专利名称：：致泻性大肠埃希氏菌检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及病原微生物的检测试剂盒及检测方法，尤其涉及食品中致泻性大肠埃希氏菌mPCR-DHPLC检出试剂盒及方法。
背景技术：
：致泻性大肠埃希氏菌是与人类疾病有关的大肠杆菌的统称，包括肠产毒性大肠杆菌(五wtera/ox(g^"/c五.co//，ETEC)、肠致病性大肠杆菌(五她ra/"f/zoge"/c五.co/z'，EPEC)、肠出血性大肠杆菌(五wfera/2ewwr/wg/c五.co//，EHEC)、肠侵袭性大肠杆菌(五"^w'"vawVeEIEC)等。致泻性大肠杆菌是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病的主要致病菌，其中尤以EPEC、ETEC所占比例为大。多年来，致泻性大肠杆菌引起的腹泻病例始终位于第二位，可见大肠杆菌肠道传染的广泛性。EHEC0157:H7己被世界卫生组织(WHO)定为新的食源性致病菌，其引发的出血性肠炎的暴发或散发病例，自1983年以来在北美州(美国、加拿大)地区逐年增多，英国、日本亦有爆发和散发病例报道，我国也发现散发病例，尚未有爆发EHEC的报道。目前，我国对大肠杆菌的诊断和流行病学调查也主要仍依靠菌株血清型的菌体抗原进行鉴定，但血清学分型检测有其弊端检测周期长并易受人为因素干扰，在一些不同的"O"血清型之间存在着交叉反应，而且多数从腹泻病人粪便标本中分离出的大肠杆菌并不能用现有的血清抗原进行诊断鉴定。因而在许多临床实验室中，仍将未能鉴定的大肠杆菌作为肠道正常菌群看待，仅根据少数生化指标，甚至仅根据乳糖发酵一项就将分离物作为"杂菌"丢弃，从而殆误诊断和治疗的例子屡见不鲜。现在国内关于致病性大肠杆菌的国家标准(GB/T4789.6-2003)和行业标准检测方法还是传统的微生物学检测方法，尚不够完善，四种致泻性大肠杆菌的分类鉴定仅依靠血清学凝集反应现象，而很多情况下肠致病性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌容易出现血清学的交叉反应，很难进行区分。而国外的传统微生物检测方法(如FDA、AOAC、ISO等)也是以单一的或少数目标菌为目的设计的程序，既费时又费力。目前，有些成熟的微生物快速鉴定系统己经被应用于致泻性大肠杆菌的检测，但是开发较多的也仅限于肠出血性大肠杆菌0157:H7。如荧光免疫检测法(VIDAS)、BAX全自动病原菌筛选系统、API20E等。在分子生物学检测方面，目前FDA2004标准仍是以检测一种致泻性大肠杆菌为目的设计程序，检测不同的致泻性大肠杆菌需要不同的反应条件。因此，建立高效、快捷、高通量的致泻性大肠埃希氏菌分型鉴定技术是食品安全所面临的急需解决的问题。变性高效液相色谱(DHPLC)采用离子对反相高效液相色谱的原理，是通过使用特殊的耐高温液相色谱分离柱同时采用温度调控的方式，对核苷酸片段分子进行分析分离的方法，因此，也有人称该技术为温度调控离子对反相高效液相色谱。该技术的发明为生命科学领域里的核酸分析提供了方便实用的技术平台。其快速高通量、全自动化操作、准确度高、重复性好及敏感性高的优点使其在核酸分析中具有无可替代的优势。DHPLC技术检测微生物是很好的培养不依赖的混合微生物样本的分析平台，不仅能鉴定常见的微生物，还能鉴定不常见的，苛刻的，和厌氧的细菌。该技术在己知和未知基因突变的检测和筛选、基因分型、基因定量和长度多态性分析等领域已经得到广泛应用。基于此，本发明人试图建立利用DHPLC的高效、快捷、简便的适宜临床检测应用的特异而灵敏的致泻性大肠埃希氏菌的检测方法。
发明内容本发明的目的在于提供一种用于灵敏快捷地检测样品、尤其是检测食品中致泻性大肠埃希氏菌以判定待检样品是否受到污染的试剂盒及其检测方法。首先，本发明所述的致泻性大肠埃希氏菌检测试剂盒是lmL检测溶液含10mMTris.Cl、50mMKC1、25mMMgC12、dNTP(dATP、dGTP、dCTP禾ndTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5000U(即5UML)及四种致泻性大肠埃希氏菌引物对各10其中，针对四种致泻性大肠埃希氏菌的目的基因及特异性引物序列如下5菌株目的基因上、下游引物序列(5'-3')肠产毒性大肠杆菌GCACACGCAGCTCCTCAGTC(ETEC)TCCTTCATCCTTTCAATGGCTTT肠致病性大肠杆菌的GGAAGTCAAATTCATGGGGGTAT(EPEC)GGAATCAGACGCAGACTGGTAGT肠出血性大肠杆菌ATTGCGCTGAAGCCTTTG(EHEC)CGAGTACATTGGCATCGTG肠侵袭性大肠杆菌/a/CTGGATGGTATGGTGAGG(EIEC)GGAGGCCAACAATTATTTCC本发明还提供了利用上述试剂盒检测致泻性大肠埃希氏菌的检测方法，包括如下步骤①取lul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒溶液和14ul灭菌超纯水，总体积25ul;5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性94°C，3min;进入循环94。C变性60s，56。C退火60s，72'C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min;②DHPLC分析色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱(4.6mmx50mm，粒度3jim);柱温50°C;流动相(体积比)0.0min，55.0%缓冲溶液A，45.0%缓冲溶液B;0.5min，50.2%缓冲溶液A，49.8%缓冲溶液B;3.6min，41.8%缓冲溶液A，58.2%缓冲溶液B;6.8min，38.2%缓冲溶液A，61.8%缓冲溶液B;9.9min，36.3%缓冲溶液A，63.7%缓冲溶液B;13min，35.0%缓冲溶液A，65.0%缓冲溶液B;其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1MTEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液。流速0.9mL/min;检测器荧光检测器(光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s);上样量PCR产物5pL;检测结束后，根据DHPLC检测图谱中特征色谱峰的峰形、保留时间以及与阳性对照谱图的对照，来确定样品的染菌情况。检测过程中可以设阳性对照和阴性对照。阳性对照为扩增片段的阳性克隆分子DNA或阳性菌株DNA，阴性对照为非目标致病菌DNA。阴性对照在上述DHPLC分析条件下，无吸收峰出现；阳性对照在上述DHPLC分析条件下，肠产毒性大肠杆菌在约5.2min出现PCR产物吸收峰；肠致病性大肠杆菌在约6.5min出现PCR产物吸收峰；肠侵袭性大肠杆菌在约7.1min出现PCR产物吸收峰;肠出血性大肠杆菌在约10.5min出现PCR产物吸收峰。且以上典型的PCR产物吸收峰值大于2mV;在上述DHPLC分析条件下，约5.2min出现PCR产物吸收峰，为肠产毒性大肠杆菌；约6.5min出现PCR产物吸收峰，为肠致病性大肠杆菌；约7.1min出现PCR产物吸收峰，为肠侵袭性大肠杆菌；约10.5min出现PCR产物吸收峰，为肠出血性大肠杆菌。上述检测方法中所述的待测样品DNA溶液是指用常规的细菌基因组提取的基因组DNA。疑似染菌的样品可以通过常规方法增菌培养后用于提取基因组DNA。通常可以采用如下的试剂盒提取法制备待测样品DNA基因组a.食品样品无菌方法称取25克样品于225mL缓冲蛋白胨水中，46h增菌后，取10mL转移到10mL营养肉汤中培养1824h，使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-20'C保存。b.标准菌株挑取单个菌落于营养肉汤中培养1824h，使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-2(TC保存。本发明采用多重PCR结合变性高效液相色谱(mPCR-DHPLC)技术，针对食品中4类致泻性大肠埃希氏菌建立灵敏便捷的检测方法，并在此基础上，建立食品中致泻性大肠埃希氏菌快速检测试剂盒。本方法采用致泻性大肠杆菌的毒力因子基因检测四种致泻性大肠杆菌，可以检测出致泻性大肠杆菌的同时进行四种类型的区分。检测四种致泻性大肠杆菌的检测下限低于10cfU/mL，只要每毫升菌液里各致泻性大肠杆菌数有10个，用本方法就可以检测出来。此外，本方法检侧时间比传统方法短，方法更加简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。本发明附图5幅，其中"图1是mPCR-DHPLC方法的种间特异性试验中EPEC的检测图谱；图2是mPCR-DHPLC方法的种间特异性试验中ETEC的检测图谱；图3是mPCR-DHPLC方法的种间特异性试验中EHEC的检测图谱；图4是mPCR-DHPLC方法的种间特异性试验中EIEC的检测图谱；图5是四种致泻性大肠埃希氏菌的mPCR-DHPLC检测结果；上述附图中，横坐标均为保留时间(单位分钟min)，纵坐标表示吸收峰信号强度(单位毫伏mV)。具体实施例方式下面为本发明的具体实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。若无特殊说明，本部分所使用的主要试剂、仪器及其商品来源为细菌基因组DNA小量纯化试剂盒(TakaRaMiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionkit)、Taq酶及PCR缓冲液等试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；普通PCR仪PE24000(PerkinElmer公司，美国)；变性高效液相色谱仪NAV-99-4500(Transgenomic公司，美国)；高速离心机centrifuge5804(Eppendorf公司，德国)。本部分所使用的标准菌株分别购自美国ATCC标准生物品收藏中心和中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)。实施例1、致泻性大肠埃希氏菌检测试剂盒及其检测方法的建立本实施例确定用于检测的目的基因及其引物如下表所示8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在此基础上，设计用于PCR扩增的致泻性大肠埃希氏菌检测试剂盒lmL检测溶液含10mMTris'Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP(dATP、dGTP、dCTP禾ndTTP)各2.5mM、TaqDNA聚合酶5UL及四种致泻性大肠埃希氏菌引物对各10nM。使用该试剂盒检测样品中的致泻性大肠埃希氏菌的mPCR-DHPLC方法包括如下步骤①待检样品的制备采用试剂盒提取法制备待测样品DNA基因组c.食品样品无菌方法称取25克样品于225mL缓冲蛋白胨水中，46h增菌后，取10mL转移到10mL营养肉汤中培养1824h，使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-20"C保存。d.标准菌株挑取单个菌落于营养肉汤中培养1824h，使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-20。C保存。；②PCR扩增取lul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒溶液和14ul灭菌超纯水，总体积25ul;5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性94°C，3min;进入循环94。C变性60s，56。C退火60s，72。C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min;③DHPLC分析色谱柱PS-DVB&CI8DNASep色谱柱(4.6mmx50mm，粒度3pm);柱温50°C;流动相(体积比):O.Omin，55.0%缓冲溶液A，45.0%缓冲溶液B;0.5min，50.2%缓冲溶液A，49.8%缓冲溶液B;3.6min，41.8%缓冲溶液A，58.2%缓冲溶液B;6.8min，38.2%缓冲溶液A，61.8%缓冲溶液B;9.9min，36.3%缓冲溶液A，63.7%缓冲溶液B;13min，35.0%缓冲溶液A，65.0%缓冲溶液B;其中，缓冲溶液A是浓度O.lmM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1MTEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液。流速0.9mL/min;检测器荧光检测器(光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s);上样量PCR产物5liL;实施例2、特异性试验取表2中所列试验菌种，经培养后分别提取基因组DNA，建立模板库。然后以这些基因组DNA为模板，以6#、仏-E、为目的基因采用实施例1所建立的条件进行mPCR-DHPLC分析检测。4种不同类型的致泻性大肠杆菌DHPLC特异性检测图谱如附图14所示，箭头所指的峰型为各致泻性大肠杆菌的特异性吸收峰；具体结果见表2。结果显示，在mPCR反应体系中，a.6种血清型的肠致病性大肠杆菌(EPEC)全部扩增出了6》目的基因片段，而其他非EPEC菌株则全部为阴性结果(附图l);b.3个血清型的4株肠产毒性大肠杆菌(ETEC)全部扩增出了目的基因片段，而非ETEC菌株则全部为阴性结果(附图2);c.2株肠出血性大肠杆菌(EHEC)0157:H7全部扩增出^Z)E目的基因片段，而非EHEC菌株则全部为阴性结果(附图3);d.1株肠侵袭性大肠杆菌(E正C)扩增得到/"/目的基因片段，其余非EIEC菌株全部为阴性结果(附图4)。上述结果表明本实验设计的四重引物适用于inPCR-DHPLC检测致泻性大肠杆菌，具有很高的种间特异性。_表2_a,,显示阳性PCR结果的菌株数/测试菌株数困休咏卿/a/EnteropathogenicOlll:nmATCC43887i/i0/10/10/1086:K61CIQai/i0/10/10/1026:腿CIQi/i0/10/10/1044:K74CIQi/i0/10/10/10119:K69CIQi/i0/10/10/1O114:K90CIQi/i0/10/10/1Enterotoxigenic078:H11ATCC354010/11/10/10/1O78:K80CIQ0/22/20/20/2025:K19CIQ0/11/10/10/1Enterohemorrhagicco//0157:H7ATCC351500/10/11/10/10157:H7CIQ0/10/11/10/1Enteroinvasive0124達ATCC438930/10/10/11/1foc/zm'c/n'"co/ZATCC259220/10/10/10/1foc/^"'Cco/iATCC83790/10/10/10/1foc/zm'c/;/"co//ATCC117750/10/10/10/1&c/2mc*/n'aco/iCIQ0/50/50/50/55^/附0/7^//仏/)^/n'mwn't/mATCC494160/10/10/10/1&/,we〃"，c/zo/eraeATCC107080/10/10/10/1e她n7i&ATCC130760/10/10/10/1C7加6a"er加i/m/z7ATCC80900/10/10/10/1幼脉W".Zfec固.ATCC120220/10/10/10/1/Vo^w51m/ra6///51ATCC292450/10/10/10/1vw/,&CMCC490270/10/10/10/1C"附p少/oZ""e「/咖w/ATCC332910/10/10/10/1lfera'm'ae她wco/Z"'caATCC96100/10/10/10/1实施例3、四种致泻性大肠埃希氏菌的mPCR-DHPLC检测结果分别取肠产毒性大肠杆菌(ETEC)ATCC35401、肠致病性大肠杆菌(EPEC)ATCC43887、肠出血性大肠杆菌(EHEC)ATCC35150、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)ATCC43893标准菌株在36。C培养18h，测其OD值，估计其菌数，然后按10"，10—2，10—3等倍数梯度稀释，取几个适宜梯度的菌液进行平板计数，重复2次，取平均值确定其菌浓度。将适当浓度的4种菌液混合，并按1(T1，10'2进行倍数梯度稀释，配成混合菌液肠出血性大肠杆菌8CFU/mL，肠侵袭性大肠杆菌6CFU/mL，肠产毒性大肠杆菌7CFU/mL，肠致病性大肠杆菌6CFU/mL。采用试剂盒提取法制备基因组DNA，制备待测样品DNA溶液，采用上述条件进行mPCR-DHPLC分析检测。测量结果的DHPLC谱图如附图5所示。由该结果可见，四种致泻性大肠埃希氏菌的mPCR-DHPLC行为具有明显的差异，本发明的试剂盒及检测方法可以在一次检测中非常有效地将染菌样品中的这四种菌区分识别。实施例4、mPCR-DHPLC检测灵敏度试验分别取肠产毒性大肠杆菌(ETEC)ATCC35401、肠致病性大肠杆菌(EPEC)ATCC43887、肠出血性大肠杆菌(EHEC)ATCC35150、肠侵袭性大肠杆菌(E正C)ATCC43893标准菌株在36。C培养18h，测其OD值，估计其菌数，然后按10"，10—2，10—3等倍数梯度稀释，取几个适宜梯度的菌液进行平板计数，重复2次，取平均值确定其菌浓度。将适当浓度的4种菌液混合，并按10"，10—2进行倍数梯度稀释，形成三个混合菌液系列(如表3)，每个系列梯度菌液采用试剂盒提取法制备模板DNA，进行PCR-DHPLC检测，确定反应体系的灵敏度。表3肠出血性大肠杆肠侵袭性大肠杆肠产毒性大肠杆肠致病性大肠杆菌(CFU/mL)菌(CFU/mL)菌(CFU/mL)菌(CFU/mL)系列1800600700600系列280607060系列38676结果表明，在四种致泻性大肠杆菌的混合液中，当菌液浓度为肠产毒性大肠杆菌(ETECATCC35401)7CFU/mL、肠致病性大肠杆菌(EPECATCC43887)6CFU/mL、肠出血性大肠杆菌(EHECATCC35150)8CFU/mL、肠侵袭性大肠杆菌(EIECATCC43893)6CFU/mL时，各致泻性大肠杆菌依然可被检出。12实施例5、应用mPCR-DHPLC的食品检测试验自2007年10月至2008年5月，将上述建立的致泻性大肠埃希氏菌的mPCR-DHPLC检测试剂盒及检测方法用于9大类1256份进出口农畜产食品样品中致泻性大肠杆菌的实际检验，同时采用国家标准方法(GB/T4789.6-2003)进行比较。对mPCR-DHPLC检测结果结果的判断标准是将待测样品的PCR-DHPLC检测谱图与阴性对照及阳性对照(标准菌株)的PCR-DHPLC检测谱图比较，当阴性对照无任何特异性吸收峰出现，而阳性对照出现位置正确的特异性吸收峰时，若被检样品在与阳性扩增的同一位置上出现特异性吸收峰，且峰高>2mV时，判定为阳性；若被检样品在该位置无特异性吸收峰，则判定为阴性；若被检样品在与阳性扩增的同一位置上出现特异性吸收峰，但峰高<2mV时，则为可疑样品，需要通过其他方法进行确认。试验统计结果如表4:表4统计结果mPCR-DHPLC检测结果GB/T4789.6-2003检测结果样本量12561256ETEC9ETEC9K口,Mf仕里EPEC11EPEC11阳'任多口采EHEC0EHEC0EIEC1E正C1阴性结果12351235阳性率％1.67%1.67%经统计，用mPCR-DHPLC方法检出的21份阳性样本采用经典的国家标准(GB)方法验证，均证实为阳性。mPCR-DHPLC方法检测出的阴性结果与GB方法结果符合。试验中mPCR-DHPLC方法吻合率为100%,显示该方法具有广泛而且良好的适用性。本实施例中，使用GB/T4789.6-2003的方法，检测每个样品平均总耗时(包括样品制备)96h，检测耗时(不包括样品制备)94h;使用mPCR-DHPLC方法，检测每个样品平均总耗时(包括样品制备)25h，检测耗时(不包括样品制备)0.5h。1权利要求1、致泻性大肠埃希氏菌检测试剂盒，其特征在于1mL检测溶液含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl2、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及四种致泻性大肠埃希氏菌引物对各10μM；其中，致泻性大肠埃希氏菌的特异性引物序列如下<tablesid="tabl0001"num="0001"wi="161"></tables>2、致泻性大肠埃希氏菌的检测方法，其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤①取lul待测样品DNA溶液，加入10ul试剂盒溶液和14ul灭菌超纯水，总体积25ul;5000r/min离心10s，然后按下列参数进行PCR扩增预变性94°C，3min;进入循环94t:变性60s，56"C退火60s，72。C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min;②DHPLC分析色谱柱PS-DVB&C18DNASep色谱柱(4.6mmx50mm，粒度3pm);柱温50°C;流动相(体积比)0.0min，55.0%缓冲溶液A，45.0%缓冲溶液B;·0.5min，50.2%缓冲溶液A，49.8%缓冲溶液B;3.6min，41.8%缓冲溶液A，58.2%缓冲溶液B;6.8min，38.2%缓冲溶液A，61.8%缓冲溶液B;··9.9min，36.3%缓冲溶液A，63.7%缓冲溶液B;13min，35.0%缓冲溶液A，65.0%缓冲溶液B;其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为O.IMTEAA水溶液与乙腈按体积比3:1的混合溶液；流速0.9mL/min;检测器荧光检测器(光源150WXenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽15.3nm;检测灵敏度在波长350nm积分2s);上样量PCR产物5)iL。全文摘要一种用于食品微生物污染检测及监控的致泻性大肠埃希氏菌检测试剂盒及其检测方法，所述的试剂盒中，每1mL检测溶液含10mMTris·Cl、50mMKCl、25mMMgCl<sub>2</sub>、dNTP各2.5mM、TaqDNA聚合酶5U/μL及用于多重PCR的4对上、下游引物各10μM。本方法采用致泻性大肠杆菌的毒力因子基因检测四种致泻性大肠杆菌，可以检测出致泻性大肠杆菌的同时进行四种类型的区分。检测四种致泻性大肠杆菌的检测下限低于10CFU/mL，灵敏度高。此外，本方法检侧时间比传统方法短，方法更加简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。文档编号C12Q1/68GK101665823SQ20091001079公开日2010年3月10日申请日期2009年3月20日优先权日2009年3月20日发明者徐君怡申请人:徐君怡