编码类黄酮途径酶的基因序列及其用途的制作方法

专利名称：编码类黄酮途径酶的基因序列及其用途的制作方法
本申请是申请日为1997年2月28日、申请号为97193973.X、发明名称为“编码类黄酮途径酶的基因序列及其用途”的发明专利申请的分案申请。
本发明一般涉及编码类黄酮途径中代谢酶更具体地，类黄酮3’-羟化酶(下文称为“F3’H”)或其衍生物的基因序列及其它们在植物和其它生物中控制色素形成的作用。
本说明书中作者提及的发表文章的文献目录详情收录在说明书结尾部分。说明书和权利要求书中提及的核苷酸和氨基酸序列的序列鉴定号(SEQ ID NOS)在文献目录后定义。SEQ ID NOS的概述及其所涉及的序列在实施例前提供。
在本说明书全文中，除非上下文另有要求，单词“包含”或其诸如现在时(comprcies)或进行时(comprising)的时态变化将理解为指包括所述元件或整体或元件或整体组但不排除任何其它元件或整体或元件或整体组。
重组DNA技术迅速发展的改进极大地促进了与生物技术有关工业领域的研究和发展。园艺工业已成为该技术最近的受益者，该技术有助于在扦插后表现出衰老延缓的植物和花中形成疾病抗性。也有些注意力集中在控制花的颜色上。
花卉工业致力于形成新的和没的开花植物品种。产生这样的新品种的一个有效的途径是通近控制花的颜色。使用经典育种技术已成功地产生了大多数商业花卉品种的许多颜色。然而，这种方法因受具体种类基因库的局限而受到限制，因此，很少使单一种类具有全色谱的有色品种。另外，传统的育种技术缺乏精确性。花的美学吸引力是诸如形态，香味和颜色的许多因素的组合通过杂交对一种特征的修饰常常牺牲一种同样有价值的特征。在切花和观赏种类中以遗传工程精确改变颜色的能力在产业上将提供有意义的商业机会，它具有迅速的产品转向且其中新颖性是重要的市场特征。
花的颜色主要是由于两种类型的色素类黄酮和类胡萝卜素。类黄酮提供由黄到红到蓝的颜色范围。类胡萝卜素提供橙色或黄色且通常是黄色或橙色花中的主要色素。对花的颜色起主要作用的类黄酮分子是花青苷，它是花青素，花翠素，3’-甲花翠素，甲基花青素，二甲翠雀素和花葵素的糖基化衍生物，且位于液泡中。不同的花青苷可产生明显不同的颜色。花的颜色也受无色类黄酮，金属复合物，糖基化，乙酰化和液泡pH的辅助色素形成作用的影响(Forkmann，1991)。
类黄酮色素的生物合成途径(下文称为“类黄酮途径”)已充分了解并在表示于

图1a和1b中(Ebel和Hahlbrock，1988；Hahlbrock和Grisebach，1979；Wiering和De Vlaming，1984；Schram等，1984；Stafford，1990；van Tunen和Mol，1990；Dooner等，1991；Martin和Gerats，1993；Holton和Cornish，1995)。该途径中第一个参与的步骤涉及3个丙二酰-CoA分子与一个对香豆酰-CoA分子的缩合。该反应由查耳酮合成酶(CHS)催化。该反应的产物2’，4’，4’，6’-四羟基查耳酮正常情况下由查耳酮黄烷酮异构酶(CHI)迅速异构化产生4’，5，7-三羟黄烷酮。4’，5，7-三羟黄烷酮随后由黄烷酮3-羟化酶(F3H)在中央环的3位羟基化产生二氢四羟基黄酮(DHK)。
DHK B环的羟基化方式在决定花瓣颜色中起着关键性作用。B环可在3’处或在3’及5’两处羟基化分别产生二氢栎皮黄酮(DHQ)和二氢杨酶黄酮(DHM)。在该途径中涉及的两个关键酶是类黄酮3’-羟化酶和类黄酮3’，5’-羟化酶，两者均是细胞色素P450类。细胞色素P450酶在自然界中广泛分布，已从脊椎动物，昆虫，酵母，真菌，细菌和植物中分离并测序了它的基因。
类黄酮3’-羟化酶作用于DHK产生DHQ且作用于4’，5，7-三羟黄烷酮产生圣草酚。DHQ的还原和糖基化产生花青素糖苷和甲基花青素糖苷色素，在许多植物种类(例如玫瑰，石竹和菊)中这些色素产生红色和粉红色花色。这些花青苷的合成也可产生其它花色。例如，兰色矢车菊含有花色素苷。在开花植物中控制类黄酮3’-羟化酶活性或类黄酮途径中涉及的其它酶的能力可提供控制花瓣颜色的方法。由此可产生单一栽培品种的不同颜色形式，且在有些情况下，单一种类可产生更宽色谱的颜色 已克隆了编码矮牵牛属类黄酮3’-羟化酶的核苷酸序列(本文称为SEQ ID NO26)(见国际专利申请号PCT/AU93/00127[WO93/2026])。然而，该序列没有能力调节植物中3’-羟基化花青苷的合成。因此，需要鉴定其它有效调节植物中类黄酮化合物羟基化的编码类黄酮3’-羟化酶的进一步的基因序列。更具体地说，需要鉴定有效调节植物中3’-羟化花青苷合成的编码类黄酮3’-羟化酶的进一步的基因序列。
根据本发明，编码类黄酮3’-羟化酶的基因序列已得到鉴定和克隆。本发明的重组基因序列可以通过，例如，从头表达，过度表达，抑制，反义抑制和核酶活性来调节编码该酶的基因的表达。控制植物中类黄酮3’-羟化酶合成的能力可以调节每个花青苷的组成及改变类黄醇和花青苷的相对水平，从而能控制组织的颜色，如花瓣，叶，种子和果实的颜色。下文中描述的本发明涉及花的颜色的控制，但应理解为可延伸到控制其它植物组织比如叶，种子和果实。
因此，本发明的一个方面提供了分离的核酸分子，包含编码类黄酮3’-羟化酶或其衍生物的核酸序列，其中所述的类黄酮3’-羟化酶或其衍生物比SEQ ID NO26所述的核苷酸序列编码的类黄酮3’-羟化酶能更有效地调节植物中类黄酮化合物的羟化。
本文所用的效率涉及类黄酮3’-羟化酶在植物细胞中羟化类黄酮化合物的能力。这给植物提供了类黄酮途径中其它酶的额外底物，从而能通过，例如，糖基化，酰基化和鼠李糖基化进一步修饰该分子以合成有助于形成一系列颜色的各种花青苷。由此，3’-羟基化的花青苷可以得到调节。其效率可以方便地通过选自下列参数的一种或多种参数来估计以产生的mRNA的量测定的转录水平；4’，5，7-三羟黄烷酮和/或DHK的羟基化水平；以合成的翻译产物的量测定的mRNA翻译水平；DHQ或DHM的花青苷衍生物的合成水平；对组织如，花，种子，叶或水果的颜色的影响程度。
本发明的另一方面是关于分离的核酸分子，包含定位于矮牵牛属中名为Ht1或Ht2的遗传基因座上或其它有花植物种类相同的这类基因座上的核苷酸序列，其中所说的分离的核酸分子编码类黄酮3’-羟化酶或其互补于编码该酶的序列。
本发明的另一方面包含一种分离的核酸分子，包含对应于矮牵牛属中名为Ht1或Ht2的遗传基因座，或含控制3’-羟化类黄酮合成的序列的其它有关植物种类中基因座的核苷酸序列，其中所说的分离的核酸分子编码类黄酮3’-羟化酶或其衍生物，后者比SEQ ID NO26所述的类黄酮3’-羟化酶能更有效地将DHK转化成DHQ。
根据本发明的上述方面，提供了一种核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO1所述的或具有与其至少大约60％相似性或能在低度严格条件下与SEQ ID NO1所述序列杂交的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
在有关实施方案中，提供了一种核酸分子，它包含基本上如SEQ IDNO3所述的或具有与其至少大约60％相似性或能在低度严格条件下与SEQ ID NO3所述序列杂交的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
在另一相关实施方案中，本发明涉及一种核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO5所述的或具有与其至少大约60％相似性或能在低度严格条件下与SEQ ID NO5所述的序列杂交的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
还有另一个相关的实施方案提供了一种核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO7所述的或具有与其至少大约60％相似性或能在低度严格条件下与SEQ ID NO7所述序列杂交的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
还有本发明另一个实施方案涉及一种核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO9所述的或具有与其编码区至少大约60％相似性或能在低度严格条件下与SEQ ID NO9所述序列杂交的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
在另一实施方案中，提供了一种核酸分子，它包含基本上如SEQ IDNO14所述或具有与其至少大约60％相似性或能在低度严格条件下与SEQ ID NO14所述序列杂交的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
在另一实施方案中，本发明涉及一种核酸分子。它包含基本上如SEQ ID NO16所述或具有与其至少大约60％相似性或能在低度严格条件下与SEQID NO16所述序列杂交的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
还有另一个实施方案提供了一种核酸分子，它包含基本上如SEQ IDNO18所述的或具有与其至少大约60％相似性或能在低度严格条件下与SEQ ID NO18所述的序列杂交的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
而且，本发明的另一实施方案涉及一种核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO20所述的或具有与其至少大约60％相似性或能在低等严格条件下与SEQ ID NO20所述的序列杂交的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
还有另一个实施方案涉及一种核酸分子，它包含基本上如SEQ IDNO22所述的或具有与其至少大约60％相似性或能在低度严格条件下与SEQ ID NO22所述的序列杂交的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
在另一实施方案中，本发明提供了一个核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO24所述的或具有与其至少大约60％相似性或能在低等严格条件下与SEQ ID NO24所述的序列杂交的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。
在一个特别优选的实施方案中，提供了一种分离的核酸分子，它包含基本上如SEQ ID NO1所述的或具有与其至少大约60％相似性或能在低度严格条件下与SEQ ID NO1所述的序列杂交的核苷酸序列或其互补核苷酸序列，其中所述的核革酸序列定位到矮牵牛属中称为Ht1或Ht2的遗传基因座上或在其它开花植物种类中相应的这类基因座上，且其中所述的分离的核酸分子编码类黄酮3’-羟化酶，或与编码该酶的序列互补。
本文参考的42℃的低度严格条件包括和包含用于杂交的从至少大约1％到至少大约15％的甲酰胺和从至少大约1M到至少大约2M的盐，以及作为洗涤条件的至少大约1M到至少大约2M的盐。如果需要，可使用替换的严格条件，如中等严格条件，它包括和包含用于杂交的从至少大约16％到至少大约30％的甲酰胺和从至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐，以及作为洗涤条件的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐，或高度严格条件，它包括和包含用于杂交的从至少大约31％到至少大约50％甲酰胺和从至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐，以及作为洗涤条件的至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐。杂交可在不同温度下进行，如果这样，可据此调节其它条件。
本发明的另一方面提供了一种核酸分子，它包括编码基本上如SEQID NO2所述的氨基酸序列或具有与其至少大约50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或与该编码序列互补的核苷酸序列。
在有关实施方案中，提供了一种核酸分子，它包括编码基本上如SEQ ID NO4所述的氨基酸序列或具有与其至少大约50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或与该编码序列互补的核苷酸序列。
本发明的另一相关实施方案涉及一种核酸分子，它包括编码基本上如SEQ ID NO6所述的氨基酸序列或具有与其至少大约50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互补序列。
还有另一相关的实施方案提供了一种核酸分子，它包括编码基本上如SEQ ID NO8所述的氨基酸序列或具有与其至少大约50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互补序列。
还有另一相关的实施方案涉及一种核酸分子，它包括编码基本上如SEQ ID NO10或SEQ ID NO11或SEQ ID NO12或SEQ ID NO13所述的氨基酸序列或具有与其至少大约50％相似性的氨基酸序列或其互补序列。
在另一实施方案中，本发明涉及一种核酸分子，它包括编码基本上如SEQ ID NO15所述的氨基酸序列或具有与其至少大约50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互补序列。
还有在另一实施方案中，提供子一种核酸分子，它包括编码基本上如SEQ ID NO17所述的氨基酸序列或具有与其至少大约50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互补序列。
在另一实施方案涉及一种核酸分子，它包括编码基本上如SEQ IDNO19所述的氨基酸序列或具有与其至少大约50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互补序列。
而且，本发明的另一实施方案涉及一种核酸分子，它包括编码基本上如SEQ ID NO21所述的氨基酸序列或具有与其至少大约50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互补序列。
还有一个实施方案涉及一种核酸分子，它包括编码基本上如SEQ IDNO23所述的氨基酸序列或具有与其至少大约50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互补序列。
在另一实施方案中，本发明提供了一种核酸分子，它包括编码基本上如SEQ ID NO25所述的氨基酸序列或具有与其至少大约50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互补序列。
在一个特别优选的实施方案中，提供了一种分离的核酸分子，它包括编码基本上如SEQ ID NO2所述的氨基酸序列或具有与其至少大约50％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互补序列，其中所述的核苷酸序列定位到矮牵牛属中称为Ht1或Ht2的遗传基因座上或其它开花植物种类中相应的这类基因座上，其中所述的分离的核酸分子编码类黄酮3’-羟化酶或其衍生物或是该编码序列的互补序列。
本文使用的术语“相似性”包括在核苷酸或氨基酸水平上所比较的序列间完全相同。在核苷酸水平上没有相同性的地方，“相似性”包括产生在结构，功能，生物化学和/或构象水平上互相相关的不同氨基酸的序列之间的差异。在氨基酸水平上没有相同性的地方，“相似性”包括在结构，功能，生物化学和/或构象水平上互相相关的氨基酸。
SEQ ID NO1所示的核酸分子编码来自矮牵牛属的类黄酮3’-羟化酶。其它适合的F3’H基因的例子来自石竹(SEQ ID NO3)，金鱼草属(SEQ ID NO5)，拟南芥属(SEQ ID NO7)，拟南芥属基因组DNA克隆(SEQ ID NO9)，玫瑰(SEQ ID NO14)，菊(SEQID NO16)，蝴蝶草属(SEQ ID NO18)，日本牵牛花(SEQ ID NO20)，龙胆(SEQ ID NO22)和lisianthus(SEQ ID NO24)。尽管本发明特别列举了上述F3’H基因，但本发明可延伸到任何植物种类的F3’H基因，只要这些F3’H基因在核苷酸水平上具有与选自SEQ ID NO1或3或5或7或14或16或18或20或22或24的核酸分子至少大约60％的相似性或在氨基酸水平上具有与选自SEQ ID NO2或4或6或8或10，11，12，13或15或17或19或21或23或25的氨基酸分子至少大约50％的相似性。本发明进一步延伸到来自任何植物种类的F3’H基因，只要这些F3’H基因在核苷酸水平上具有与SEQ ID NO9的编码区域至少大约60％的相似性。
本发明的核酸分子一般是在非天然存在状态下的基因序列。一般来说，这意味着从其天然状态分离出来或人工合成或在非天然存在环境中产生。更具体地，它包括体外形成或维持的核酸分子，包括基因组DNA片段，重组或合成的分子和与异源性核酸连接的核酸。它也延伸到编码F3’H的基因组DNA或cDNA或其部分，或者相对于其自身的或其它启动子方向相反的部分。它进一步延伸到相对于其它核酸序列至少部分纯化的天然存在的序列。
术语“核酸分子”包括核酸分离物和基因序列，在本文中以其最普遍的含义使用，它包括F3’H中的氨基酸序列直接地或经碱基的互补系列限定的任何核苷酸碱基的接近系列。该氨基酸序列可组成全长的F3’H或其有活性的截短形式或可相应于该酶的特定区域，如N-端，C-端或中间部分。本文涉及的核酸分子也包含作为基因探针或作为能调节植物中相应基因表达的“反义”分子的寡核苷酸。本文使用的“反义分子”也可包括含有相对于其自身的或另一启动子反向的结构基因组或cDNA基因或其部分的基因构建体。因此，本发明的核酸分子可适用于作为共同抑制分子，核酶分子，有义分子和反义分子以调节3’-羟基化花青苷的水平。
在另一实施方案中，编码F3’H的核酸分子或其各种衍生物用于减小内源性F3’H的活性，选择性地，编码该酶的核酸分子或其各种衍生物以反义方向使用以减小F3’H的活性。尽管不希望以任一理论限制本发明，但将该核酸分子导入细胞中通过降低同源内源性基因的转录或通过增加相应mRNA的转换来产生这一结果是可能的。使用含有有义或反义方向的F3’H核酸分子或其各种衍生物的基因构建体可实现这一点。在更进一步的改进方案中，可使用核酶灭活靶核酸分子。选择性地，核酸分子编码一种功能性F3’H且它用于升高植物中该酶的水平。
本文提及的类黄酮F3’H活性的改变涉及将活性升高或降低到正常内源性或现存活性水平之上或之下达30％，或更优选30-50％，或甚至更优选50-75％或更优选75％或更大。使用Stotz和Forkmann(1982)所述方法的改进方式(见实施例7)或通过按实施例5所述测定F3’H产物，比如栎皮黄酮，花青素或甲基花青素的量可较容易地测定活性水平。
本发明进一步延伸到以寡核苷酸引物或探针形式存在的核酸分子，该引物或探针在高度，优选在中等，且最优选在低等严格条件下能与上述核酸分子，特别是选自SEQ ID NO1，3，5，7，9，14，16，18，20，22或24中所述的核酸分子的一部分杂交。优选地该部分对应于F3’H基因的5’或3’端。为了方便，本文所说的5’端定义为基本上在初级转录子5’端至该基因中央部分之间的区域，本文所说的3’端定义为基本上在该基因中央部分至初级转录子3’端之间的区域。因此，很明显寡核苷酸或探针可与5’端或3’端或与5’和3’端共有的区域杂交。
核酸分子或其互补形式可编码全长酶或其部分或其衍生物。“衍生物”指相对于天然存在的酶有任意单一或多处氨基酸取代，缺失和增加，且包括部分，片段，分部，融合分子，同源物和类似物。关于这点，核酸包括天然存在的编码F3’H的核苷酸序列或可包含对所述天然存在的序列的单一或多个核苷酸取代，缺失和/或增加。融合分子可以是编码2个或多个F3’H的核苷酸序列之间的融合，或编码F3’H的核酸序列与编码任何其它蛋白质类分子的核苷酸序列之间的融合。融合分子在改变底物特异性中有用。
本发明的核酸分子或其互补形式或F3’H的衍生物也可包括不管其是否具有活性的“部分”。有活性的或有功能的核酸分子是编码具有F3’H活性的酶的分子。有活性的或有功能的分子进一步包括具有部分活性的分子，例如，底物特异性降低的F3’H应认为具有部分活性。核酸分子的衍生物可作为寡核苷酸探针，作为用于聚合酶链式反应或各种突变技术的引物，用于产生反义分子或核酶构建体。它们也可用于形成共同抑制构建体。根据本发明这一方面的核酸分子可编码或不编码具有功能的F3’H。“部分”可来自该核酸分子的5’端或3’端与5’及3’端共有的区域。
本发明的F3’H的氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羟基末端融合物以及单个或多个氨基酸的序列内插入。插入氨基酸序列的变异体是那些其中将一个或多个氨基酸残基导入了蛋白质的预定位点的变异体，尽管也可能进行随机插入并适当筛选所得的产物。缺失变异体的特征在于从序列中去掉了一个或多个氨基酸。置换氨基酸变异体是那些其中序列中的至少一个残基被去掉并在其位置插入不同的残基的变异体。典型的置换是根据下面表1进行的取代。
表1 适合于氨基酸置换的残基 原始残基典型的置换 Ala Ser Arg Lys Asn Gln；His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Asn；Gln Ile Leu；Val Leu Ile；Val Lys Arg；Gln；Glu Met Leu；Ile Phe Met；Leu；Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp；Phe Val Ile；Leu 在F3’H通过氨基酸置换改变时，氨基酸一般被具有相似特性，如疏水性，亲水性，电负性，侧链大小等的其它氨基酸置换。典型的氨基酸置换是单一残基。氨基酸插入通常是大约1-10个氨基酸残基的级别，缺失变化范围为1-20个残基。优选地，缺失或插入在相邻的碱基对中进行，即，缺失2个残基或插入2个残基。
使用本领域熟知的肽合成技术，如固相肽合成(Merrifield，1964)等，或经重组DNA操作可较容易地制备上面提及的氨基酸变异体。在含已知或部分已知序列的DNA的预定位点进行置换突变的技术是熟知的，包括，例如，M13突变。用以产生表现为置换，插入或缺失变异体的变异蛋白质的DNA序列操作一般在，例如，Sambrook等(1989)中进行了描述。
本发明的F3’H的重组或合成突变体或衍生物的其它例子包括单个或多个置换，缺失和/或增加与酶相连的任意分子，如糖类、脂类和/或蛋白质或多肽。
术语“类似物”和“衍生物”也延伸到F3’H的任意的不管其是否有功能的化学等效物，还可延伸到上述任意氨基酸衍生物。如果本发明这个方面的“类似物”和“衍生物”是非功能性的，它们可作为F3’H活性的兴奋剂或拮抗剂。为了方便，本文提到的“F3’H”包括提及的任何衍生物，包括其部分，突变体，片段，同源物或类似物。
本发明用来自矮牵牛属，石竹，玫瑰，金鱼草属，拟南芥属，菊，lisianthus，蝴蝶草属，牵牛花和龙胆的核酸序列为例，因为它们代表了至今最常见和优选的材料来源。然而，本领域的技术人员将马上意识到相似的序列可以从任何来源，如从其它植物或某些微生物中分离。其它植物的例子包括，但不限于玉米，烟草，矢车菊，天竺葵属，苹果，扶郎花属和非洲紫罗兰。本发明包括所有这些直接或间接编码类黄酮途径的酶且特别是F3’H的核酸序列，而不考虑它们的来源。
本文期望的核酸分子能以单独的方式存在，也可与载体分子，如表达载体结合。术语载体分子以其最广的含义使用，包括用于核酸分子的能帮助将核酸转化入植物细胞和/或帮助整合到植物基因组中的任何中间载体。例如，中间载体可适合在电穿孔，微粒轰击，土壤杆菌介导的转化中使用或由DNA或RNA病毒插入。本文包含的中间载体和/或核酸分子可以或不必稳定整合入植物基因组。这样的载体分子也可在原核细胞中复制和/或表达。优选地，载体分子或其部分能整合到植物基因组中。核酸分子可另外含有能指导核酸分子在植物细胞中表达的启动子序列。核酸分子和启动子也可通过如上所述的任何方式导入细胞中。
根据本发明，编码F3’H或其衍生物或其部分的核酸分子可以任一方向导入植物来允许，许可或促进细胞质内mRNA的生产水平和/或由mRNA合成酶的水平，从而提供将DHK和/或其它合适的底物(如果在植物细胞中合成)最终转变成花色素的花青苷衍生物，如花青素和/或甲基花青素，或选择性地通过降低或消除内源性或现存的F3’H活性来抑制该代谢物这种转变。细胞质中mRNA的合成和/或由mRNA合成酶在本文中称为“表达”。花青素的合成有助于产生红或兰色的花色。在植物中以任一方向表达核酸分子可以是组成型的，诱导型的或发育型的，也可以是组织特异性的。
根据本发明的这一方面，提供了产生能合成F3’H或其功能性衍生物的转基因植物的的方法，所述的方法包括在允许所述的核酸分子最终表达的条件下用含有编码所述的F3’H的核酸序列的核酸分子稳定转化合适植物的细胞，从该细胞再生转基因植物并在足以允许核酸分子表达的条件下让所述的转基因植物生长一段时间。由此转基因植物可以产生相对于可比较的非转基因植物中表达的量更高水平的F3’H活性。
本发明的另一方面涉及一种用于产生减少内源性或现存F3’H活性的转基因植物的方法，所述的方法包括用含有编码F3’H的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子稳定转化合适植物的细胞，从该细胞再生转基因植物，且如果需要，则在足以允许该核酸分子表达的条件下让所述的转基因植物生长。
本发明的另一方面涉及产生内源性或现存F3’H活性减小的遗传修饰的植物的方法，上述的方法包含通过用导入植物细胞的适当改变的F3’H基因或其衍生物或部分经同源重组修饰内源性序列来改变F3’H基因并从该细胞再生遗传修饰的植物。
根据本发明的这些方面，优选的核酸分子基本上如SEQ ID NO1，3，5，7，14，16，18，20，22，24所述，或是9的编码区域，或具有与它们至少大约60％的相似性，或能在低度严格条件下与它们杂交。
在优选的实施方案中，本发明包含产生表现出改变的花色的转基因开花植物的方法，上述的方法包含用本发明的核酸分子稳定转化合适的植物细胞，从这些细胞再生转基因植物并在足以允许该核酸分子表达成F3’H酶的条件下让上述的转基因植物生长一段时间。选择性地，上述的方法可包括用本发明的核酸分子或其互补序列稳定转化合适的植物的细胞，从该细胞再生转基因植物并在足以改变内源性或现存F3’H活性水平的条件下让上述的转基因植物生长一段时间。优选地，改变了的水平应低于可比较的非转基因植物中内源性或现存的F3’H活性水平。
在相关实施方案中，本发明包含产生表现了改变的花色的开花植物的方法，所述的方法包含通过用导入植物细胞的适当改变的F3’H基因或其衍生物经同源重组修饰内源性序列来改变F3’H基因并从该细胞再生遗传修饰的植物。
本发明的核酸分子可以是或不是发育调控的。优选地，3’-羟基化的花青苷水平的调节导致花色改变，包括根据受体植物的生理条件产生红色花或其它颜色差别。“受体植物”是指能合成F3’H酶的底物或合成F3’H酶本身，且具有所需颜色发育必需的适当生理特性和基因型的植物。它可包括但不限于矮牵牛属，石竹，菊，玫瑰，金鱼草属，烟草，矢车菊，天竺葵属，lisianthus，扶郎花属，苹果，鸢尾，百合花，非洲紫罗兰，龙胆，蝴蝶草属和日本牵牛花。
因此，本发明推延到产生能调节3’-羟基化的花青苷水平的转基因植物的方法，所述的方法包括用含有编码F3’H或其衍生物的核苷酸序列或该编码序列的互补序列的核酸分子稳定转化合适植物的细胞或细胞团，从所述的细胞或细胞团再生转基因植物。
本领域的技术人员会马上知道可应用于本发明的方法的各种变化，如增加或减小靶植物中天然存在的酶活性水平使得颜色的差异不同。
因此，本发明延伸到含有全部或部分本发明的核酸元件和/或其任何同源或相关形式或它们中任何一个的反义形式的所有转基因植物，特别是那些表现出花色改变的转基因植物。该转基因植物可含有导入的核酸分子，该核酸分子含有编码F3’H的核苷酸序列或该编码序列的互补序列。一般来说，该核酸可稳定地导入植物基因组，尽管本发明还延伸到将F3’H核苷酸序列导入能在植物细胞内复制的自主复制核酸序列，如DNA或RNA病毒。本发明还延伸到从该转基因植物获得的种子。这类种子，特别是如果有色，则可用作植物的特有标记。
本发明的另一方面涉及F3’H的重组形式。该酶的重组形式提供了用于研究的材料来源来发展活性更大的酶，且可用于建立产生有色化合物的体外系统。
本发明还有一个方面涉及本文所述的基因序列在制造用于调节植物或植物细胞中的3’-羟基化花青苷水平的基因构建体中的用途。
本发明的另一方面提供了表现出花色改变的来自本文所述的转基因植物的花，特别是切花。
本发明的另一方面涉及含有编码F3’H或其衍生物的核苷酸序列或该编码序列的互补序列的核酸分子，其中所述的核酸分子能在植物细胞中表达。术语“表达(expressed)”相当于上文定义的术语“表达(expression)”。
根据本发明的这一和其它方面的核酸分子，相对于国际专利申请号PCT/AU93/00127[WO 93/20206]公开的质粒PCGP809中包含的PCGP619cDNA插入片段的效率而言允许，许可或促进更高效率地调节3’-羟基化花青苷。术语“植物细胞”包括单个的植物细胞或植物细胞团，如愈伤组织中，小植株或植株或其部分，包括花和种子。
本发明的另一方面提供了包括编码F3’H的核苷酸序列或该编码序列的互补序列的核酸分子，其中所述的核酸分子的翻译产物含有氨基酸序列RPPNSGA。优选地，所述的核酸分子的翻译含有氨基酸序列RPPNSGAXHXAYNYXDL，且更优选地，所述的核酸分子的翻译产物包含氨基酸序列RPPNSGAXHXAYNYXDL[X]nGGEK，其中X代表任意氨基酸，[X]n代表0至500位氨基酸的氨基酸序列。
本发明进一步由以下提及的非限制性的附图和实施例进行描述。在附图中 图1(图1a和1b)是P.hybrida花中类黄酮生物合成途径的示意图，显示了转化中涉及的酶和遗传基因座。该途径中涉及的酶表示如下PAL＝苯丙氨酸氨基裂解酶；C4H＝肉桂酸盐-4-羟化酶；4CL＝4-香豆酸；CoA连接酶；CHS＝查耳酮合成酶；CHI＝查耳酮异构酶；F3H＝黄烷酮-3-羟化酶；F3’H＝类黄酮3’-羟化酶；F3’5’H＝类黄酮3’5’羟化酶；FLS＝黄烷醇合成酶；DFR＝二氢黄烷醇-4-还原酶；ANS＝花青苷合成酶；3GT＝UDP-葡萄糖花青苷-3-葡萄糖苷；3RT＝UDP-鼠李糖花青苷-3-葡萄糖苷鼠李糖苷转移酶；ACT＝花青苷-3-芸香糖苷酰基转移酶；5GT＝UDP-葡萄糖花青苷5-葡萄糖苷转移酶；3’OMT＝花青苷O-甲基转移酶；3’，5’OMT＝花青苷3’，5’-O-甲基转移酶。在该途径中的3种类黄酮表示为P-3-G＝花葵素-3-葡萄糖苷；DHM＝二氢杨酶黄酮；DHQ＝二氢栎皮黄酮。在P.hybrida中仅以较低水平合成类黄醇，杨酶黄酮且极少合成花青苷，花葵素。
图2是质粒pCGP161的示意图，该质粒含有编码来自P.hybrida的肉桂酸-4-羟化酶的cDNA克隆(F1)。0.7kb EcoR I/XhoI片段的32P标记的片段用于探测美国国旗红花瓣的cDNA文库。详情见实施例4。缩写如下Amp＝氨苄青霉素抗性基因；ori＝复制起点；T3＝T3RNA聚合酶的识别序列；T7＝T7RNA聚合酶的识别序列。也标记了限制性酶位点。
图3是质粒pCGP602的示意图，pCGP602含有编码来自P.hybrida的类黄酮3’5’羟化酶(Hf1)的cDNA克隆(617)。含Hf1编码区的1.6kb Bsp HI/Fsp I片段的32P标记的片段用于探测国旗红花瓣的cDNA文库。详情见实施例4。缩写如下Amp＝氨苄青霉素抗性基因；ori＝复制起点；T3＝T3RNA聚合酶的识别序列；T7＝T7RNA聚合酶的识别序列。还标记了限制性酶位点。
图4是质粒pCGP175的示意图，pCGP175含有编码来自P.hybrida的类黄酮3’5’羟化酶(Hf2)的cDNA克隆(H2)。一起含有Hf2编码区的1.3kb EcoRI/Xho I和0.5kb Xho I片段的32P标记的片段用于探测美国国旗红花瓣cDNA文库。详情见实施例4。缩写如下Amp＝氨苄青霉素抗性基因；ori＝复制起点；T3＝T3RNA聚合酶的识别序列；T7＝T7RNA聚合酶的识别序列。还标记了限制性酶位点。
图5是质粒pCGP619的示意图，pCGP619含有编码来自P.hybrida的细胞色素P450的651cDNA克隆。1.8kb EcoR I/Xho I片段的32P标记的片段用于探测美国国旗红花瓣的cDNA文库。详情见实施例4。缩写如下Amp＝氨苄青霉素抗性基因；ori＝复制起点；T3＝T3RNA聚合酶的识别序列；T7＝T7 RNA聚合酶的识别序列。还标记了限制性酶位点。
图6表示用pCGP1805中包含的OGR-38cDNA克隆的32P标记的片段探测的RNA印迹的放射自显影照片(见实施例6)。各泳道含有20μg从V23(ht1/ht1)×VR(Ht1/ht1)回交群体植物的花或叶分离的总RNA样品。在含高水平栎皮黄酮(Q+)的VR类(Ht1/ht1)花中检测到1.8kb的转录物(泳道9-14)。在含少量或不含栎皮黄酮(Q-)的V23类(ht1/ht1)花中检测到水平低得多的相同大小的转录物(泳道3-8)。在VR叶(泳道1)和V23花瓣(泳道2)中也检测到了减少的转录物水平。这在实施例5中描述。
图7是酵母表达质粒pCGP1646的示意图(见实施例7)。来自pCGP1805的OGR-38cDNA插入片段以“有义”的方向克隆到表达载体pYE22m中的酵母甘油醛-3-磷酸脱氯酶启动子(PGAP)后。TRP1＝Trp1基因，IR1＝2μm质粒的反应重复，TGAP＝来自酵母甘油醛-3-磷酸脱氢的基因的终止子序列。还标记了限制性酶位点。
图8是双元质粒pCGP1867的示意图(实施例8中所述)。pCGP1805的Ht1 cDNA插入片段(OGR-38)以“有义”的方向克隆到表达载体pCGP293的Mac启动子后。缩写如下LB＝左侧边界；RB＝右侧边界；Gm＝庆大霉素抗性基因；35S＝来自花椰菜花叶病毒35S基因的启动子区；npt II＝新霉素磷酸转移酶II基因；tml 3’＝来自土壤杆菌属tml基因的终止子区；mas 3’＝来自土壤杆菌属的甘露碱合成酶基因的终止子区域。ori pRi＝来自毛根土壤杆菌质粒的广谱宿主范围的复制起点；ori Col E1＝来自Colcinin E1质粒的高拷贝复制起点。还标记了限制性酶位点。
图9是双元质粒pCGP1810的示意图，它的构建在实施例13中描述。来自pCGP1807的KC-1cDNA插入片段(见实施例12)以“有义”的取向克隆到表达载体p CGP293的Mac启动子后。缩写如下LB＝左侧边界；RB＝右侧边界；Gm＝庆大霉素抗性基因；35S＝来自花椰菜花叶病毒35S基因的启动子区；nptII＝新霉素磷酸转移酶II基因；tml 3’＝来自土壤杆菌属tml基因的终止子区域；mas 3’＝来自土壤杆菌属甘露碱合成酶基因的终止子区域；ori pRi＝来自毛根土壤杆菌质粒的广谱宿主范围的复制起点；ori Col E1＝来自Colcinin E1质粒的高拷贝复制起点。还标记了限制性酶位点。
图10是双元质粒pCGP1813的示意图，其构建在实施例14中描述。来自pCGP1807的KC-1cDNA插入片段(见实施例12)以“有义”方向克隆到mac启动子和mas终止子之间。MacKC-1mas表达元件随后克隆到双元载体pWTT2132中。缩写如下Tet＝四环素抗性基因；LB＝左侧边界；RB＝右侧边界，sur B＝来自乙酰乳酸合成酶基因的编码区和终止子序列；35S＝来自花椰菜花叶病毒35S基因的启动子区，mas 3’＝来自土壤杆菌属甘露碱合成酶基因的终止子区；PVS1＝来自绿脓假单胞菌质粒的广谱宿主范围的复制起点，pACYCori＝来自大肠杆菌pACYC184的修饰的复制子。还标记了限制性酶位点。
图11表示用Am 3Ga差异显示PCR片段的32P标记的片段探测的Southern印迹的放射自显影照片(如实施例16所述)。各泳道含10μg从N8(Eos+)，K16(eos-)或K16×N8F2群体的植物中分离的EcoRV消化的基因组DNA样品。在来自产花青素的植物(表示为“+”)的基因组DNA中检测到杂交带(泳道1，3，4，5，6，7，9，10，12和15)。在来自不生产花青素的植物(用“-”表示)的基因组DNA样品中没有观察到特异性杂交(泳道2，8，11，13和14)。
图12表示用Am3Ga差异显示PCR片段的32P标记的片段探测的RNA印迹的放射自显影照片。各泳道含10μg从N8(Eos+)×K16(eos-)F2群体植物的花或叶分离的总RNA样品。在产生化青素的K16×N8F2花(花青素+)(植物#1，#3，#4，#5和#8)中检测到1.8Kb的转录物。在不产生花青素的K16×N8F2花(花青素-)(植物#6，#11，#12)中或在花中产生花青素的K16×N8F2植物的叶样品(#13L)中没有检测到转录物。详情在实施例17中提供。
图13是双元质粒pCGP250的示意图，其构建在实施例20中描述。含来自pCGP246的1至1711位核苷酸(SEQ ID NO5)的sd F3’HcDNA插入片段(见实施例18)以“有义”方向克隆到表达载体pCGP293的Mac启动子后。缩写如下LB＝左侧边界；RB＝右侧边界；Gm＝庆大霉素抗性基因；35S＝来自花椰菜花叶病毒35S基因的启动子区；npt II＝新霉素磷酸转移酶II基因；tml 3’＝来自土壤杆菌属tml基因的终止子区；mas 3’＝来自土壤杆菌属甘露碱合成酶基因的终止子区；ori pRi＝来自毛根土壤杆菌质粒的广谱宿主范围的复制起点；oriCol E1＝来自Colcinin E1质粒的高拷贝的复制起。还标记了限制性酶位点。
图14是双元质粒pCGP231的示意图，其构建在实施例20中描述。含来自pCGP246的104至1711位核苷酸(SEQ ID NO5)的sd F3’HcDNA插入片段以“有义”方向克隆到表达载体pCGP293的Mac启动子后。缩写如下LB＝左侧边界；RB＝右侧边界；Gm＝庆大霉素抗性基因；35S＝来自花椰菜叶病毒35S基因的启动子区；nptII＝新霉素磷酸转移酶II基因；tml 3’＝来自土壤杆菌属tml基因的终止子区；mas 3’＝来自土壤杆菌属甘露碱合成酶基因的终止子区域；ori pRi＝来自毛根土壤杆菌质粒的广谱宿主范围的复制起点；ori Col E1＝来自colcinin E1质粒的高拷贝复制起点。还标记了限制性酶位点。
图15是双元质粒pBI-Tt 7-2的示意图。将来自E-5的6.5kb EcoRI/Sal I Tt7基因组片段克隆到EcoRI/Sal I切割的pBI101中，代替原有的GUS基因。所示的Tt7(F3’H)基因的方向(5’至3’)通过DNA测序确定。缩写如下LB＝左侧边界；RB＝右侧边界；nos 5’＝来自土壤杆菌属胭脂碱合成酶基因的启动子区；npt II＝新霉素磷酸转移酶II基因的编码区；nos 3’＝来自土壤杆菌属胭脂碱合成酶基因的终止子区域；npt I＝新霉素磷酸转移酶I基因的编码区。还标记了限制性酶位点。
图16是双元质粒pCGP2166的示意图，其构建在实施例26中描述。来自pCGP2158的玫瑰#34cDNA插入片段(见实施例25)以“有义”方向克隆到pCGP293表达载体的Mac启动子后。缩写如下LB＝左侧边界；RB＝右侧边界；Gm＝庆大霉素抗性基因；35S＝来自花椰菜花叶病毒35S基因的启动子区；npt II＝新霉素磷酸转移酶II基因；tml 3’＝来自土壤杆菌属tml基因的终止子区域；mas 3’＝来自土壤杆菌属甘露碱合成酶基因的终止子区；ori pBi＝来自毛根土壤杆菌质粒的广谱宿主范围的复制起点；ori Col E1＝来自Colcinin E1质粒的高拷贝复制起点。还标记了限制性酶位点。
图17是双元质粒pCGP2169的示意图，其构建在实施例27中描述。来自pCGP2158的玫瑰#34cDNA插入片段以“有义”方向克隆到CaMV35S启动子和ocs终止子之间。随后将35S玫瑰#34ocs表达元件克隆到双元载体pWTT2132中。缩写如下Tet＝四环素抗性基因；LB＝左侧边界；RB＝右侧边界；sur B＝来自乙酰乳酸合成酶基因的主体区域和终止子区域；35S＝来自花椰菜花叶病毒35S基因的启动子区域，OSS＝来自土壤杆菌属章鱼碱合成酶基因的终止子区域；pVS1＝来自绿脓假单胞菌质粒的广谱宿主范围的复制起点，pACY Cori＝来自大肠杆菌的pACYC184的修饰的复制子。还标记了限制性酶位点。
图18是双元质粒pLN85的示意图，其构建在实施例28中描述。来自pCHRM1的菊RM6i cDNA插入片段以“反义”方向克隆到花椰菜花叶病毒35S基因启动子(35S)之后。其它缩写如下LB＝左侧边界；RB＝右侧边界；ocs3’＝来自土壤杆菌属章鱼碱合成酶基因的终止子区域；pnosnptIInos 3’＝含来自土壤杆菌属胭脂碱合成酶基因的启动子区表达元件；新霉素磷酸转移酶II基因的编码区和来自土壤杆菌属胭脂碱合成酶基因的终止子区；ori T＝复制转移起点；trf A＊＝顺式作用复制功能；ori Col E1＝来自Colcinin E1质粒的高拷贝复制起点；Tn 7SpR/StR＝来自转座子Tn7的壮观霉素和链霉素抗性基因；ori VRK2＝质粒RK2的广谱宿主范围的复制起点。还标记了限制性酶位点。
图19是酵母表达质粒pYTHT6的示意图，其构建在实施例30中描述。来自pTHT6的THT6cDNA插入片段以“有义”方向克隆到表达载体pYE22m的酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(PGAP)后。缩写如下TRP1＝Trp1基因；IR1＝2μm质粒的反向重复；TGAP＝来自酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的终止子序列。还标记了限制性酶位点。
本说明书中使用的氨基酸缩写在下面表2中显示。
表2 氨基酸缩写符号 氨基酸3字母符号单字母符号 L-丙氨酸AlaA L-精氨酸ArgR L-天冬酰胺 AsnN L-天冬氨酸 AspD L-半胱氨酸 CysC L-谷氨酰胺 GlnQ L-谷氨酸GluE L-甘氨酸GlyG L-组氨酸HisH L-异亮氨酸 IleI L-亮氨酸LeuL L-赖氨酸LysK L-甲硫氨酸 MetM L-苯丙氨酸 PheF L-脯氨酸ProP L-丝氨酸SerS L-苏氨酸ThrT L-色氨酸TrpW L-酪氨酸TyrY L-缬氨酸ValV 表3提供了本文提及的序列指定的SEQ ID NO的总结 表3 序列 物种SEQ ID NO pCGP 1805的cDNA插入片段矮牵牛属SEQ ID NO1 相应的氨基酸序列 矮牵牛属SEQ ID NO2 pCGP246的cDNA插入片段 石竹SEQ ID NO3 相应的氨基酸序列 石竹SEQ ID NO4 pCGP246的cDNA插入片段金鱼草属SEQ ID NO5 相应的氨基酸序列 金鱼草属SEQ ID NO6 cDNA部分序列 拟南芥属SEQ ID NO7 相应的氨基酸序列 拟南芥属SEQ ID NO8 基因组序列 拟南芥属SEQ ID NO9 外显子I的相应的氨基酸序列拟南芥属SEQ ID NO10 外显子II的相应氨基酸序列 拟南芥属SEQ ID NO11 外显子III的相应氨基酸序列拟南芥属SEQ ID NO12 外显子IV的相应氨基酸序列 拟南芥属SEQ ID NO13 pCGP2158的cDNA插入片段 玫瑰SEQ ID NO14 相应的氨基酸序列 玫瑰SEQ ID NO15 pCHRM1的cDNA插入片段 菊 SEQ ID NO16 相应的氨基酸序列 菊 SEQ ID NO17 THT cDNA序列 蝴蝶草属SEQ ID NO18 相应的氨基酸序列 蝴蝶草属SEQ ID NO19 MHT 85cDNA序列 日本牵牛花 SEQ ID NO20 相应的氨基酸序列 日本牵牛花 SEQ ID NO21 GHT13cDNA序列龙胆SEQ ID NO22 相应的氨基酸序列 龙胆SEQ ID NO23 pL3-6的cDNA插入片段 Lisianthus SEQ ID NO24 相应的氨基酸序列 Lisianthus SEQ ID NO25 出自WO 93/20206的cDNA序列矮牵牛属SEQ ID NO26 寡核苷酸poly T-anch ASEQ IDNO27 寡核苷酸poly T-anch CSEQ ID NO28 寡核苷酸ploy T-anch GSEQ ID NO29 保守的氨基酸引物区 SEQ ID NO30 相应的寡核苷酸序列 SEQ ID NO31 保守的氨基酸引物区 SEQ ID NO32 相应的寡核苷酸序列 SEQ ID NO33 寡核苷酸引物Pet Haem-New SEQ ID NO34 保守的氨基酸引物区 SEQ ID NO35 相应的寡核苷酸序列 SEQ ID NO36 寡核苷酸Snapred Race A SEQ ID NO37 寡核苷酸Snapred Race C SEQ ID NO38 寡核苷酸poly-C RaceSEQ ID NO39 寡核苷酸引物Pet Haem SEQ ID NO40 分别含质粒pCGP 1867，pCGP1810和pCGP231的无毒的微生物根癌土壤杆菌菌株AGL0(Agrobacterium tumefaciens AGL0)于1996年2月23日保存于澳大利亚政府分析实验室，1 suakin Street，Pymble，New South Wales，2037，澳大利亚，且指定的保藏号分别为96/10967，96/10968和96/10969。
分离类黄酮3’-羟化酶和相关的核酸序列 实施例1植物材料 矮牵牛属 所用的Petunia hybrida品种在表4中提供。
表4 植物在光强度10,000lux，白昼长度14小时，温度22℃至26℃的特定生长室中生长。
石竹属 麝香石竹变种Kortina Chanel的花从Van Wyk和Son FlowerSupply，Victoria获得。
麝香石竹花在如下限定的发育阶段收获 阶段1封闭的花蕾，花瓣不可见。
阶段2花蕾张开花瓣尖端可见。
阶段3几乎全部花瓣尖端暴露。“画笔阶段”。
阶段4外侧花瓣与茎成45角。
阶段5花完全张开。
金鱼草属 使用的金鱼草株系来自亲本株系K16(eos-)和N8(Eos+)。F3’H活性与Eos基因之间有严格相关性，已知Eos基因控制黄烷酮，黄烷醇和花青苷的3’羟基化(Forkmann和Stotz，1981)。K16是缺乏F3’H活性的纯合隐性突变体，而N8是F3’H活性的野生型。这些品系相似，但不同源。亲本株系和来自自交(K16×N8)F1植物的种子从Dr.C.Martin(John Innes Centre，Norwich，UK)处获得。
拟南芥属 拟南芥株系Columbia(Tt7)，Landsberg eracta(Tt7)和NW88(tt7)从诺丁汉拟南芥贮存中心(Nottingham ArabidopsisStock Centre)获得。野生型拟南芥(Tt7)种子具有特征性的棕色。tt7突变体的种子具有淡棕色的种子，其植株的特征在于叶中花青苷含量减小(Koornneef等，1982)。Tt7植物合成花青素，而tt7突变体中积累花葵素，表明Tt7基因控制类黄酮3’-羟基化。
玫瑰 Rosa hybrida变种Kardinal的花从Van Wyk和Son Flower Supply，Victoria获得。
Rosa hybrida花发育阶段限定如下 阶段1未沉积色素，紧密关闭的花蕾(10-12mm高；5mm宽)。
阶段2沉积有色素，紧密关闭的花蕾(15mm高；9mm宽)。
阶段3沉积有色素，关闭的花蕾；萼片刚开始打开(20-25mm高；13-15mm宽) 阶段4花蕾开始张开；花瓣着色较重；萼片分离(花蕾25-30mm高且18mm宽)。
阶段5萼片完全展开；其中一些卷曲。花瓣着色较重且展开(花蕾30-33mm高且20mm宽)。
菊 菊花发育阶段限定如下 阶段0未见花蕾。
阶段1花蕾可见小花完全被苞片覆盖。
阶段2花蕾张开小花顶端可见。
阶段3小花紧紧地重叠。
阶段4几乎所有小花顶端暴露；外侧小花开放但不水平。
阶段5外侧小花水平。
阶段6花达到成熟。
实施例2细菌菌株 使用的大肠杆菌菌株是 DH5α supE44，Δ(lacZYA-ArgF)U169，

80lacZΔM15，hsdR17(rk-，mk+)，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1，deoR(Hanahan，1983和BRL，1986). XL1-Blue MRF′Δ(mcr A)183，Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173，endA1，supE44，thi-1，recA1，gyrA96，relA1，lac[F′proAB，lacIqZΔM15，Tn10(Tetr]c(Stratagene) XL1-Blue supE44，hsdR17(rk-，mk+)，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1，lac[F′proAB，lacIq，lacZΔM15，Tn10(tetr)] SOLR e14-(mcrA)，Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171，sbcC，recB，recJ，umuC::Tn5(kanr)，uvrC，lac，gyrA96，thi-1，relA1，[F′proAB，lacIqZΔM15]，Su-非抑制性的(Stratagene) DH10B(Zip)F-mcrA，Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，

80d lacZΔM15，ΔlacX74，deoR，recA1，araD139，Δ(ara，leu)7697，galU，galK1λ，rspL，nupG Y1090r- ΔlacU169，(Δlon)？，araD139，strA，supF，mcrA，trpC22::Tn10(Tetr)[pMC9 Ampr，Tetr]，mcrB，hsdR 丧失毒性的根癌土壤杆菌菌株AGL0(Lazo等，1991)从R.Ludwig处(加利福利亚大学，生物学系，Santa Cruz，USA)获得。
克隆载体pBluescript从Stratagene公司获得。
根据Inoue等(1990)所述的方法进行大肠杆菌菌株DH5α细胞的转化。
实施例3一般方法 DNA探针的32P标记 使用寡聚核苷酸标记试剂盒(Bresatec)用50μci[α-32P]-dCTP放射性标记DNA片段(50-100ng)。未掺入的[α-32P]-dCTP通过用Sephadex G-50(Fine)柱层析去除。
DNA序列分析 使用来自应用生物系统的PRISMTM Ready反应染色引物循环测序试剂盒进行DNA测序。按照厂商提供的方法进行。使用Perkin ElmerPCR仪(GeneAmp PCR System 9600)进行循环测序反应并在自动373A DNA测序仪(应用生物系统)上走胶。
使用FASTA和TFASTA程序(Pearson和Lipman，1988)或BLAST程序(Altschul等，1990)进行与Genbank，SWISS-PROT和EMBL数据库的同源性研究。使用LFASTA程序(Pearson和Lipman，1988)获得序列的相似百分数。除非另有说明，在所有情况下核苷酸序列比较使用的缺口值(ktup)为6，氨基酸序列比较使用的缺口值(ktup)为2。
使用在MacVectorTM 6.0(Oxford Molecular Ltd.)中应用的Clustal W程序进行多个序列排列(缺口值为2)。
实施例4从P.hybrida变种国旗红中分离对应于Ht1基因座的类黄酮3’-羟化酶(F3’H)的cDNA克隆 为了分离连锁到Ht1基因座且编码矮牵牛属类黄酮途径中的类黄酮3’-羟化酶(F3’H)的cDNA克隆，从阶段1至3的矮牵牛属国旗红(OGR)花中分离RNA并制备花瓣的cDNA文库。OGR花含以花青素为基础的色素且有高水平的类黄酮3’-羟化酶活性。用从已知在类黄酮途径中包含的3种细胞色素P450cDNA克隆和在酵母中具有类黄酮3’-羟化酶活性的一种细胞色素P450cDNA克隆(651)分离的32P标记片段的混合物筛选OGR cDNA文库。这些包括一个编码肉桂酸-4-羟化酶(C4H)的矮牵牛属cDNA克隆和2个编码类黄酮3’，5’-羟化酶(F3’5’H)(Holton等，1993)的矮牵牛属cDNA克隆(由Hf1和Hf2基因座编码)。
矮牵牛属变种OGR cDNA文库的构建 使用Turpen和Griffith(1986)的方法从P.hybrida变种OGR阶段1至3的花的花瓣组织分离总RNA。使用oligotex-dTTM(Qiagen)从总RNA筛选Poly(A)+RNA。
用5μg从OGR的1至3阶段分离的poly(A)+RNA作模板，使用ZAP-cDNA Gigapack III Gold克隆试剂盒(stratagene)在λZAP中构建定向花瓣cDNA文库。获得的重组子总数为2.46×106。
转染XL1-Blue MRF’细胞后，包装的cDNA混合物以每15cm直径平板50,000pfu涂板。平板在37℃培养8小时，噬菌体在100mM NaCl，8mM MgSO4，50mM Tris-HCl pH8.0，0.01％(W/V)明胶[噬菌体贮存缓冲液(PSB)]中洗脱(Sambrook等，1989)。加入氯仿，并在4℃贮存作为扩增文库的噬菌体。
转染XL1-Blue MRF’细胞后，100,000pfu的扩增文库以每15cm平板10,000pfu的密度在NZY平板上铺板(Sambrook等，1989)，并在37℃培养8小时。在4℃放置过夜后，取一式二份转移到Colony/PlaqueScreenTM滤膜(DuPont)上并按厂商建议进行处理。
探针的分离 F3’5’H探针 按Holton等(1993)和美国专利号5,349,125所述分离的对应于Hf1或Hf2基因座的2个类黄酮3’，5’羟化酶在筛选方法中应用。来自矮牵牛属的C4H cDNA克隆 在用于分离对应于Hf1或Hf2基因座的2个类黄酮3’，5’-羟化酶cDNA克隆的筛选方法中(Holton等，1993；美国专利号5,349,125)分离了许多细胞色素P450cDNA克隆。这些cDNA克隆中一个(F1)(包含于pCGP 161中)(图2)根据与以前鉴定的来自绿豆的C4H克隆的序列相同性鉴定为编码肉桂酸4-羟化酶(C4H)(Mizutani等，1993)。序列数据从矮牵牛属F1cDNA克隆5’端的295个核苷酸产生。在测序的295个核苷酸中与绿豆C4H克隆有83.1％的相似性且在推测的氢基酸序列中有93.9％的相似性。
651cDNA克隆 包含于pCGP619(图5)中的651cDNA克隆的分离与鉴定在
发明者F·布鲁里拉, T·A·霍尔顿, M·Z·米查尔 申请人:国际花卉开发有限公司