专利名称：一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法及其检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物定量检测技术领域，具体涉及一种定量检测土壤中大肠杆菌方法及其检测试剂盒。
背景技术：
随着我国城镇化速度的加快，城市向边缘迁移与扩张，城乡结合部处在城市发展和乡村建设区的连接部位，是城市和农村的一个过渡地带，更是我国城市中粮食和蔬菜等农产品的主要供应区域，因此，城乡结合部的土壤健康与质量问题事关重大，不容忽视。目前专家学者对土壤质量的研究主要集中于农药残留，重金属污染和有机污染等指标方面， 对于土壤中病原微生物这一生物指标关注不多。来自于禽畜粪便和污水灌溉土壤病原微生物可以潜伏在土壤中存在很长一段时间，并能进入蔬菜体内，最终影响人类的身体健康。尤其是目前经常发生的因蔬菜被污染病原菌而导致的食物中毒越来越受到人们的关注，人们才逐渐认识到这一问题的严重性。目前在病原微生物定量检测方面主要有平板菌落计数法、MPN计数法，免疫学上的方法和以PCR等分子手段为基础的分子生物学上的方法。其中传统检测方法具有很高的权威性，但是在操作上具有耗时耗力麻烦等缺点，而且用于土壤中病原微生物的定量检测具有一定的复杂性和操作上的难度；随着现代分子生物学方法的发展，PCR技术因其快速准确而被广泛应用于食品中病原微生物的定性检测中，但是PCR方法不能够很好地区分死菌和活菌，而且在定量检测中也显得不足，这就造成结果上的不准确。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法，以实现提供方便、高效、快速的检测出土壤中的大肠杆菌，并有效提高检测的灵敏度。本发明的另一目的是提供一种上述方法使用的检测试剂盒。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下 一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法，包括以下步骤
(1)取土壤，用无菌水稀释成5个稀释度，分别取5个稀释度的稀释样品1ml，控温 300C，用乳糖胆盐发酵培养基，摇床震荡培养Mh，得增菌液；
(2)取少量增菌液，隔水煮沸lOmin，常温静置3(T40min使其充分复性，12000r/min离心Imin，得上清液；
(3)取2.5 μ L上清液作为PCR扩增模板，进行PCR反应，引物序列为 phoA-Ι :5’ -TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3’，
phoA-2 :5’ -CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3，；
(4)同时扩增PCR产物、阳性对照和阴性对照，然后进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后染色成像，与阳性对照比较，在684bp处出现特异性扩增条带者为阳性结果，不出现条带者为阴
性结果。
(5)统计阳性和阴性结果个数，查MPN表计算大肠杆菌个数；计算公式活菌数/ 每克土 =菌数近似值X数量指标第一位数的稀释度。步骤(1)中，稀释成5个稀释度的具体操作为取IOg 土壤加至90ml水中，震荡摇勻30min，之后取Iml 土壤悬液加至9ml生理盐水，作为10_2g/mL，再依次进行系列稀释至 1(T3 g/mL、l(T4 g/mL 禾P 1(Γ5 g/mL。步骤(2)中，取少量增菌液的具体操作为取增菌液Iml加入到1. 5ml离心管中， 6000r/min离心5min，去除上清，沉淀溶解于200 μ L无菌双蒸水中，取其中的50 μ L进行隔水煮沸。步骤(3)中，PCR反应体系在25 μ L反应体系中，10XPCR缓冲液2.5 μ L，20mmol /L Mg2+ 2. 5μ L,2. 5mmol/L dNTP 2. 0 μ L，2. 0 μ mol/L 引物 1. 0 μ L，2U/μ L Taq DNA 聚合酶0. 3 μ L，补水至25 μ Lo步骤(3)中，PCR反应条件为94°〇预变性71^11，941变性30s，57°C退火45s，72°C 延伸30s，共30个循环；最后72°C延伸5min。步骤(4)中，电泳条件为先以60V电压出孔，再以100V电压电泳30min。一种定量检测土壤中大肠杆菌的试剂盒，包括试剂供量为1次反应及以上的试剂 I和试剂II，
试剂I 用于选择性增菌培养大肠杆菌的培养基，成分为乳糖胆盐发酵培养基，配方为蛋白胨 20. Og/L，胆盐 3. Og/L，乳糖 5. Og/L，溴甲酚紫 0. 01g/L，pH7. 4士0. 1 ；
试剂II 用于MPN计数法中阳性管数确认的大肠杆菌PCR反应体系，试剂供量为1 次反应及以上，试剂包括10XPCR 缓冲液、20_ol /L Mg2+、2. 5mmol/L dNTP、2. Oymol/ L上游引物、2.0 μ mol/L下游引物、2U/μ L Taq DNA聚合酶和双蒸水；其中，上游引物为 phoA-Ι引物，序列为5，-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3，，下游引物为phoA-2引物，序列为 5， -CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3，。本发明的定量检测土壤中大肠杆菌的方法，是在参考相关研究的基础上，采用MPN 结合PCR的方法来定量检测土壤中的病原微生物。是一种MPN-PCR定量检测病原微生物方法。在建立MPN-PCR定量检测病原微生物方法之前，首先进行了一个实验来探索MPN计数法和平板菌落计数法之间是否存在一个相关性。众所周知，MPN计数法是一种利用数学统计的方法对样品中的活菌数量进行估计，得到的是一个近似值或者估计值；平板菌落计数法是一种最常规的活菌定量计数法，它具有一定的准确性和权威性。对同一样品进行了 MPN计数方法与平板菌落计数法进行了回归分析，建立了两者之间的定量关系，使MPN计数法具有与平板菌落计数法一样的准确性，从而为病原微生物，甚至功能微生物的定量计数提供更为准确的结果。本方法所建立的MPN-PCR方法的关键思路在于利用了 PCR方法快速准确的优势， 取代了传统MPN方法中阳性结果的生化鉴定和血清学鉴定等步骤，从而减少了国标方法中的繁琐步骤，提高了检测效率，同时也采用了国标法中的前增菌步骤，来提高检测目的病原菌的准确性，由于土壤自身的复杂性，土壤中存在着大量微生物，其中还包括不同名目的各种病原微生物，为了更好更准确地定量检测目的病原菌，采用了选择性培养目的病原菌来提高检测效率。经过发明人的创造性的努力以及科学实验验证，最终在土壤中添加纯菌实验中可以得到大肠杆菌定量检测方法的灵敏度为25个/g 土壤。
有益效果与现有的病原微生物定量检测方法相比，本发明的定量检测土壤中大肠杆菌法具有的突出优点包括该方法利用了 PCR方法快速准确的优势，取代了传统MPN方法中阳性结果的生化鉴定和血清学鉴定等步骤，从而减少了国标方法中的繁琐步骤，提高了检测效率，同时也采用了国标法中的前增菌步骤，来提高检测目的病原菌的准确性，并采用了选择性培养目的病原菌来提高检测效率，可以实现大肠杆菌定量检测方法的灵敏度为 25个/g 土壤，具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效益。
图1是MPN计数法与平板菌落计数法计数结果对数值的相关性曲线图2是增菌液直接扩增法扩增大肠杆菌MoA基因电泳图；图中，泳道1为10—1浓度梯度土壤稀释液样品，泳道2为10_2浓度梯度土壤稀释液样品，泳道3是10_3浓度梯度土壤稀释液样品，泳道4是10_4浓度梯度土壤稀释液样品，每个样品5个重复；CK为阴性对照，M为 DL-2000 DNA Marker ；
图3是增菌液沉淀洗涤后扩增法扩增大肠杆菌MoA基因电泳图；图中，泳道1为10—1 浓度梯度土壤稀释液样品，泳道2为10_2浓度梯度土壤稀释液样品，泳道3是10_3浓度梯度土壤稀释液样品，泳道4是10_4浓度梯度土壤稀释液样品，每个样品5个重复；CK为阴性对照，M 为 DL-2000 DNA Marker ；
图4是热裂解法扩增大肠杆菌祐oA基因电泳图；图中，泳道1为KT1浓度梯度土壤稀释液样品，泳道2为10_2浓度梯度土壤稀释液样品，泳道3是10_3浓度梯度土壤稀释液样品， 泳道4是10_4浓度梯度土壤稀释液样品，每个样品5个重复；CK为阴性对照，M为DL-2000 DNA Marker ；
图5是大肠杆菌祐W引物扩增结果的电泳图；图中，泳道1为枯草芽孢杆菌168，泳道 2为恶臭假单胞菌KTM40，泳道3为土壤杆菌，泳道4为短杆菌，泳道5为纤维微杆菌，泳道 6为微杆菌，泳道7为假单胞菌，泳道8为红球菌，泳道9为沙门氏菌，泳道10为大肠杆菌 DH5 α，M 为 DL-2000 DNA Marker ；
图6是土壤添加纯大肠杆菌25个/g 土壤后扩增图谱；泳道1为KT1浓度梯度土壤稀释液样品，泳道2为10_2浓度梯度土壤稀释液样品，泳道3是10_3浓度梯度土壤稀释液样品，每个样品5个重复；CK为阴性对照，M为DL-2000 DNA Marker。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。实施例1
以代表性大肠杆菌DH5 α菌株作为实验菌株，制备系列浓度梯度的大肠杆菌添加至灭菌土壤中进行平板菌落计数法和MPN计数法计数结果相关性分析，首先从LB平板上刮取纯培养的大肠埃希菌菌落，接种至IOOml LB液体培养基中，30°C，200r/min震荡培养他。再通过十倍稀释制备成不同浓度的系列稀释液添加至灭菌土壤中，分别采用平板菌落计数法和MPN计数法计数大肠埃希菌个数。平板菌落计数法参照文献沈萍，范秀荣，李广武。微生物学实验[M]。北京高等教育出版社，1999，92-94。进行，首先对上述制备的土壤菌悬液分别进行梯度稀释，取合适稀释度的菌悬液0. Iml涂布于LB培养基平板上，37°C条件倒置培养，平板培养1_2天后计数。MPN计数，首先对上述制备的土壤菌悬液分别进行梯度稀释，取合适稀释度的菌悬液Iml加至5ml乳糖胆盐发酵液体培养基试管，每个稀释度做5管重复，37°C摇床震荡培养 24h后统计每组样品的阳性管数，据此通过MPN表得出待测样品的微生物数目。为了建立MPN计数法在微生物计数方面与平板菌落计数法的回归方程，首先采用向灭菌土壤中添加不同浓度的大肠杆菌纯培养物制备不同梯度的土壤菌悬液，然后采用稀释涂布平板计数法和MPN计数法分别对同一样品进行计数，从而建立起两者之间的回归方程，并对回归方程进行方差分析以及对回归系数进行了 t检验。采用了 8个系列浓度的大肠杆菌菌悬液添加至灭菌土壤中进行回归方程的建立， 表1列出了平板菌落计数法和MPN计数法计数结果。表1平板菌落计数法和MPN计数法计数结果
权利要求
1.一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)取土壤，用无菌水稀释成5个稀释度，分别取5个稀释度的稀释样品1ml，控温 300C，用乳糖胆盐发酵培养基，摇床震荡培养Mh，得增菌液；(2)取少量增菌液，隔水煮沸lOmin，常温静置3(T40min使其充分复性，12000r/min离心Imin，得上清液；(3)取2.5 μ L上清液作为PCR扩增模板，进行PCR扩增反应，引物序列为phoA-Ι :5’ -TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3’，phoA-2 :5’ -CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3，；(4)同时扩增PCR产物、阳性对照和阴性对照，然后进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后染色成像，与阳性对照比较，在684bp处出现特异性扩增条带者为阳性结果，不出现条带者为阴性结果；(5)统计阳性和阴性结果个数，查MPN表计算大肠杆菌个数；计算公式活菌数/每克土 =菌数近似值X数量指标第一位数的稀释度。
2.根据权利要求1所述的定量检测土壤中大肠杆菌的方法，其特征在于步骤(1)中， 稀释成5个稀释度的具体操作为取IOg 土壤加至90ml水中，震荡摇勻30min，之后取Iml 土壤悬液加至9ml生理盐水，作为10_2g/mL，再依次进行系列稀释至10_3 g/mL、10_4 g/mL和 1(Γ5 g/mL。
3.根据权利要求1所述的定量检测土壤中大肠杆菌的方法，其特征在于步骤(2)中， 取少量增菌液的具体操作为取增菌液Iml加入到1. 5ml离心管中，6000r/min离心5min， 去除上清，沉淀溶解于200 μ L无菌双蒸水中，取其中的50 μ L进行隔水煮沸。
4.根据权利要求1所述的定量检测土壤中大肠杆菌的方法，其特征在于步骤(3) 中，PCR反应体系在25 μ L反应体系中，10 X PCR缓冲液2.5 μ L，20mmol /L Mg2+ 2. 5 μ L， 2. 5mmol/L dNTP 2. O μ L，2. O μ mol/L 引物 1. O μ L，2U/μ L Taq DNA 聚合酶 0. 3 μ L，补水至 25 μ L0
5.根据权利要求1所述的定量检测土壤中大肠杆菌的方法，其特征在于步骤(3)中， PCR反应条件为94°C预变性7min，94°C变性30s，57 °C退火45s，72 °C延伸30s，共30个循环；最后72°C延伸5min。
6.根据权利要求1所述的定量检测土壤中大肠杆菌的方法，其特征在于步骤(4)中， 电泳条件为先以60V电压出孔，再以100V电压电泳30min。
7.一种定量检测土壤中大肠杆菌的试剂盒，其特征在于包括试剂供量为1次反应及以上的试剂I和试剂II，试剂I 用于选择性增菌培养大肠杆菌的培养基，成分为乳糖胆盐发酵培养基，配方为蛋白胨 20. Og/L，胆盐 3. Og/L，乳糖 5. Og/L，溴甲酚紫 0.01g/L，pH7.4士0. 1 ；试剂II 用于MPN计数法中阳性管数确认的大肠杆菌PCR反应体系，试剂供量为1 次反应及以上，试剂包括10XPCR 缓冲液、20_ol /L Mg2+、2. 5mmol/L dNTP、2. Oymol/ L上游引物、2.0 μ mol/L下游引物、2U/μ L Taq DNA聚合酶和双蒸水；其中，上游引物为 phoA-Ι引物，序列为5，-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3，，下游引物为phoA-2引物，序列为 5， -CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3，。
全文摘要
本发明公开了一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法及其检测试剂盒，该方法是在参考相关研究的基础上，采用MPN结合PCR的方法来定量检测土壤中的病原微生物。利用了PCR方法快速准确的优势，取代了传统MPN方法中阳性结果的生化鉴定和血清学鉴定等步骤，从而减少了国标方法中的繁琐步骤，提高了检测效率，同时也采用了国标法中的前增菌步骤，来提高检测目的病原菌的准确性，由于土壤自身的复杂性，土壤中存在着大量微生物，其中还包括不同名目的各种病原微生物，为了更好更准确地定量检测目的病原菌，采用了选择性培养目的病原菌来提高检测效率。经过发明人的创造性的努力以及科学实验验证，最终在土壤中添加纯菌实验中可以得到大肠杆菌定量检测方法的灵敏度为25个/g土壤。
文档编号C12R1/19GK102337344SQ201110344298
公开日2012年2月1日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者崔中利, 曹慧, 董丽宁 申请人:南京农业大学