专利名称：发光细菌法快速检测海水中bod的方法
技术领域：
本发明涉及发光细菌快速检测海水中BOD的方法。
背景技术：
生化需氧量(BOD)反映了水体中可被生物降解的有机污染物含量，是海水水质检测的 重要指标。目前国内外普遍采用的BOD测定方法是五闩培养法，即BODs法，但BODs法存 在操作复杂、耗时耗力、实效性差等缺点。近20年来，对淡水BOD快速测量或在线测量技 术研究取得很大进展，快速测量方法是基于利用微生物的初始氧化速率代替五FI培养法的绝 对耗氧量，以縮短测量时间，实现快速测量。上世纪90年代国外已经开发出商品化的BOD 快速测量仪，但是淡水BOD快速测量的检测限较高，而海水中的BOD值基本在5mg/L以下， 检测较困难，因此，国内外相继开展了海水BOD快速测量技术的研究。
发明内容
本发明针对上述问题，提供了一种发光细菌快速检测海水中BOD的方法。
本发明的技术方案是发光细菌法快速检测海水中BOD的方法，具体歩骤如下
一、 发光细菌的培养
菌种采用明亮发光杆菌T3变种(户/wto6a"m',p/ww/ww訓)，制备发光细菌新鲜菌悬
液
(1) 斜面菌种培养在新鲜斜面上接出第一代斜面，25。C士0.5t:培养24h后立即转接第 二代斜面，25。C士0.5。C培养24h后再转接第三代斜面，25。C士0.5。C培养24h后备用。
(2) 摇瓶菌液培养取第三代斜面菌种近一环，接种于装有30ml细菌培养液的100ml 三角烧瓶中，25。C士0.5。C， 160r/min下培养24h备用。
(3) 将培养后的发光细菌新鲜菌悬液稀释至每毫升108个~109个细胞，初始发光度不低 于800mV，备用。
斜面和菌液的营养基为
胰蛋白胨0.5gNaCl 3gNa2HP04 0.5g KH2P04 0.5g
酵母0.5g 甘油0.3g蒸馏水100ml 固体培养基加琼脂1.69g
二、 BOD标准溶液的制备
各自称取0.15g葡萄糖和谷氨酸溶解于lL的人工海水中，人工海水的配方为 NaCl 20g MgS04 3.6gMgCl2 7.2g无水CaCl2 0.7g蒸馏水 1000ml 。
配得溶液的BOD值相当于220mg/L，将溶液稀为lmg/L、 2 mg/L、 4 mg/L、 6 mg/L、 8 mg/L、10mg/L等6个梯度。
三、发光细菌发光度增加量的测定
测定时的室温要控制在2o~25°c，同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过irc。
取若干试管，给每支管中加0.6ml歩骤一培养的发光细菌菌液，部分作为对照管的试管中放0.05ml人工海水，作为样品管的试管中放0.05mlBOD标准溶液。20min后放入发光光度计中检湖!j。
发光细菌发光度的增加量=样品管-空白管
本发明的有益效果是本发明可以得到发光细菌发光度的增加量与BOD浓度的标准曲线，并且在BOD浓度范围在0~10mg/L内时有良好的线性关系，满足海洋中BOD值的检测范围，能够实现海水BOD的快速检测。
图1为实施例1增加的发光度与BOD浓度的关系标准曲线。
具体实施例方式
实施例1
一、发光细菌的培养
菌种采用明亮发光杆菌T3变种(Moto6a"m'M/n;^(wp;wreww)，制备发光细菌新鲜菌悬
液
(1) 斜面菌种培养在新鲜斜面上接出第一代斜面，25。C士0.5。C培养24h后立即转接第二代斜面，25'Ci0.5。C培养24h后再转接第三代斜面，25。C士0.5。C培养24h后备用。
(2) 摇瓶菌液培养取第三代斜面菌种近一环，接种于装有30ml细菌培养液的100ml三角烧瓶中，25。C士0.5。C， 160r/min下培养24h备用。
(3) 将培养后的发光细菌新鲜菌悬液稀释至每毫升108个~109个细胞，初始发光度不低于800mV，备用。
斜面和菌液的营养基为
胰蛋白胨0.5gNaCl 3gNa2HP04 0.5g KH2P04 0.5g
酵母0.5g 甘油0.3g蒸馏水100ml固体培养基加琼脂1.69g二、 BOD标准溶液的制备
各自称取0.15g葡萄糖和谷氨酸溶解于lL的人工海水中，人工海水的配方为NaCl 20gMgS04 3.6gMgCl2 7.2g无水CaCl2 0.7g蒸馏水 1000ml 。
配得溶液的BOD值相当于220mg/L，将溶液稀为lmg/L、 2 mg/L、 4 mg/L、 6 mg/L、 8 mg/L、10mg/L等6个梯度。
三、 发光细菌发光度增加量的测定
测定时的室温要控制在2o 25°c，同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过irc。
在试管架上按下列方式排列测试管 一侧放对照管，另一侧放样品管(从低载荷率到高载荷率依次排列)，每管3个重复，具体摆放位置见表l。
表l.试管在试管架上的排列
对照管样品管
空白l空白2空白3样l样l样l样2样2样2…样n样n样n
给每支管中加0.6ml的菌液，对照管中放0.05ml人工海水，样品管中放0.05m旧OD标准溶液。20min后放入发光光度计中检测，作出标准曲线，见图l。发光细菌发光度的增加量-样品管-空白管。
权利要求
1、发光细菌法快速检测海水中BOD的方法，其特征在于，该方法具体步骤如下一、发光细菌的培养菌种采用明亮发光杆菌T3变种(Photobacterium phosphoreum)，制备发光细菌新鲜菌悬液(1)斜面菌种培养在新鲜斜面上接出第一代斜面，25℃±0.5℃培养24h后立即转接第二代斜面，25℃±0.5℃培养24h后再转接第三代斜面，25℃±0.5℃培养24h后备用；(2)摇瓶菌液培养取第三代斜面菌种近一环，接种于装有30ml细菌培养液的100ml三角烧瓶中，25℃±0.5℃，160r/min下培养24h备用；(3)将培养后的发光细菌新鲜菌悬液稀释至每毫升108个～109个细胞，初始发光度不低于800mV，备用；斜面和菌液的营养基为胰蛋白胨0.5g NaCl 3g Na2HPO4 0.5g KH2PO4 0.5g酵母0.5g 甘油0.3g 蒸馏水100ml 固体培养基加琼脂1.69g二、BOD标准溶液的制备各自称取0.15g葡萄糖和谷氨酸溶解于1L的人工海水中，人工海水的配方为NaCl 20gMgSO43.6gMgCl27.2g无水CaCl20.7g蒸馏水 1000ml。配得溶液的BOD值相当于220mg/L，将溶液稀为1mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L等6个梯度；三、发光细菌发光度增加量的测定测定时的室温要控制在20～25℃，同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过±1℃。取若干试管，给每支管中加0.6ml步骤一培养的发光细菌菌液，部分作为对照管的试管中放0.05ml人工海水，作为样品管的试管中放0.05mlBOD标准溶液，20min后放入发光光度计中检测。发光细菌发光度的增加量＝样品管-空白管。
全文摘要
本发明涉及发光细菌法快速检测海水中BOD的方法，本发明通过发光细菌作为检验海水BOD的受试生物，同时利用人工海水、葡萄糖、谷氨酸配制BOD标准溶液，解决了以往海水BOD检测中由于检测限过高，给结果带来的影响。
文档编号C12N1/20GK101551335SQ20091001042
公开日2009年10月7日 申请日期2009年2月20日 优先权日2009年2月20日
发明者刘长安, 张世宇 申请人:国家海洋环境监测中心