专利名称：一种分离产阿魏酸酯酶微生物的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物的分离方法，具体地说是一种分离产阿魏 酸酯酶微生物的方法。本发明还涉及用于该方法的专用筛选培养基。
背景技术：
秸秆和饲草干物质中约30% ~80%为细胞壁成分，然而，反刍 动物对这些细胞壁的消化利用率不超过50%。因此，细胞壁成为秸 秆和伺草利用的瓶颈因素。研究表明，饲料细胞壁木质素中阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等分子以酯键与半纤维素支链形成的致密网 状交联结构，从空间上限制了瘤胃微生物对细胞壁中纤维素和半纤维 素的有效降解，阿魏酸酯酶已被推测认为是消除细胞壁降解限制因子 的关键酶之一。反刍动物的瘤胃及其他草食动物的盲肠中的微生物是 一个天然丰富的酶和功能基因库，因此，从其中筛选出阿魏酸酯酶高 产菌株，对于合理有效开发瘤胃微生物遗传资源、提高农副产品伺料 利用效率是很有必要的。现在，动物胃肠厌氧真菌的分离筛选多采用亨盖特厌氧滚管技 术，此技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃 厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术，至今已逐渐发展成为研究厌氧 微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、 专性厌氧菌的一种极为有效的技术。目前，对于已报道的动物胃肠中 产阿魏酸酯酶的厌氧真菌发现过程多分为两步首先分离单菌，然后 分析此菌的特性，发现其可分泌阿魏酸酯酶。对于以筛选出产阿魏酸 酯酶的厌氧真菌为目的的研究，这过程工作量大，目的不够明确，缺 乏针对性，步骤繁瑣，费时费力。最为突出的表现为在利用普通厌 氧真菌体外培养基筛选单菌的过程中，需要经过一系列的酶活试验检测而无法直观的判断筛选的菌落是否具有产阿魏酸酯酶的能力。 发明内容本发明的目的在于针对上述不足提供一种快速有效适于大规模 分离产阿魏酸酯酶微生物的方法。本发明的另一目的在于提供一种用 于该方法的专用培养基。本发明的方法用以阿魏酸乙酯作为碳源的培养基来培养样品，产 阿魏酸酯酶的微生物可以利用阿魏酸乙酯作为碳源，从而能够形成菌 落，而不能利用阿魏酸乙酯的微生物则不能生长，从而达到分离产阿 魏酸酯酶微生物的目的。本发明所用的基础培养基可以根据筛选对象的种类不同而作相 应的调整。例如，筛选对象为厌氧真菌时，可釆用含瘤胃液的复合培养基；筛选对象为好养真菌时，可釆用沙氏培养基等；筛选对象为细 菌时可采用M9CA培养基等。配制时，将这些培养基中的碳源用阿魏 酸乙酯替换，其它成分不变。本发明筛选培养基中阿魏酸乙酯的终浓度为1 ~20pM，对于液体 培养基而言，优选为2iuM，对于固体培养基而言优选为9pM。此外，可以将基础培养基部分(即不含阿魏酸乙酯的其它组分) 与阿魏酸乙酯单独配制，基础培养基部分分装于亨氏管中灭菌后保存 于4。C条件下，保存1个月后，仍可使用；阿魏酸乙酯部分配成较高浓 度后保存于-2(TC条件下，保存2个月后，仍可使用；在接种前将二者 混合。目前常见的产阿魏酸酯酶微生物是动物胃肠厌氧真菌，在筛选 时，取新鲜微生物样品，将其稀释成系列浓度，采用浇混接种法将各 浓度样品接种于专用固体筛选培养中，39。C培养。为进一步提高筛选效率，并获得纯化的单菌落，可采用下述步骤 进行筛选分离1)取新鲜微生物样品，接种于常规液体培养基中，梯度稀释，39°C培养；2) 将存活于最高稀释度培养基中的菌接种于常规液体培养基中进行传代，39'C培养；3) 取此菌接种于专用液体筛选培养基中，39'C培养；4) 取此菌接种于专用固体筛选培养基中，于冰上滚管，39。C培养;5) 将单菌落接种于专用液体筛选培养基中，39'C培养；6) 重复3)和4), 3~4次后，即可获得单菌。 在上述分离产阿魏酸酯酶厌氧真菌的方法中，步骤3)和5)中专用液体筛选培养基中阿魏酸乙酯的浓度为l-20iiiM，优选为2pM; 步骤4)中专用固体筛选培养基中阿魏酸乙酯的浓度为l-20pM,优 选为9pM;步骤l)、 2)和3)中培养时间为3-10天，视菌生长状况 而定；步骤4)中培养时间为1-3天，视菌生长状况而定；步骤5) 中培养时间为2-5天，视菌生长状况而定。上述常规液体培养基是指正常碳源的培养基。上述培养方法步骤l)中，所取的新鲜微生物样品可按照一定的 比例接种于常规液体培养基中，例如可以按照体积比1: 5~15进行接 种。上述步骤2)中的接种也可按照一定的比例进行接种，例如可以 按照体积比l: 5 15进行接种。用上述方法，在24天内从奶牛瘤胃微生物中筛选出2株产阿魏 酸酯酶厌氧真菌，获得了满意的实验效果，证明该筛选培养基可以将 菌的分离与阿魏酸酯酶活性的定性测定结合在一步中完成，大大简化 产阿魏酸酯酶厌氧真菌的筛选过程，适合大规模的真菌筛选工作。该 分离产阿魏酸酯酶厌氧真菌的方法大大缩短了真菌筛选的时间，可操 作性强。本发明方法在饲料工业中具有较高的实际应用价值。
图1为利用本发明的专用筛选培养基筛选到的肉牛瘤胃微生物中产阿魏酸酯酶的厌氧真菌1;图2为真菌l在显微镜下放大40倍时的形态； 图3为利用本发明的专用筛选培养基筛选到的肉牛瘤胃微生物 中产阿魏酸酯酶的厌氧真菌2;图4为真菌2在显微镜下放大40倍时的形态。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。除非特别指明，本 发明中所用的实验方法和试剂均为本领域技术人员所公知的方法和 试剂。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明 的保护范围。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明精神和实质 的前提下，对这些实施方案中的培养基组分、含量、培养条件、筛选 过程进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。实施例l液体筛选培养基的制备向不含主要碳源(如葡萄糖)的常规液体筛选培养基中添加阿 魏酸乙酯，使阿魏酸乙酯的浓度达到2|iM。如釆用如下配置的液体 筛选培养基，其每1000ml中含蛋白胨l.Og,酵母膏1.0 g， NaHC03 7.0 g，粉碎的小麦秸秆7g，溶液I165ml，溶液II165ml，无细胞瘤 胃液170ml， L-半胱氨酸盐酸盐1.7g,刃天青(0.1%w/v) l.Oml，蒸 馏水500 ml;溶液I 1000 ml中含KH2P043 g， (NH4)2S04 3 g , NaC16g， CaCl2.2H2O0.4g, MgS04.7 H20 0.6 g;溶液II 1000 ml中 含K2HP04 4 g。接种前加入青霉素(1600 IU/mL)和链霉素(2000 IU/mL)，抑制细菌。实施例2固体筛选培养基的制备向不含主要碳源(如葡萄糖)的常规固体筛选培养基中添加阿 魏酸乙酯，使阿魏酸乙酯的浓度达到9pM。如采用如下配置的固体 筛选培养基，其每1000 ml中含蛋白胨1.0 g,酵母膏1.0 g, NaHC03 7.0 g，琼脂15g，溶液1165 ml,溶液II 165 ml,无细胞瘤胃液170 ml,L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，刃天青(0.1%w/v) l.Oml，蒸馏水500ml; 溶液I 1000 ml中含KH2P043 g， (NH4)2S04 3 g , NaCl 6 g, CaCl2.2 H2O0.4g， MgSO4-7H2O0.6g;溶液II 1000ml中含K2HP044g。 接种前加入青霉素(1600IU/mL)和链霉素(2000IU/mL)，抑制细菌。 实施例3牛瘤肾微生物中产阿魏酸酯酶厌氧真菌的筛选分离 1) 通过奶牛瘤胃瘘管釆集新鲜瘤胃液样品，用注射器迅速将lmL接种于含9mL常规液体体外培养基的亨氏管中，梯度稀释，39°C培养4天；2 ) 按1:9的体积比将存活于最高稀释度的亨氏管中的菌接种于常规液体体外培养基中进行传代，39'C培养4天；3 ) 取此菌接种于实施例1制备的液体筛选培养基中，39。C培养3天；4) 将其接种于实施例2制备的固体筛选培养基中，于冰上滚管， 39。C培养2天；5 ) 将单菌落接种于实施例1制备的液体筛选培养基中，39'C培养 3天；6) 重复4)和5),大约4次后，获得单菌，经鉴定共获得2株产 阿魏酸酯酶的厌氧真菌。真菌l菌落颗粒状，没有发现菌丝；真菌2 菌落呈放射状，菌体较大。
权利要求
1、一种用于筛选产阿魏酸酯酶微生物的筛选培养基，其特征在于，所述培养基的碳源为阿魏酸乙酯。
2、 根据权利要求1所述的筛选培养基，其特征在于，所述微生物为厌氧真菌。
3、 根据权利要求1所述的筛选培养基，其特征在于，所述阿魏 酸乙酯的终浓度为l-20pM。
4、 根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述筛选培养 基为液体培养基时，阿魏酸乙酯的终浓度为2pM，所述筛选培养基 为固体培养基时，阿魏酸乙酯的终浓度为9pM。
5、 权利要求l-4任一项所述培养基在筛选分离产阿魏酸酯酶微 生物中的应用。
6、 一种分离产阿魏酸酯酶微生物的方法，其利用权利要求1所 述的培养基培养样品。
7、 一种分离产阿魏酸酯酶厌氧真菌的方法，包括以下步骤1) 取新鲜微生物样品，接种于常规液体培养基中，梯度稀释， 39。C培养；2) 将存活于最高稀释度培养基中的菌接种于常规液体培养基 中进行传代，39t:培养；3) 取此菌接种于液体筛选培养基中，39-C培养；4) 取此菌接种于固体筛选培养基中，于冰上滚管，39。C培养;5) 将单菌落接种于液体筛选培养基中，39"C培养；6) 重复步骤3)和4), 3~4次后，即可获得单菌， 其中所述液体筛选培养基和固体筛选培养基均是以阿魏酸乙酯作为碳源的厌氧真菌培养基。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤3)和5) 中液体筛选培养基中阿魏酸乙酯的终浓度为l-20^M;步骤4)中固体筛选培养基中阿魏酸乙酯的终浓度为l-20pM;步骤1)、2)和3) 中培养时间为3-10天；步骤4)中培养时间为l-3天；步骤5)中培 养时间为2-5天。
9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤3 )和5 ) 中液体筛选培养基中阿魏酸乙酯的终浓度2pM;步骤4)中固体筛选 培养基牛阿魏酸乙酯的终浓度为9|liM。
全文摘要
本发明提供了一种分离产阿魏酸酯酶微生物的方法，该方法以阿魏酸乙酯作为碳源的培养基来培养样品，产阿魏酸酯酶的微生物可以利用阿魏酸乙酯作为碳源，从而能够形成菌落，而不能利用阿魏酸乙酯的微生物则不能生长，从而达到分离产阿魏酸酯酶微生物的目的。本发明将微生物的分离与阿魏酸酯酶活性的定性测定结合在一步中完成，大大简化产阿魏酸酯酶微生物的筛选过程，适合大规模的筛选工作，缩短了筛选时间，可操作性强。本发明在饲料业、造纸业、香料生产、制药原料生产中具有较高的实际应用价值。
文档编号C12N1/14GK101215525SQ20071030476
公开日2008年7月9日 申请日期2007年12月29日 优先权日2007年12月29日
发明者群 岳, 杨红建 申请人:中国农业大学