专利名称：：食品中常见弯曲菌检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及病原微生物的检测方法，尤其涉及食品中致病性弯曲菌属微生物的mPCR-DHPLC检测方法，同时还涉及检测所用的组合物，即试剂盒。
背景技术：
：弯曲菌感染是一种人畜共患病，在世界各地均有发生，可引起人类急性肠炎、格林巴利综合症、反应性关节炎、Reiter，s综合症等多种疾病。本属的两个耐热禾中(决ermo//w7/ccamp少/oZ)acter):空月汤弯曲菌(y'^/wm')禾口结肠弯曲菌(C"m/^/oZ^"w//)，几乎可从所有弯曲杆菌临床感染的病例中分离。嗜热弯曲菌属细菌，尤其是空肠弯曲菌被认为是人类细菌性腹泻的主要病原菌。在新西兰和美国，由空肠弯曲菌引发的食源性细菌感染在一定范围内已经超过了沙门氏菌和志贺氏菌。动物(特别是家禽)是该菌的主要寄主，另外生牛奶、未经加工的肉制品和未经处理的水也是主要载体。弯曲菌不易在食物中生长，但是引起发病的感染剂量却很低，大约摄入400500个菌体就可引发肠道感染，这对禽类产品安全和人类健康造成了严重的威胁。国内针对食品微生物中沙门氏菌、单增李氏菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌等的分子生物学检测技术研究较为深入和广泛，但针对弯曲菌的快速、高通量、分型检测技术研究则所见报道甚少。目前许多发达国家已对食品中的弯曲菌建立起较为完善的监测和控制体系，而我国相关调查报道较少。目前，对食品中常见弯曲菌的检测最主要的方法就是选择性富集培养，但是由于该菌在样品中的数量极少，并且生长条件要求苛刻，因此很难从样品中检出。近来的研究发现，在一些特定的条件下，弯曲菌还存在着一种"存在但不可培养"的状态，这更是传统分离培养检测方法无法克服的难题。因此，建立一种高效、快捷、高通量的致泻性大肠埃希氏菌分型鉴定技术是食品安全所面临的急需解决的问题。变性高效液相色谱(DHPLC)采用离子对反相高效液相色谱的原理，是通过使用特殊的耐高温液相色谱分离柱同时采用温度调控的方式，对核苷酸片段分子进行分析分离的方法，因此，也有人称该技术为温度调控离子对反相高效液相色谱。该技术的发明为生命科学领域里的核酸分析提供了方便实用的技术平台。其快速高通量、全自动化操作、准确度高、重复性好及敏感性高的优点使其在核酸分析中具有无可替代的优势。DHPLC技术检测微生物是很好的培养不依赖的混合微生物样本的分析平台，不仅能鉴定常见的微生物，还能鉴定不常见的，苛刻的，和厌氧的细菌。该技术在已知和未知基因突变的检测和筛选、基因分型、基因定量和长度多态性分析等领域已经得到广泛应用。基于此，本发明人试图建立利用DHPLC的高效、快捷、简便的适宜临床检测应用的特异而灵敏的食品中常见弯曲菌的检测方法。
发明内容本发明的目的在于提供一种用于灵敏快捷地检测样品、尤其是检测食品中常见弯曲菌，以判定待检样品是否受到污染的试剂盒及其检测方法。首先，本发明所述的食品中常见弯曲菌检测试剂盒是lmL检测溶液含10mMTris'Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5000U即5U/|iL及四种常见弯曲菌引物对各10pM、。其中，待检测弯曲菌属微生物的特异性引物序列如下菌株上、下游引物序列(5'-3')空肠弯曲菌GATATGTATGATTTTATCTTGCGAATGAAATTTTAGAATGGGG结肠弯曲菌CCACCTGTAATCACTCCTAATACCGCCCAGATTGTTAAAGATGCTC红嘴鸥弯曲菌GACCGCTTCCAAGACTTACTTCCCAGACCCTCGCATCACC胚胎弯曲菌GCAAATATAAATGTAAGCGGAGAG(C画"/o6ac妙^加)TGCAGCGGCCCCACCTAT本发明还提供了利用上述试剂盒检测食品中常见弯曲菌的检测方法，包括如下步骤①取lul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒溶液和14ul灭菌超纯水，总体积25ul;5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性94°C，3min进入循环94r变性60s，56。C退火60s，72。C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min;②DHPLC分析色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱(4.6mmx50mm，粒度3pm);柱温50°C;流动相(体积比):0.0min，55.0%缓冲溶液A，45.0%缓冲溶液B;0.5min，50.2%缓冲溶液A，49.8%缓冲溶液B;2.4min，44.2%缓冲溶液A，55.8%缓冲溶液B;4.3min，40.9%缓冲溶液A，59.1%缓冲溶液B;6.1min，38.8%缓冲溶液A，61.2%缓冲溶液B;8min，37.3%缓冲溶液A，62.7%缓冲溶液B;其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1MTEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;检测器荧光检测器(光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s);上样量PCR产物5pL。检测结束后，根据DHPLC检测图谱中特征色谱峰的峰形、保留时间以及与阳性对照谱图的对照，来确定样品的染菌情况。检测过程中可以分别设阳性对照和阴性对照。阳性对照为扩增片段的阳性克隆分子DNA或阳性齒株DNA，阴性对照为非目标致病菌DNA。阴性对照在上述DHPLC分析条件下，无吸收峰出现；阳性对照在上述DHPLC分析条件下，空肠弯曲菌在约3.8min出现PCR产物吸收峰；结肠弯曲菌在约4.2min出现PCR产物吸收峰；红嘴区鸟弯曲菌在约4.5min出现PCR产物吸收峰；胚胎弯曲菌在约8.7min出现PCR产物吸收峰。且以上典型的PCR产物吸收峰值大于2mV;在上述DHPLC分析条件下，约3.8min出现PCR产物吸收峰，为空肠弯曲齒；约4.2min出现PCR产物吸收峰，为结肠弯曲菌；约4.5min出现PCR产物吸收峰，为红嘴鸥弯曲菌；约8.7min出现PCR产物吸收峰，为胚胎弯曲菌。若在与阳性对照相同的出峰时间，检测样品无扩增吸收峰出现，可判定样品结果为阴性，直接报告未检出相对应的致病菌。本发明采用多重PCR结合变性高效液相色谱(PCR-DHPLC)技术，针对食品中4类常见的弯曲菌建立灵敏便捷的检测方法，并在此基础上，建立食品中常见弯曲菌快速检测试剂盒。本方法采用弯曲菌的毒力因子基因检测，可以在检测出弯曲菌的同时进行四种类型的区分；检测时间仅1.5天，比传统微生物学方法检测时间大为縮短；检测限低于15cfu/mL,只要每毫升菌液里各弯曲菌数不低于15个即可检出。并且本方法检侧时间比传统方法短，方法更加简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。本发明附图5幅，均为实施例的种间特异性试验结果图，其中图1是本发明方法的种间特异性试验中空肠弯曲菌的检测图谱；图2是本发明方法的种间特异性试验中结肠弯曲菌的检测图谱；图3是本发明方法的种间特异性试验中红嘴鸥弯曲菌的检测图谱；图4是本发明方法的种间特异性试验中胚胎弯曲菌的检测图谱；图5是四种弯曲菌的mPCR-DHPLC检测结果；上述附图中，横坐标均为保留时间(单位分钟min)，纵坐标表示吸收峰信号强度(单位毫伏mV)。其中，1.空肠弯曲菌基因组DNAATCC33560D-5;2.空肠弯曲菌ATCC33291;3.结肠弯曲菌基因组DNAATCCBAA-1061D;4.结肠弯曲菌ATCC43478;5.红嘴鸥弯曲菌基因组DNAATCCBAA-1060D;6.红嘴区鸟弯曲菌ATCCBAA-1060;7.胚胎弯曲菌ATCC27374;8.胚胎弯曲菌ATCC43478;9.福氏志贺氏菌ATCC12022;10.肠致病性大肠杆菌ATCC43887;11.弗劳地柠檬酸杆菌ATCC8090;12.肠炎沙门氏菌ATCC13076;13.小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC9610上述附图中，横坐标均为保留时间(单位分钟min)，纵坐标表示吸收峰信号强度(单位毫伏mV)。具体实施例方式下面为本发明的具体实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。若无特殊说明，本部分所使用的主要试剂、仪器及其商品来源为细菌基因组DNA小量纯化试剂盒(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)、Taq酶及PCR缓冲液等试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；弯曲菌培养基(CampylobacterAgarBase)购自美国BD公司；布氏肉汤购自北京陆桥技术责任有限公司；全自动细菌培养系统MART-II(MartMicrobiologyB.V.公司，荷兰)；普通PCR仪PE24000(PerkinElmer公司，美国)；变性高效液相色谱仪NAV-99-4500(Transgenomic公司，美国)；高速离心机centriflige5804(Eppendorf公司，德国)。本部分内容涉及的标准菌株及标准菌株基因组DNA分别购自美国ATCC标准生物品收藏中心和中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)，详见表l。使用前，取表l中所列试验菌种，经培养后分别提取基因组DNA，建立模板库供本部分实施例试验使用。弯曲菌属的菌株在弯曲菌选择性培养基上，于42X:微需氧环境下(5%氧气、10%一氧化碳和85%氮气)培养24h。其他的菌株在胰蛋白大豆琼脂(TSA)上，于37。C培养24h。表1序号中文名称拉丁学名菌株号1空肠弯曲菌C"，y/。力w/ersupsp.m'ATCC332912空肠弯曲菌基因组DNAC證/卢Z)"c欣勿'臓'supsp.勿'画'genomicDNAATCC33560D-53结肠弯曲菌ATCC434784结肠弯曲菌基因组DNAC調^y/c^"e/erco//genomicDNAATCCBAA-薩D胚胎弯曲菌Cjy/oZ)"c^#船supsp.fewsATCC273746红嘴鸥弯曲菌基因组DNAC"m/y/oZ^c^/an'genomicDNAATCCBAA-1060D肠致病性大肠杆菌EnteropathogenicOl11:nmATCC438878肠产毒性大肠杆齒Enterotoxigenic五.co//078:H11ATCC354019肠出血性大肠杆菌Enterohemorrhagic五.co//Ol57:H7ATCC3515010肠侵袭性大肠杆菌Enteroinvasive0124:nmATCC4389311大肠杆菌ATCC2592212大肠杆菌ATCC837913火肠杆菌ATCC1177514鼠伤寒沙门氏菌ATCC4941615猪霍乱沙门氏菌ATCC1070816肠炎沙门氏菌ATCC1307617弗劳地柠檬酸杆菌ATCC809018福氏志贺氏菌ATCC1202219奇异变形杆菌ATCC2924520普通变形杆菌CMCC4902721小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC961022金黄色葡萄球菌5^//y/ococeusa廳船ATCC4944423单增利斯特氏菌ATCC1911124创伤弧菌糊"》ra/"诉c'wA'ATCC2756225拟态弧菌ATCC3365326嗜水气单胞菌ATCC796627类志贺邻单胞菌ATCC1403028铜绿假单胞菌ATCC2785329阪崎肠杆菌ATCC51329实施例l、食品中常见弯曲菌的检测试剂盒及其检测方法的建立本实施例确定用于检测的目的基因及其引物如下表(表2)所示_表2_菌株目的基因上、下游引物序列(5'-3')产物大小bp空肠弯曲菌g一GATATGTATGATTTTATCTTGC159GAATGAAATTTTAGAATGGGG结肠弯曲菌CCACCTGTAATCACTCCTAATACC173GCCCAGATTGTTAAAGATGCTC红嘴鸥弯曲菌GACCGCTTCCAAGACTTACTTC197CCAGACCCTCGCATCACC胚胎弯曲菌■rapGCAAATATAAATGTAAGCGGAGAG435TGCAGCGGCCCCACCTAT在此基础上，设计用于PCR扩增的食品中常见弯曲菌检测试剂盒lmL检测溶液含10mMTris'Cl、50mMKC1、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP禾口dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U尔L及上述表2中四种常见弯曲菌引物对各10nM、；使用该试剂盒检测样品中的弯曲菌的PCR-DHPLC方法包括如下步骤①待检样品的制备a.食品样品将10g采集样品加入90mL布氏肉汤中，42。C微需氧条件下(5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气)培养24h。使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-2(TC保存。b.纯化菌株样品挑取单个菌落于布氏肉汤中，42'C微需氧条件下(5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气)培养24h。使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-2(TC保存。②取lul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒溶液和14ul灭菌超纯水，总休积25ul;5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性94°C，3min;进入循环94。C变性60s，56。C退火60s，72'C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min;③DHPLC分析色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱(4.6mmx50mm，粒度3pm);柱温50°C;流动相(体积比)O.Omin，55.0%缓冲溶液A，45.0%缓冲溶液B;0.5min，50.2%缓冲溶液A，49.8°/。缓冲溶液B;2.4min，44.2%缓冲溶液A，55.8%缓冲溶液B;4.3min，40.9%缓冲溶液A，59.1%缓冲溶液B;6.1min，38.8%缓冲溶液A，61.2%缓冲溶液B;8min，37.3%缓冲溶液A，62.7%缓冲溶液8;其中，缓冲溶液A是浓度O.lmM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1MTEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;检测器荧光检测器(光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s);上样量PCR产物5pL。检测结束后，根据DHPLC检测图谱中特征色谱峰的峰形、保留时间以及与阳性对照谱图的对照，来确定测定结果。需要说明的是对于mPCR-DHPLC结果的判断需要结合阳性对照和阴性对照来进行。将待测样品的mPCR-DHPLC检测谱图与阴性对照及阳性对照的mPCR-DHPLC检测谱图比较，当阴性对照无任何特异性吸收峰出现，而阳性对照出现位置正确的特异性吸收峰时，若被检样品在与阳性扩增的同一位置上出现特异性吸收峰，且峰高>2mV时，判定为阳性；若被检样品在该位置无特异性吸收峰，则判定为阴性；若被检样品在与阳性扩增的同一位置上出现特异性吸收峰，但峰高〈mV时，则为可疑样品，需要通过国标方法或其他方法进行确认。实施例2、特异性试验取表1中所列试验菌种，经培养后分别提取基因组DNA，建立一个模板库。然后以这些基因组DNA为模板，按照上述条件及方法进行mPCR-DHPLC分析检测。4种不同类型的弯曲菌DHPLC特异性检测图谱如附图14所示，箭头所指的峰型为各待检测弯曲齒的特异性吸收峰。从图示结果可以看出a.2个空肠弯曲菌全部扩增出了目的基冈片段，而其他非空肠弯曲菌株则全部为阴性结果(附图1);b.2个结肠弯曲菌全部扩增出了cA目的基冈片段，而其他非结肠弯曲齒则全部为阴性结果(附图2);c.1株红嘴鸥弯曲菌扩增出了cA目的基闲片段，而其他非红嘴瞎弯曲菌则全部为阴性结果(附图3);d.l株胚胎弯曲菌扩增得到^^目的基闲片段，其余非胚胎弯曲菌全部为阴性结果(附图4)。上述结果表明本试验设计的4种引物适用于PCR-DHPLC检测弯曲菌，具有很好的种间特异性。实施例3、灵敏度试验将ATCC购得的①空肠弯曲菌基因组DNA(ATCC33560D-5)5吗冻干粉、②结肠弯曲菌基因组DNA(ATCCBAA-1061D)10pg、③红嘴区鸟弯曲菌基因组DNA(ATCCBAA-1060D)10吗用TE缓冲液溶解并进行10倍梯度稀释，浓度分别为10ng/|iL，lng:L，100pg尔L，10pg/pL禾卩1pg尔L。将胚胎弯曲菌(ATCC27374)基因组DNA用分光光度计测定浓度后，调整为10ng^iL，1ng/^iL，100pg/|iL，10pg/)iL禾口lp,。不同浓度的模板经多重PCR反应，用DHPLC进行检测。在模板DNA浓度分别为空肠弯曲菌10pg/pL、结肠弯曲菌1pg/pL、红嘴鸥弯曲菌1pg尔L和胚胎弯曲菌100pg&L时仍可检测到特异性吸收峰。表3为在基因组水平上检测各弯曲菌的灵敏度。表3^\编浓\^号度\^空肠弯曲菌基因组DNAATCC33560D-5结肠弯曲菌基因组DNAATCCBAA-薩D红嘴鸥弯曲菌基因组DNAATCCBAA-1060D胚胎弯曲齒ATCC27374基因组DNA10ng/nL++++1ng/pL++++100pg/pL++++10pg/^iL+++-1pg尔L-++-测量的DHPLC谱图如附图5所示。由该结果还可以看出四种常见弯曲菌的mPCR-DHPLC行为具有明显的差异，使用实施例1所建立的试剂盒及检测方法可以在一次检测中非常有效地将染菌样品中的这四种菌区分识别。实施例4、人工污染样品灵敏度将含菌量分别为1.5x105、1.5x104、1.5x103、1.5x102、1.5x101、1.5x10°的模拟污染样品置卯mL布氏肉汤中，42t:微需氧条件下培养24h。每个梯度培养液采用试剂盒提取法(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)制备模板DNA，进行PCR-DHPLC检测。各弯曲菌的检测限如表4。即当最初模拟样品中含有1.5个空肠弯曲菌、1.5个结肠弯曲菌、1.5个红嘴鸥弯曲菌或15个胚胎弯曲菌时，经42X:微需氧条件下培养24h可被检出。表4双^<空肠弯曲菌ATCC33291结肠弯曲菌ATCC43478红嘴鸱弯曲菌ATCCBAA-1060胚胎弯曲菌ATCC27374++++1.5xl04++++1.5x103++++1.5xl02++++1.5xl01+++1.5xlOe+++-实施例5、食品检测试验采用本实施例所述的mPCR-DHPLC方法和国家标准方法(GB/T4789.9-2003)和行业标准方法(SN/T0175-92)对随机采集的172份冷冻鸡肉类样品进行同时检测。其中本发明的mPCR-DHPLC的前增菌方法为将10g采集样品加入90mL弯曲菌液体增菌培养基中，42。C微需氧条件下(5。/。氧气、10%二氧化碳和85%氮气)培养24h。经统计，用本发明的mPCR-DHPLC方法检出18株空肠弯曲齒，7株结肠弯曲菌。采用国家和行业标准方法检出4株空肠弯曲菌，l株结肠弯曲菌。对其余本发明的mPCR-DHPLC检出为阳性，而标准方法检出为阴性的样品，采用增加筛选可疑菌株数量，利用免疫学分析试剂条(VIDAS)和快速生化鉴定(API)等多种确认方法，均证实为阳性结果。弯曲菌采用PCR-DHPLC和GB/SN两种方法检测结果的比较见表5:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>该试验中，本发明的mPCR-DHPLC方法检出率高于传统国家标准方法的检测结果。可能是因为传统检测方法对于处于不可培养状态的弯曲菌不具有检测能力，故未能如实反映样品中弯曲菌的实际污染状兄而本发明的mPCR-DHPLC方法对于处于不可培养状态的弯曲菌同样具有检测的能力，这将有助于对冷冻食品中弯曲菌的污染状况进行检测监测。权利要求1、食品中常见弯曲菌检测试剂盒，其特征在于1mL检测溶液含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及四种常见弯曲菌引物对各10μM；其中，待检测弯曲菌属微生物的特异性引物序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001"></tables>2、食品中常见弯曲菌的检测方法，其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒，包括下述步骤①取lul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒溶液和14ul灭菌超纯水，总体积25ul;5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性94°C，3min;进入循环94。C变性60s，56'C退火60s，72"C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min;②DHPLC分析色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mmx50mm，粒度3jim;柱温50°C;流动相(体积比):0.0min，55.0%缓冲溶液A，45.0%缓冲溶液B;`0.5min，50.2%缓冲溶液A，49.8%缓冲溶液B;2.4min，44.2%缓冲溶液A，55.8%缓冲溶液B;4.3min，40.9%缓冲溶液A，59.1%缓冲溶液B;`6.1min，38.8%缓冲溶液A，61.2%缓冲溶液B;8min，37.3%缓冲溶液A，62.7%缓冲溶液B;其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1MTEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;检测器荧光检测器(光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s);上样量PCR产物5fiL。全文摘要一种用于食品微生物污染检测及监控的食品中常见弯曲菌检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒中，1mL检测溶液含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl<sub>2</sub>、dNTP(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及四种常见弯曲菌引物对各10μM；本方法采用弯曲菌的毒力因子基因检测，可以在检测出弯曲菌的同时进行四种类型的区分；检测时间仅1.5天，比传统微生物学方法检测时间大为缩短；检测限低于15cfu/mL，只要每毫升菌液里各弯曲菌数不低于15个即可检出。并且本方法检侧时间比传统方法短，方法更加简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。文档编号C12Q1/68GK101624625SQ20091001079公开日2010年1月13日申请日期2009年3月20日优先权日2009年3月20日发明者徐君怡,曹际娟申请人:徐君怡;曹际娟