物抗病方面尚无报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种昆虫抗菌肽DSP融合蛋白。本发明所提供的融合蛋白，名称为ChtSP-DSP，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；幻将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的另一个目的是提供所述融合蛋白的编码基因。本发明所提供的所述融合蛋白的编码基因(命名为ChtSP-DSP)，为如下1)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1 ；2)在严格条件下与1)的基因杂交且编码所述融合蛋白的基因；3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码所述融合蛋白的基因。上述严格条件可为用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列1由183个碱基组成，自5’端第1位_60位为水稻几丁质酶Cht-I 的信号肽的编码序列，第61位-183位为昆虫抗菌肽DSP的编码序列。含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体为在PGWBll载体的attR位点插入了所述编码基因得到的重组表达载体。本发明的又一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将所述编码基因转入目的植物中，得到与所述目的植物相比，抗病菌能力提高的转基因植物。所述编码基因是通过权所述重组表达载体导入目的植物中的。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。所述病菌为拟南芥白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)、灰霉菌(bootrytis cinerea)禾口 / 或卵菌(Hyaloperonospora arabidopsidis)。将水稻几丁质酶Cht-I的信号肽连接到DSP的N端，并对这一融合结构进行密码子优化，使其有利于在植物中高表达，再将其构建到Gateway载体系列的pGWBll (C端连FLAG标签)中。抗病性检测的结果显示，DSP转基因拟南芥对白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)、灰霄菌(Botrytis cinerea)禾口卵菌(Hyaloperonospora arabidopsidis) 等真菌具有明显的抗性。证明DSP在控制植物真菌病害方面效果明显，具有一定的应用价值。本发明采用转基因技术将序列表中序列1所示的融合基因转入植物提高植物的抗病性，这是传统育种技术所无法做到的。本发明利用植物源外的基因来提高植物的抗病性，为植物病害控制提供了一条新途径，若将其融入到作物育种程序将有广阔的前景。
图1为ChtSP-DSP融合基因在转基因拟南芥中的表达分析结果；其中，图1中A为重组载体pGWBll =ChtSP-DSP的部分结构示意图；图1中B为对转基因拟南芥植株Tl的15 个株系用PCR检测DSP基因整合到基因组上的结果；图1中C为对转基因拟南芥植株T2的 6个株系用real-time PCR检测DSP基因转录水平的结果；图1中D为选择转录水平较高的6个株系用western blot技术检测ChtSP-DSP-FLAG的表达结果。图2为ChtSP-DSP转基因拟南芥对白粉菌抗性的检测结果；其中，图2中A为接种后12天转基因拟南芥line Kline 2和line3和野生型Col-O感染白粉菌的表型结果；图 2中B为接种后6天拟南芥叶片上的单孢产生的分生孢子，红色箭头所指为原始单孢子；图 2中C为拟南芥叶片上单孢所产生的孢子数统计分析结果。图3为ChtSP-DSP转基因拟南芥对灰霉菌的抗性检测结果；其中，图3中A为转基因拟南芥Iinel、line2、line3、line4和linel3以及野生型对照Col-O的表型，图3中B为转基因拟南芥linel、line2、line3、line4和linel3以及野生型对照Col-O的病斑面积的统计分析结果。图4为ChtSP-DSP转基因拟南芥对卵菌的抗性检测结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例一、转基因拟南芥的获得及其检测一、ChtSP-DSP融合基因在转基因拟南芥中的表达分析1、遗传转化载体的构建采用的农杆菌转化载体为gateway系列中的pGWBll载体(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是=Nakagawa, T.，Kurose, T.，Hino, T.，Tanaka, K.，Kawamukai，M.，Niwa, Y.，Toyooka, K.，Matsuoka, K.，Jinbo, T. and Kimura，Τ. (2007)Development of series of gateway binary vectors, pGWBs, for realizing efficient construction of fusion genes for plant transformation. J.Biosci.Bioeng. 104，34-41.)，该载体携带能够组成型表达的花椰菜花叶病毒启动子(CaM35Spr0m0ter)，能够组成型表达目标基因。转化所用农杆菌为GV3101菌株(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是Van Larebeke N, Engler G, Holsters Μ, Van den Elsacker S, Zaenen I, Schilperoort RA, Schell J(1974)Large plasmid in Agrobacterium tumefaciens essential for crown gall-inducing ability. Nature 252:169-170·)。先>1 各经过密码子在线软件 http://www. icat. de/禾口 http//miracle. iRib. res, in/dynavac/优化过的ChtSP-DSP基因融合序列送到genescript公司合成，此序列被连接到PUC57载体(购自南京金斯瑞生物科技有限公司，产品目录号为SD1176)上。以 PUC57 -ChtSP-DSP为模板，用以下引物进行PCR扩增，上游引物5’ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTGCTCTAGAGCCACCATGAGAGCTTTG-3’ 和下游引物
5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCGGCTGTACAAGAAAGCTGGGTCATTAG-3，，扩增产物在华大基因公司进行测序。测序结果表明，获得的融合基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，编码具有序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的融合蛋白，序列表中序列 2由61个氨基酸残基组成。序列表中序列1自5’端第1位-60位为水稻几丁质酶Cht-I 的信号肽的编码序列，第61位-183位为昆虫抗菌肽diapause-specific peptide (DSP)的编码序列。将该融合基因命名为ChtSP-DSP，将其编码的融合蛋白命名为ChtSP-DSP。将测序正确的PCR产物与pD0NR207载体(购自Invitrogen，产品目录号为I22I3Ol3)以及Gateway BP Clonase酶混合物(购自Invitrogen，产品目录号为 11789-021)于25°C共同孵育，得到重组载体pD0NR207 =ChtSP-Thanatin(S)0将该重组载体转化感受态大肠杆菌DHlOB (购自北京百泰克生物技术有限公司，产品目录号为DP77)， 卡纳霉素平板筛选获得阳性克隆，扩繁，提取质粒。再将PD0NR207 =ChtSP-DSP, pGWBll和 Gateway LR Clonase酶混合物(购自hvitrogen，产品目录号为11791-043)于25°C共同孵育，获得重组表达载体pGWBll :ChtSP-DSP。将该重组表达载体转化大肠杆菌DHlOB (购自北京百泰克生物技术有限公司，产品目录号为DP77)，潮霉素平板筛选阳性克隆，扩繁，提取质粒并送华大基因公司测序。测序结果表明，在PGWBll载体的attR位点插入了序列表中序列1所示的编码基因，证明重组质粒构建正确(图1中A)。将pGWBll =ChtSP-DSP导入转化农杆菌GV3101感受态，潮霉素平板筛选并通过菌落PCR反应鉴定(引物同上文所述)阳性克隆，扩繁，用于转化野生型拟南芥Col-0。2、遗传转化和Tl代转化植株的分析采用花序浸泡法将GV3101携带的pGWBl 1 =ChtSP-DSP转化拟南芥生态型 Col-O (购自美国俄亥俄州立大学的生物资源中心(ABRC)，产品目录号为CS39005)。花序浸泡法具体步骤为将花序在0D600 = 0. 6 0. 8的农杆菌悬液(0. 5%蔗糖， 0.02 0.05% Sliwet L-77)中浸泡30秒左右，转化后的植株用黑色塑料袋避光保湿放置 16-24小时，然后在9小时光照/15小时黑暗、温度为22°C的植物生长间进行培养，直到种子成熟。收获的种子播种于含潮霉素的平板上，筛选获得阳性转化株。同时，用上述方法得到转空载体pGWBll对照拟南芥植株。设未转化的拟南芥 Col-O为野生型对照拟南芥植株。对pGWBll :ChtSP_DSP转化获得的拟南芥植株Tl代的15个株系(Linel-15)的基因组DNA进行DSP的PCR检测。PCR检测所用的引物序列为5’ -GCTGTTAGAATTGGAC-3’和 5， -ATTACAATACATTCCTC-3，。结果被检测的PGWBll :ChtSP_DSP独立转化植株中除了株系Il(Lll)外，其余14 个株系均能扩增出目的条带；野生型对照拟南芥植株Col-O未扩增出目的条带(图1中B)。为了解DSP在转基因拟南芥中是否转录表达，对pGWBll :ChtSP_DSP独立转化植株 T2中的6个株系进行了 Real-time PCR检测，所用的引物序列为5’-GCTGTTAGAATTGGAC_3’ 禾口 5，-ATTACAATACATTCCTC-3，。结果表明目的基因在所检测转基因植物中均能转录表达，而在野生型对照拟南芥植株Col-O中不能转录表达(图1中C)。为了进一步研究ChtSP-DSP融合蛋白在转基因拟南芥中的翻译表达情况，对转录水平较高的株系1 (Li)、株系2 (L2)、株系3 (L3)、株系4 (L4)、株系5 (L5)和株系13 (L13)进行了 western blot检测，抗体为鼠抗FLAG抗体(购自sigma公司，目录号为F1804)。结果显示，ChtSP-DSP融合蛋白在转基因拟南芥Li、L2、L3、L4、L5和L13中均能翻译表达，而在野生型对照拟南芥植株Col-O中不能翻译表达(图1中D)。二、ChtSP-DSP转基因拟南芥对白粉菌的抗性分析对ChtSP-DSP融合蛋白在转基因拟南芥中翻译表达较高的株系I(Ll)、株系 2(L2)和株系3(L3)接种拟南芥白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是=Yiping Wang，Marc Τ. Nishimura, Ting Zhao, Dingzhong Tang. 2011. ATG2, an autophagy-related protein, negatively affects powdery mildew resistance and mildew-induced cell death in Arabidopsis. The Plant Journal，68，10 :74-87)。接种方法为用吹风机将白粉菌孢子吹进高1米左右的密闭容器内，静置1小时以上，孢子可以均勻散落于密闭容器内的拟南芥叶片上。接种后6天取叶片用trypan blue染色(图2中B，红色箭头所指的是原始单孢子)，在显微镜下观察单孢所产生的孢子数，计数并进行统计分析，结果见图2中C，表明 ChtSP-DSP转基因拟南芥linel、line 2和line3与野生型Col-O相比对白粉菌具有显著的抗性。接种后12天，拍摄Col-OUinelUine 2和line3感染白粉菌的表型照片，见图2 中A，从图中可见，ChtSP-DSP转基因拟南芥IinelUine 2和line3较野生型对照Col-O具有明显的抗性。转空载体对照植株与野生型对照植株的表型一致。三、ChtSP-DSP转基因拟南芥对灰霉菌的抗性分析对ChtSP-DSP融合蛋白在转基因拟南芥中翻译表达较高的株系I(Iinel)、株系 2(line2)、株系 3(line3)、株系 4(line 4)和株系 13(linel3)接种灰霉菌(Botrytis cinerea)。(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是:Yiping Wang, Marc Τ. Nishimura, Ting Zhao, Dingzhong Tang. 2011. ATG2, an autophagy-related protein, negatively affects powdery mildew resistance and mildew-induced cell death in Arabidopsis. The Plant Journal,68, (10) :74-87)。接种方法为取叶片平铺于0. 8%琼脂平板上，将浓度为5X 105spores/ml的灰霉菌孢子悬浮液10 μ L滴至叶片中央。22°C保湿3天后观察表型，拍照并测量病斑直径和进行统计分析。 结果见图3，图3中A为转基因拟南芥Iinel、line2、line3、line4和linel3以及野生型对照Col-O的叶片病斑表型，图3中B为转基因拟南芥Iinel、line2、line3、line4和linel3 以及野生型对照Col-O的病斑面积的统计分析结果。结果表明DSP转基因拟南芥的5个株系linel、line2、line3、line4和linel3较野生型对照Col-O对灰霉菌具有显著的抗性。 转空载体对照植株与野生型对照植株的表型一致。四、ChtSP-DSP转基因拟南芥对卵菌的抗性分析对转基因拟南芥的株系I(Iinel)、株系2 (line2)和株系3(line3)接种卵菌菌株Noco2 (Hyaloperonospora arabidopsidis Noco2)(公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是=Adnane Nemri, Susanna Atwel 1, Aaron Μ. Tarone,Yu S. Huang,Keyan Zhao,David J. Studholme,Magnus Nordborg,and Jonathan D. G. Jones. 2010. Genome-wide survey of Arabidopsis natural variation in downy mildew resistance using combined association and linkage mapping. PNAS,107(22) 10302-10307.)。接种方法为将Noco2的孢子用灭菌水配制成浓度为5 X IO5孢子/ml的悬液，喷雾至2周大小的植株叶片上，于18°C、95%湿度、12小时光照/12小时黑暗的培养箱中培养，7天后取叶片，称重，用水将孢子洗下，显微镜下采用血球计数板计数，计算每克叶片的孢子数，并进行统计分析。结果如图4所示，从图中可见，ChtSP-DSP转基因拟南芥的3个株系linel、line2和line3与野生型对照Col-O相比，对卵菌Noco2具有显著的抗性。转空载体对照植株与野生型对照植株的表型一致。
权利要求
1.一种融合蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；2)在严格条件下与1)的基因杂交且编码权利要求1所述融合蛋白的基因；3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述融合蛋白的基因。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在pGWBll 载体的attR位点插入了权利要求2或3所述编码基因得到的重组表达载体。
6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入目的植物中， 得到与所述目的植物相比，抗病菌能力提高的转基因植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入目的植物中的。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述病菌为拟南芥白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)、灰毒菌(Botrytis cinerea)禾口 / 或卵菌 (Hyaloperonospora arabidopsidis)。
全文摘要
本发明公开了昆虫抗菌肽DSP融合蛋白及其在植物抗病中的应用。本发明所提供的昆虫抗菌肽DSP融合蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的由1)衍生的蛋白质。抗病性检测的结果显示，DSP转基因拟南芥对白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)、灰霉菌(Botrytis cinerea)和卵菌(Hyaloperonospora arabidopsidis)等真菌具有明显的抗性。证明DSP在控制植物真菌病害方面效果明显，具有一定的应用价值。
文档编号C12N1/21GK102372782SQ201110344468
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者吴廷全, 唐定中, 姚爱玉, 张永清, 陈伟达, 陈永芳 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所