专利名称：中华按蚊抗药性pcr-rflp检测试剂盒及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种中华按蚊抗药性PCR-RFLP检测试剂盒及其专用引物。
背景技术：
中华按蚊(Anopheles sinensis)分布于我国除青海和新疆以外的所有省市，是我国平原水网和水稻种植地区的优势蚊种，家野两栖，白天多栖息在村庄四周的作物植棵和芦苇丛、灌木丛中，部分栖息在牛房畜舍，偏嗜畜血(以牛、马、猪等大牲畜为主)，兼吸人血，以成蚊越冬。中华按蚊是我国疟疾的重要传播媒介，尤其在北纬34°以北的地区，它是主要的或唯一的传播媒介。目前，疟疾尚无有效疫苗可用，控制疟疾媒介的种群数量是防治疟疾的重要手段。化学防治因其易操作，能够迅速、有效地控制害虫种群，在媒介昆虫防制规划中占有重要地位。过去几十年来，针对中华按蚊的生活习性，用拟除虫菊酯类杀虫剂， 采用滞留喷洒和浸泡蚊帐等灭蚊防疟措施，取得了显著效果。然而，化学防治在充分发挥其优势的同时，也带来了负面效果，导致了中华按蚊抗药性的产生。九十年代以来，国内各地报道的中华按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性越来越明显。1993年重庆中华按蚊对溴氰菊酯和DDT达到初级抗性，1998年在云南采集的10个中华按蚊种群有5个对DDT产生抗性，1999年浙江温州、宁波等地的中华按蚊种群达到高抗种群(R/S = 15-20)，2009年，江苏部分地区的中华按蚊对溴氰菊酯产生了高度抗性。害虫对杀虫剂产生抗性以后，化学防治的效果就会随着抗药性的升高而下降，害虫的防治也会受到严重的影响。为了应对害虫种群的抗性，为了克服抗性达到预期的防治效果，杀虫剂的使用量，包括单位面积的施药量和施药次数，就不得不持续增加，这无异于在持续增加杀虫剂对媒介昆虫抗性的选择压力，而且这种抗药性还可向远距离扩散，间接地还可能造成某些媒介疾病的发生与流行。从这些年对害虫抗药性的监测来看，抗药性增长的速度远大于新农药、新剂型研发的速度。因此，如何加强媒介昆虫的抗药性治理、延缓抗药性的产生和发展、延长现有杀虫剂的使用寿命是害虫治理中的重要内容。昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性主要是击倒抗性(knockdown resistance, kdr), kdr基因在中华按蚊对拟除虫菊酯的抗性中具有重要作用。拟除虫菊酯的作用靶标主要是昆虫电压依赖性神经细胞膜上的钠离子通道，离子通道上的作用靶点对杀虫剂降低了敏感性而产生击倒抗性，因此击倒抗性不同于代谢抗性，不能被酯酶或多功能氧化酶的抑制剂所降低。通过比较敏感、抗性中华按蚊的部分钠通道序列，发现para型钠通道基因 (para基因是指整个钠通道基因，而KDR基因是指含有kdr位点的，即含有抗性位点的一段序列均为kdr基因)的L1014F (亮氨酸到苯丙氨酸)即TTG — TTT的突变及L1014C (亮氨酸到半胱氨酸)即TTG-TGT的突变和击倒抗性相关。这是我国关于中华按蚊击倒抗性及其基因突变的首次报道。kdr基因可以作为昆虫对拟除虫菊酯产生抗性的一个分子标记，通过监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态。谭伟龙等0011)用特异性等位基因PCR方法，对采江苏、安徽的11个中华按蚊种群进行致死中浓度(LC50)和kdr基因频率的测定，并且发现LC5tl为代表的高效氯氰菊酯抗性与中华按蚊kdr等位基因频率之间存在正相关关系。研究说明Kdr基因可以作为中华按蚊对拟除虫菊酯产生抗性的一个分子标记，通过监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态，可以预测抗性的发生和发展。目前我国还没有成型的针对中华按蚊的kdr抗性分子检测方法和试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的专用引物。本发明提供的专用引物，由引物组A和引物组B组成所述引物组A由引物1和引物2组成，所述引物1和引物2的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2 ；所述引物组B由引物3和引物4组成，所述引物3和引物4的核苷酸序列分别为序列表中序列3和序列表中序列4。所述引物组A和所述引物组B为独立包装；所述突变位点为L1014F或L1014C。本发明的第二个目的是提供一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的试剂。本发明提供的试剂，由试剂A和试剂B组成，所述试剂A由所述的专用引物中的引物组A和Hind III组成；所述试剂B由所述的专用引物中的引物组B和Hph I组成。所述试剂A和所述试剂B均为独立包装；所述引物组A、所述Hind III、所述引物组B和所述Hph I均为独立包装。本发明的第三个目的是提供一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的PCR试剂。本发明提供的PCR试剂，由PCR试剂1和PCR试剂2组成，所述PCR试剂1由所述的专用引物中的引物组A、dNTP、DNA聚合酶、Mg2+及PCR缓冲液组成；所述PCR试剂2由所述的专用引物中的引物组B、dNTP、DNA聚合酶、Mg2+及PCR缓冲液组成；所述引物组A中的各引物在所述PCR试剂1中的浓度均为0. 67pmol/y 1,所述引物组B中的各引物在所述PCR试剂2中的浓度均为0. 67pmol/y 1,所述突变位点为L1014F或L1014C。本发明的第四个目的是提供一种制备检测中华按蚊中kdr基因突变位点的试剂
品.ο本发明提供的试剂盒，为如下1)或2)1)所示的试剂盒包括所述的试剂；2)所示的试剂盒包括所述PCR试剂。所述突变位点为L1014F或L1014C。所述专用引物或所述试剂或所述PCR试剂或所述试剂盒在检测中华按蚊中kdr基因突变位点、检测中华按蚊抗药性或制备检测中华按蚊抗药性产品中的应用也是本发明保护的范围；所述突变位点具体为L1014F或L1014C，所述抗药性为抗菊酯类药物；所述菊酯类药物具体为溴氰菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测中华按蚊中kdr基因的突变位点的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤1)用所述专用引物或所述试剂或所述PCR试剂或所述试剂盒中的所述引物组A和所述引物组B分别对待测中华按蚊进行PCR扩增，分别得到A扩增产物和B扩增产物；2)分别用Hind III酶切步骤1)得到的所述A扩增产物和用Hph I酶切步骤1)得到的所述B扩增产物，分别得到酶切产物A和酶切产物B ； 检测所述酶切产物A和所述酶切产物B，若所述酶切产物A得到IMbp和42bp产物，且所述酶切产物B得到123bp和32bp 产物，则所述kdr基因不含或候选不含有所述突变位点；若所述酶切产物A得到196bp产物，且所述酶切产物B得到155bp产物，则所述 kdr基因的突变位点为或候选为L1014C ；若所述酶切产物A得到IMbp和42bp产物，且所述酶切产物B得到155bp产物， 则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014F ；若所述酶切产物A得到196bp、154bp和42bp产物，且所述酶切产物B得到15^ρ、 123bp和32bp产物，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014C ；若所述酶切产物A得到IMbp和42bp产物，且所述酶切产物B得到15^p、12!3bp 和32bp产物，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014F ；若所述酶切产物A得到196bp、154bp和42bp产物，且所述酶切产物B得到155bp 产物，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014F和L1014C。本发明的第六个目的是提供一种检测或辅助检测中华按蚊中kdr基因的基因型的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)用所述专用引物或所述试剂或所述PCR试剂或所述试剂盒中的所述引物组A和所述引物组B分别对待测中华按蚊进行PCR扩增，分别得到A扩增产物和B扩增产物；2)分别用Hind III酶切步骤1)得到的所述A扩增产物和用Hph I酶切步骤1)得到的所述B扩增产物，分别得到酶切产物A和酶切产物B ；检测酶切产物A和酶切产物B，若所述酶切产物A得到IMbp和42bp产物，且所述酶切产物B得到123bp和32bp 产物，则所述kdr基因为不含或候选不含有所述突变位点的纯合型基因；若所述酶切产物A得到196bp产物，且所述酶切产物B得到155bp产物，则所述 kdr基因为或候选为含有突变位点L1014C的纯合型基因；若所述酶切产物A得到IMbp和42bp产物，且所述酶切产物B得到155bp产物， 则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F的纯合型基因；若所述酶切产物A得到196bp、154bp和42bp产物，且所述酶切产物B得到15^ρ、 123bp和32bp产物，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014C的杂合型基因；若所述酶切产物A得到IMbp和42bp产物，且所述酶切产物B得到15^p、12!3bp 和32bp产物，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F的杂合型基因；若所述酶切产物A得到196bp、154bp和42bp产物，且所述酶切产物B得到155bp 产物，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F和L1014C的杂合型基因。所述PCR扩增中，以待测中华按蚊的基因组DNA为模板；
所述PCR扩增的退火温度为60°C -65°C，退火温度具体为65°C ；所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。本发明的实验证明，本发明提供的了一种快捷、简便、灵敏的中华按蚊kdr突变等位基因检测试剂盒，用来掌握中华按蚊与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关的kdr等位基因的状况。本发明的最突出的优点是用一种巧妙的方法来验证测序或者其它方法对等位基因的分型结果。
图1为CF型方案的引物设计示意2为FL型方案的引物设计示意3为CF型T (T/G) T PCR后酶切结果图4为FL型TT (T/G)酶切结果图5为各种基因型频率与生物抗性表型的相关性
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、检测中华按蚊钠通道基因点突变方法的建立一PCR-RFLP法
1、PCR-RFLP检测方案及引物设计根据中华按蚊基因组(kdr敏感基因cDNA序列，其部分核苷酸序列为序列5(L1014 在此序列的核苷酸序列为1224-12 位TTG)，在GENBANK的登录号为JN002364)序列特征， L1014F为将TTG突变为TTT，L1014C为将TTG突变为TGT。L1014位点的第一个碱基T没有改变，第二个碱基可能为T/G，第三个碱基也可能为T/G，于是针对第二个和第三个碱基分别设计酶切位点，方案如下1) CF型方案设计CF型突变的碱基类型为T(T/G)T，如图1为针对C/F型突变的RFLP引物设计方案和PCR产物。引物EPl中的A被G替换，在PCR产物中产生“AAGCTT”和"AAGCTG"位点，‘‘AAGCTT”即为Hind III的酶切位点，酶切后根据不同碱基产生不同酶切片段，酶切位点在扩增序列的42bp处。)，加框处为引物设计位置，针对该序列设计一对引物EPl (引物 1，序列1)和EP2(引物2，序列2)，并且使上游引物(EPl)的倒数第3个A突变为G，引入 HindII 15，-AAGCTT-3，酶切位点。经PCR可以得到如下两条PCR产物，PCR产物全长为196bp，一条含酶切位点，另一条不含有酶切位点，所以如果序列是杂合子，则根据原位点是G/G、T/T还是G/T，酶切后可以得到如下基因型条带，分别是196bp (G/G) ； 154bp和42bp (Τ/Τ) ； 196bpU54bp和42bp (G/ Τ)。2) FL型方案设计FL型突变的碱基类型为TT (T/G)，如图2针对F/L型突变的RFLP引物设计方案和 PCR产物。引物ΕΡ4中的C被T替换，在PCR产物中产生“ TGTGA”和“GGTGA”位点，“GGTGA，， 即为Hph I的酶切位点，酶切位点在扩增序列的32bp处。)，加框处为引物设计位置，针对该序列设计一对引物EP3(引物3，序列3)和EP4(引物4，序列4)，并且使下游引物(E4)的倒数第2个A突变为G，引入HphI 5’ -GGTGA-3’酶切位点。经PCR，可以得到如下两条PCR产物，PCR产物全长为15^p，一条含酶切位点，另一条不含有酶切位点，所以如果序列是杂合子，则根据原位点是T/T、G/G还是G/T，酶切后可以得到如下基因型条带，分别是155bp (Τ/Τ) ； 123bp和32bp (G/G) ； 155bp、123bp和32bp (T/ G)。2、PCR-RFLP 反应1)方法PCR反应及条件设置
权利要求
1.一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的专用引物，由引物组A和引物组B组成 所述引物组A由引物1和引物2组成，所述引物1和引物2的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2 ；所述引物组B由引物3和引物4组成，所述引物3和引物4的核苷酸序列分别为序列表中序列3和序列表中序列4。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于 所述引物组A和所述引物组B为独立包装； 所述突变位点为L1014F或L1014C。
3.—种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的试剂，由试剂A和试剂B组成，所述试剂A 由权利要求1所述的专用引物中的引物组A和Hind III组成；所述试剂B由权利要求1所述的专用引物中的引物组B和Hph I组成。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于 所述试剂A和所述试剂B均为独立包装；所述引物组A、所述Hind III、所述引物组B和所述Hph I均为独立包装。
5.一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的PCR试剂，由PCR试剂1和PCR试剂2组成，所述PCR试剂1由权利要求1所述的专用引物中的引物组A、dNTP、DNA聚合酶、Mg2+及 PCR缓冲液组成；所述PCR试剂2由权利要求1所述的专用引物中的引物组B、dNTP、DNA聚合酶、Mg2+及PCR缓冲液组成；所述引物组A中的各引物在所述PCR试剂1中的浓度均为0. 67pmol/y 1, 所述引物组B中的各引物在所述PCR试剂2中的浓度均为0. 67pmol/y 1, 所述突变位点为L1014F或L1014C。
6.一种制备检测中华按蚊中kdr基因突变位点的试剂盒，为如下1)或2):1)所示的试剂盒包括权利要求3或4所述的试剂；2)所示的试剂盒包括权利要求5所述的PCR试剂。 所述突变位点为L1014F或L1014C。
7.权利要求1或2所述专用引物或权利要求3或4所述试剂或权利要求5所述PCR试剂或权利要求6所述试剂盒在检测中华按蚊中kdr基因突变位点、检测中华按蚊抗药性或制备检测中华按蚊抗药性产品中的应用；所述突变位点具体为L1014F或L1014C，所述抗药性为抗菊酯类药物；所述菊酯类药物具体为溴氰菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。
8.一种检测或辅助检测中华按蚊中kdr基因的突变位点的方法，包括如下步骤1)用权利要求1或2所述专用引物或权利要求3或4所述试剂或权利要求5所述PCR 试剂或权利要求6所述试剂盒中的所述引物组A和所述引物组B分别对待测中华按蚊进行 PCR扩增，分别得到A扩增产物和B扩增产物；2)分别用HindIII酶切步骤1)得到的所述A扩增产物和用Hph I酶切步骤1)得到的所述B扩增产物，分别得到酶切产物A和酶切产物B ；检测所述酶切产物A和所述酶切产物B，若所述酶切产物A得到IMbp和42bp产物，且对应的所述酶切产物B得到123bp和 32bp产物，则所述kdr基因不含或候选不含有所述突变位点；若所述酶切产物A得到196bp产物，且对应的所述酶切产物B得到155bp产物，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014C ；若所述酶切产物A得到IMbp和42bp产物，且对应的所述酶切产物B得到155bp产物， 则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014F ；若所述酶切产物A得到196bp、154bp和42bp产物，且对应的所述酶切产物B得到 155bpU23bp和32bp产物，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014C ；若所述酶切产物A得到154bp和42bp产物，且对应的所述酶切产物B得到15^p、12!3bp 和32bp产物，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014F ；若所述酶切产物A得到196bp、154bp和42bp产物，且对应的所述酶切产物B得到155bp 产物，则所述kdr基因突变位点为或候选为L1014F和L1014C。
9.一种检测或辅助检测中华按蚊中kdr基因的基因型的方法，包括如下步骤1)用权利要求1或2所述专用引物或权利要求3或4所述试剂或权利要求5所述PCR 试剂或权利要求6所述试剂盒中的所述引物组A和所述引物组B分别对待测中华按蚊进行 PCR扩增，分别得到A扩增产物和B扩增产物；2)分别用HindIII酶切步骤1)得到的所述A扩增产物和用Hph I酶切步骤1)得到的所述B扩增产物，分别得到酶切产物A和酶切产物B ；检测酶切产物A和酶切产物B，若所述酶切产物A得到IMbp和42bp产物，且对应的所述酶切产物B得到123bp和 32bp产物，则所述kdr基因为不含或候选不含有所述突变位点的纯合型基因；若所述酶切产物A得到196bp产物，且对应的所述酶切产物B得到155bp产物，则所述 kdr基因为或候选为含有突变位点L1014C的纯合型基因；若所述酶切产物A得到IMbp和42bp产物，且对应的所述酶切产物B得到155bp产物， 则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F的纯合型基因；若所述酶切产物A得到196bp、154bp和42bp产物，且对应的所述酶切产物B得到 155bpU23bp和32bp产物，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014C的杂合型基因；若所述酶切产物A得到154bp和42bp产物，且对应的所述酶切产物B得到15^p、12;3bp 和32bp产物，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F的杂合型基因；若所述酶切产物A得到196bp、154bp和42bp产物，且对应的所述酶切产物B得到产物，则所述kdr基因为或候选为含有突变位点L1014F和L1014C的杂合型基因。
10.根据权利要求8或9的方法，其特征在于所述PCR扩增中，以待测中华按蚊的基因组DNA为模板； 所述PCR扩增的退火温度为60°C _65°C，退火温度具体为60°C ； 所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。
全文摘要
本发明公开了一种中华按蚊抗药性PCR-RFLP检测试剂盒及其专用引物。本发明提供了一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的专用引物，由引物组A和引物组B组成所述引物组A由引物1和引物2组成，所述引物1和引物2的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2；所述引物组B包括引物3和引物4，所述引物3和引物4的核苷酸序列分别为序列表中序列3和序列表中序列4。本发明的实验证明，本发明提供的了一种快捷、简便、灵敏的中华按蚊kdr突变等位基因检测试剂盒，用来掌握中华按蚊与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关的kdr等位基因的状况。
文档编号C12Q1/68GK102373282SQ20111034446
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者刘美德, 张映梅, 李春晓, 汪中明, 董言德, 谭伟龙, 赵彤言, 邢丹, 郭晓霞 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所