专利名称：一种微生物油脂的分离方法
技术领域：
本发明涉及分离提取油脂的方法，是一种从产油微生物发酵液中分离提取油脂并 联产菌渣的方法，属于生物工程下游后处理技术领域。
背景技术：
某些微生物，如酵母菌、霉菌、藻类等在一定条件下将有机物转化为脂肪酸甘油酯 并贮存在细胞内，其中胞内油脂含量可超过生物总量20%以上的菌株称为产油微生物。某 些产油微生物菌属以糖质原料为碳源的培养基发酵，能够积累占其细胞干重70%以上的油 月旨(Li, Y. ；Zhao, Ζ. ；Bai,F. Enzyme Microb. Technol.，2007，41，312-317)。利用发酵法得 到的油脂称为微生物油脂，又称为单细胞油脂。部分微生物油脂的脂肪酸组成和常见的植 物油脂如菜籽油、棕榈油、大豆油等相似，主要含有棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸及其它 长链多不饱和脂肪酸等。利用微生物生产油脂具有不受季节和气候的影响、生产原料来源 广泛、生产周期短、产品高值化等优点。目前国际上微生物油脂大规模工业化生产仍未实现，其主要原因是成本比较高。 微生物油脂的成本主要包括原料成本和分离提取成本。原料成本的高低取决于菌种的生 产效率及所采用的发酵工艺，而分离提取成本则主要取决于采用的工艺。由于微生物油 脂大多存在于菌体细胞内，传统技术都需用离心或过滤等方法先从发酵液中分离出菌体， 再按照植物油脂的提取类似的方法进行提取，主要提取方法包括压榨法(Matthews R F， Braddock R J. Food Technology，1987，41 :57_61)、超临界提取法(Sovova H, Zarevucka Μ, Vacek Μ, et al. J. Supereritical Fluids，2001，(20) 15-28)和有机溶剂萃取法(Biigh E G，Dyer W J. J. Biochem. Physiol. ,1959,37 :911_917)等。这些方法的缺点就是在提取 前要进行固液分离，但由于产油微生物发酵后期具有菌体浓度高，粘度高，菌体密度低等特 性，菌体分离回收困难，成本高。另外这些方法的缺点还有压榨法损失较大，提取率不高， 提取前要对得到的菌体烘干后才可以进行，所需设备较多；超临界提取法设备投资大，成本 高；常规的有机溶剂法需对分离后的湿菌体中的微生物油脂进行细胞破碎后进行提纯，破 碎的方法有冻融法(W000/13660)、酶水解法(W002/10423)和酸热法(CN1923960A)等，这些 方法有些对细胞进行破碎处理需用的能耗较大，需要的步骤繁琐；其中酸处理法对菌体进 行破壁处理，造成菌体中蛋白等生物分子水解或降解，降低了菌渣的应用价值，经济性差。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效地从产油微生物发酵液中提取微生物油脂并联产 菌渣的方法，简化工艺过程，缩短操作周期，降低生产成本，促进资源综合利用。本发明的方 法可在微生物油脂大规模工业化生产中广泛应用。本发明通过下述技术方案予以实现(1)直接将产油微生物发酵液与有机溶剂按体积比1 0.25 1 5的比例混 合，在20°C 90°C下浸提10分钟 24小时，得到浸提混合物料；
(2)对浸提混合物料进行固液分离操作，得到有机溶剂相、水相和固相物料；(3)有机溶剂相按常规方法除去有机溶剂，得到微生物油脂；(4)固相物料经干燥得到菌渣。本发明使用的有机溶剂包括但不限于氯仿、二氯甲烷、甲苯、二甲苯、石油醚、含有 4 12个碳原子的脂肪醇、含有1 12个碳原子的脂肪醇的酯、四号溶剂、六号溶剂或者它 们之间的混合物。并且这些有机溶剂中还可以含有体积百分含量不超过60%的甲醇、乙醇 或丙醇。本发明使用的固液分离操作为离心、过滤、沉降或者它们的必要组合。本发明从有机溶剂相中除去有机溶剂得到微生物油脂的方法为蒸馏或蒸发。本发明使用的产油微生物为经发酵培养后菌体油脂含量可超过细胞干重20% (w/w)的真菌、细菌或微藻。它们包括但不限于，产油真菌，如Rhodosporidium toruloides, Cryptococcus curvatus、Yarrowia lipolytica、Rhodotorula glutinis、Rhizopus arrhizus、Lipomyces starkeyi> Mortiere 1 Iaisabellina> Mucor circinelloides 禾口 Cunninghamella ；产油细菌，如 Croynebacterium、Nocardia 禾口 Mycobacterium ；产油微 藻， 如 Botryococcusbraunii、Crypthecodinium cohnii、Chlorellaprotothecoides> Nannochloropsis sp.禾口 Schizochytrium limacinum。本发明使用的产油微生物发酵液为产油真菌、细菌或微藻在液体培养条件下发酵 培养得到的含有菌体的醪液。本发明使用菌体材料的实际油脂含量参照文献(Li，Y. ；Zhao, Ζ. ；Bai, F. Enzyme Microb. Technol.，2007，41，312-317)的方法测定，并以此为基准计算其它方法的油脂提取率。本发明的有益效果是1)与传统的微生物油脂提取方法相比，本发明使用全发酵 液直接萃取，省去了从发酵液回收菌体的固液分离操作和菌体干燥等预处理过程，简化了 工艺步骤，缩短了操作周期；2)本发明通过提取细胞内油脂，可以有效降低发酵液粘度，改 变菌体密度，有助于固液分离操作和菌渣回收；3)本发明无需对菌体进行破壁处理，降低 了能耗，减少了腐蚀性化学试剂的使用；4)本发明菌渣污染物少，回收率高，提高了油脂发 酵过程的技术经济性。总之，本发明技术简单有效，设备投资少，可连续操作，能耗低，有利 于大规模工业化生产。
图1为本发明微生物油脂提取并联产菌渣工艺流程简图。
具体实施例方式以下实施例选取了一些典型的产油微生物菌种，有助于了解本专利，但不以任何 形式限制在其它菌株材料上应用本发明。实施例1^ M JC M (Li, Y. ；Zhao, Ζ. ；Bai, F. Enzyme Microb. Technol. ,2007,41 312-317)所述的方法，将生长于YEPD培养基中的产油酵母Rhodosporidiumtoruloides AS 2. 1389(菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)按10%的接种量接入到发酵培养基中，30°C，通气量0. 8vvm，补料1000g/L的葡萄糖500ml五次，培养120h后得到细胞干重 92g/L(油脂含量60. 1%)的发酵液。取上述发酵液50ml，加入50ml氯仿，在20°C下，搅拌 浸提lh，沉降分层，取下层有机溶剂相，蒸馏后干燥得到油脂2. 06g，油脂提取率74. 6%。剩 余物离心处理，得到固体相，经干燥得菌渣2. 31g。实施例2按照文献(黄建忠，施巧琴，周晓兰，等。微生物学通报，1998，(4) :187_191)所 述的方法，将培养28h产油霉菌Mortierella isabellina AS 3. 3410 (菌株来源于中国普 通微生物菌种保藏管理中心)种子液以10%的接种量接入到发酵培养基中，280rpm，25°C 下培养701!，得到细胞干重348/1(油脂含量47.2%)的发酵液。取上述发酵液25ml，加入 75ml氯仿甲醇2 1(V/V)，在70°C下，搅拌浸提lh，离心后取下层有机溶剂相，蒸发后干 燥得到油脂0. 37g，油脂提取率92 %。上层过滤得到湿菌渣，干燥后残渣质量0. 25g。实施例3参照实施例1所述的方法，补料两次，发酵62h后得到细胞干重48g/L (油脂含量 55.2%)的产油酵母Lipomyces starkeyi AS 2. 1560 (菌株来源于中国普通微生物菌种保 藏管理中心)发酵液100ml，加入25ml六号溶剂，在30°C下，搅拌浸提IOmin后沉降分层， 取上层溶剂相，干燥后蒸发得到油脂0.72g，油脂提取率27%。下层相离心处理，得到固体 相，干燥后菌渣2. 80go实施例4按照文献(王菊芳，梁世中，吴振强，等。华南理工大学学报(自然科学版)2008， 28(10) 28-31)所述的方法，将培养 24h 隐甲藻 Crypthecodinium cohnii ATCC 30556 (菌 株来源于美国普通微生物菌种保藏管理中心)的种子液以5%的接种量接入到发酵培养基 中，在25°C，170rpm条件下培养65h后得到细胞干重15g/L(油脂含量30. )的发酵液。 取上述发酵液50ml，加入50ml正辛醇，在80°C下，搅拌浸提2h，离心取上层有机溶剂相，干 燥后蒸馏得到油脂0. 158g，油脂提取率70. 1%。剩余物继续离心处理，得到固体相，干燥得 到菌渣0. 49g。实施例5参照实施例1所述的方法，补料四次，发酵90h后得到细胞干重79g/L (油脂含量 49% )的产油酵母Rhodotorula glutinis AS 2. 703 (菌株来源于中国普通微生物菌种保 藏管理中心)发酵液。取上述发酵液50ml，加入200ml 二甲苯，在90°C下，搅拌浸提Ih后 沉降分层，取上层溶剂相，蒸发后干燥得到油脂l.Olg，油脂提取率52%。将下层相离心处 理，收集固体相，干燥得到菌渣2. 63g。实施例6参照实施例4所述的方法，发酵54h后得到细胞干重20g/L(油脂含量37. 4% ) 的产油微藻Botryococcus braunii LB572 (菌株来源于美国德克萨斯大学)发酵液。取上 述发酵液30ml，加入100ml石油醚，在50°C下，搅拌浸提20min后离心取上层溶剂相，蒸发 后干燥得到油脂0. lg，油脂提取率42.6%。继续去除中层水相，收集固体相，干燥得到菌渣 0. 39g。实施例7参照实施例1所述的方法，补料三次，发酵72h后得到细胞干重70g/L (油脂含量50. 3% )的产油酵母Lipomyces starkeyi AS 2. 1560 (菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心)发酵液。取上述发酵液50ml，加入125ml氯仿乙酸乙酯3 1(V/V)，在 35°C下，搅拌24h后沉降分层，取下层有机溶剂相，蒸发后干燥得到油脂1. 43g，油脂提取率 81%。将剩余物离心处理，得到固体相，干燥后得到菌渣1. 35g。实施例8参照实施例4所述的方法，发酵64h后得到细胞干重21. 7g/L(油脂含量24. 3% ) 的产油小球藻Chlorella protothecoides CS-41 (菌株来源于澳大利亚CSIRO微藻研究中 心)发酵液。取上述发酵液50ml，加入IOOml四号溶剂，在80°C下，搅拌2h，沉降分层，取上 层溶剂相，蒸发后干燥得到油脂0. 14g，油脂提取率53.2%。下层水相过滤处理，滤饼干燥 后得到菌渣0. 68g。实施例9参照实施例1所述的方法，补料三次，发酵130h后得到细胞干重65g/L (油脂含量 62.7%)的产油酵母Yarrowia lipolytica AS 2. 1398 (菌株来源于中国普通微生物菌种 保藏管理中心)发酵液。取上述发酵液50ml，加入150ml氯仿，在30°C下，搅拌1.5h后沉 降分层，取下层溶剂相，蒸发后干燥得到油脂1. 73g，油脂提取率85%。离心处理除去有机 溶剂相的剩余物，收集固体相，干燥得到菌渣0. 95g。
权利要求
一种微生物油脂的分离方法，其特征在于是从产油微生物发酵液原料中分离提取油脂并联产菌渣的方法，将产油微生物发酵液与有机溶剂混合浸提一定时间，进行固液分离操作，对有机溶剂相去除溶剂，得到油脂；对固体相进行干燥，得到菌渣。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、甲苯、二 甲苯、石油醚、含有4 12个碳原子的脂肪醇、含有1 12个碳原子的脂肪醇的酯、四号溶 剂或六号溶剂中的一种或者一种以上的混合物。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述有机溶剂中可以添加甲醇、乙醇 或丙醇中的一种或多种形成混合溶剂，添加后它们于混合溶剂中的体积百分含量< 60%。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述浸提操作条件为，操作温度20°C 90°C、操作时间10分钟 24小时。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述固液分离操作为离心、过滤、沉降中 的一种或者一种以上的必要组合。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵液与有机溶剂的体积比为 1 0. 25 1 5。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述有机溶剂的去除方法为蒸馏或蒸发。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的产油微生物发酵液为产油真菌、细 菌或微藻在液体培养条件下发酵培养得到的含有菌体的醪液。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的产油微生物为在一定培养条件下 可在胞内积累含量超过细胞干重20%油脂的真菌、细菌或微藻。
全文摘要
本发明公开了一种微生物油脂的分离方法，是从产油微生物发酵液中直接分离提取油脂并联产菌渣的方法，属于生物工程下游后处理技术领域。本发明的技术方案如下将产油微生物发酵液与有机溶剂按一定比例混合拌浸提一定时间，进行固液分离操作，对有机溶剂相去除溶剂，得到油脂；对固体相进行干燥得到菌渣。本发明工艺简单、操作条件温和、油脂提取收率高、菌渣质量好、耗能低，有利于进行规模化工业生产。
文档编号C12P7/64GK101824440SQ20091001056
公开日2010年9月8日 申请日期2009年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者赵宗保, 赵鑫 申请人:中国科学院大连化学物理研究所