黄酮合成酶基因及其编码的多肽的制作方法

专利名称：黄酮合成酶基因及其编码的多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是生物技术领域的基因及其编码的多肽，具体地说是黄酮合成 酶基因及其编码的多肽。
背景技术：
黄酮是植物生长过程中形成的一种次生代谢产物，黄酮与异黄酮、査耳酮、 花青素等都是具有生物活性的类黄酮物质。在植物的组织器官中，类黄酮化合物
的积累是植物胁迫的重要特征，不同生物体在受到逆境胁迫条件下耐性有很大的 差异，这与植物体内的类黄酮化合物类型、含量、结构等有密切的关系。大量研 究表明，豆科植物，尤其是大豆独有的黄酮和异黄酮，含量一般仅为0.1%—0.5%， 具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地预防和抑 制白血病、骨质疏松、癌症等多种疾病的发生。
Oliver等在《Phytochemistry》(植物化学)2003年63巻第753-763页发表了 《Metabolic engineering to increase isoflavone biosynthesis in soybean seed》(用代谢工程的方法增加大豆种子中异黄酮含量) 一文，文中评述，在大豆 黄酮类主要物质黄豆甙原、黄豆素、三羟基异黄酮是通过苯基丙酸类途径合成的。 在苯基丙酸类途径中，中间产物4,5，7-三羟黄垸酮(Naringenin)代谢涉及三个 关键酶形成黄酮(Flavone)的黄酮合成酶(Flavone synthase, FNS)，形成黄 烷酮醇(Dihydroflavonol)的黄烷酮3-羟化酶(Flavanone 3-hydroxylase, F3H) 和形成三羟基异黄酮(genistein)的异黄酮合成酶(Isoflavone synthase, IFS)， 黄垸酮3-羟化酶和异黄酮合成酶的基因序列已经克隆，但关键的黄酮合成酶基因 序列目前仍然未克隆出来。
经对现有技术的文献检索发现，《Phytochemistry》(植物化学)在2005年 66巻20期第2399-2407页刊登了文章"Flavones and flavone synthases "(黄 酮与黄酮合成酶)，文中评述，黄酮在植物的药理学及抗逆性方面有重要作用，推 断控制黄酮形成的黄酮合成酶有两种类型，大豆中黄酮合成酶可能为黄酮合成酶II型。但至今尚未发现与黄酮合成酶基因及其编码的多肽密切相关的报道。

发明内容
本发明的目的在于提供黄酮合成酶基因及其编码的多肽。利用本发明的大豆 黄酮合成酶，可筛选出与大豆黄酮合成酶相关发生相互作用的物质、受体、抑制 剂或拮抗剂等，利用本发明可获得在高异黄酮、抗WGE、抗铝毒害、抗UV—B等方 面具有重要特性的大豆品种。
本发明是通过以下技术方案实现的，
本发明涉及一种基因序列，该序列具有SEQ ID NO. 1中从核苷酸第1-1584位
所示的核苷酸序列。
根据所述基因序列编码的多肽具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。 本发明还涉及一种基因序列，该序列具有SEQ ID N0.3中从核苷酸第1-1584
位所示的核苷酸序列。
根据所述基因序列编码的多肽具有SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列。 本发明根据大豆基因序列数据库，运用生物信息学手段，通过序列比较和电
子克隆拼接，设计出合适的引物，用分子克隆的方法，克隆出大豆黄酮合成酶Gfns
n-l基因以及大豆黄酮合成酶GfnsII-2基因；经过功能鉴定，确定分离出的是大
豆中编码黄酮合成酶的基因。
本发明具有如下的有益效果利用本发明的大豆黄酮合成酶，可筛选出与大
豆黄酮合成酶相关发生相互作用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等，利用本发明 可获得在高异黄酮、抗WGE、抗铝毒害、抗UV—B等方面具有重要特性的大豆品种。 本发明涉及的大肠杆菌DH5d已在《萨姆布鲁克J，拉塞尔D W.分子克隆 实验指南[M].黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等译.第3版.北京科学出版社，2002》 中公开；大肠杆菌DH5ci可通过公开市售的商业渠道取得，如上海天根生物公司， 公司地址上海市漕溪路258弄27号航星商务楼1号楼606室。
本发明涉及的农杆菌LBA4404已在《刘志学，张旭，徐亚南，何艺园，马向 前，沈大棱，唐克轩.用LBA4404 /pCAMBIA系列转化水稻的最佳条件菌株.复旦 学报(自然科学版)，1999， 38 (4): 439-443》中公开；农杆菌LBA4404可以向Life Technologies公司购买，Life Technologies公司中国上海代理上海英骏生物技 术有限公司地址上海市的银都路218号。下面结合具体的实施例子，进一步阐述本发明的具体实施方式
。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具 体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等(1989)编著的分子克 隆实验手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实验所用的PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、高保真的Taq酶、pMD18—T载体是大连TaKaRa公司产品。
实施例1
GfnsII-l大豆黄酮合成酶基因的克隆、表达和鉴定 步骤一、GfnsII-l大豆黄酮合成酶基因的克隆
1、 大豆组织的处理
使用大豆品种合丰47，该品种来源于黑龙江省农业科学院合江农科所，审定 编号黑审豆2004003。种子经过消毒，接种于MSB5固体培养基上萌发5天，其中 MSB5培养基具体为MS培养基的无机成分(Murashige and Skoog， 1962) +B5 培养基有机成分(Gamborg et al， 1968);将植株放入加有0. 4M葡萄糖的MSB5 液体培养基中处理24小时，取根作为提取DNA或RNA的材料。
2、 TRIzol法提取根中的总RNA
(1) 称取0.5g大豆处理根，用液氮速冻后，迅速研磨成细粉，分装于1.5ml 的印pendorf离心管中；
(2) 加入lml TRIzol，用力摇动使混合均匀，25。C，放置5min;
(3) 每管加0. 2ml氯仿，用力振荡15sec，室温放置2min-3min, 4°C, 12， 000g, 离心15min;
(4) 将上清液600ul吸入1. 5ml的新印pendorf离心管中，加与上清等体积异 丙醇，颠倒混匀，-2(rC冰箱中放置30min;
(5) 4'C，12，000g,离心15min，弃上清，收集RNA沉淀，加lral 75% (V/V) 乙醇洗涤沉淀1-2次，洗涤具体为加lml 75%(V/V)乙醇，4。C离心，12000g， 10min -15min，弃上清，收集RNA沉淀；
(6) 沉淀25。C下干燥15min-20min，溶于30 u 1-50 u 1的RNase-free water
中；(7)用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。 3、 GfnsII-l大豆黄酮合成酶基因cDNA的克隆
以根中总RNA为模板，用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反 转录为cDNA，
用上游引物5，-ATGATTTCTGAGTCCCTCTTGTTAG-3， 和下游引物5，-CTACATTTGACGAAAAGGAGTGGG-3'
与高保真的Taq酶PCR得到1600bp左右的片断，连入pMD18—T载体，导入 大肠杆菌DH5 a ，测序验证得到SEQ ID. NO. 1，测序结果用GCG软件包(Wisconsin group, USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，与己 知豆科科植物苜蓿(ife力'ca《0 tr朋catoh)中FNSII基因同源性很高，具体见表 1。酵母表达证实SEQ ID NO. 1是大豆黄酮合成酶基因，与已报导的苜蓿(ife力'c浙o z^朋caz^Ja， DQ354373)中FNSII同源度为64%、欧亚甘草(Wycyrr/wia ec/wV ate， AB001380 )为62%、非洲菊(( erZ7era Ar力nVa， AF156976)为65%,金鱼草 (力T7 z^rr力i/7柳历aJ〃s， AB028151)为66% ，三色蓳(7bre/w'a /7yZ7nVa， AB028152) 为65% ，翠菊(Caih'"ep/ "5 c/w'/ e/7s^， AF188612)为66%，紫苏 (/feri7h /r"tesce/ s， AB045592)为66%，三花龙胆(G朋Ws/ a tri/7ors， AB193314)为 65%。
表1 GfnsII-l大豆黄酮合成酶蛋白与苜蓿MtFNSn的核苷酸序列的同源比较
表
MtFNS ------ATGGAACCTCTACTATTGGCCTTCACATTATTTCTTTCATCACTCATTTGCTAC 54
GFNS-1 ATGATTTCTGAGTCCCTCTTGTTAGTATTCC--TCATTGTCTTCATTTCTGCTTCCCTTC 58
MtFNS ATAATTTTCCAGCCA-ATTTTAAACCGTCACAAAAACCTCCCT-------CCATCGCCTC 106
GFNS-1 TCMACTCTTGTTTGTGAGAGAAAACMACCAAAGGCCCACTTGMGAACCCACCAAGCC 118
MtFNS TATTCMACTTCCGATCATTGGCCACATGCACATGTTAGGTCCCCTTCTCCACCACTCCT 166
GFNS-1 CACCTGCAATACCCATAATAGGTCATCTCCACCTCCTTAAACCCCTCATCCATCACTCAT 178
MtFNS TCGACCGCCTCTCCCAAAAATACGGACCAATATTTTCACTTAACTTTGGTTCCGTCCTCT 226
GFNS-1 TCCGAGACCTCTCTCTCCGATATGGGCCCCTCCTAAGCCTTCGAATTGGTTCCGTTAAGT 238
6MtFNS GCGTTGTTGCATCCACTCC-TCACTACGCMMCAAATCCTTCAMTCAACGAACACGCC 285GFNS-1 TCATAGTTGCAAGCACCCCATCACT-CGCCCMGAGTTTCTCAAGACCAACGAGCTCACA 297MtFNS TTTAATTGTCGTAATGAATCAACTGCMTTAMCGCCTCACCTAT—-GAAGCATCTCTA 342GFNS-1 TACTCTTCCCGCAAAATGAACATGGCCATCAACATGGTCACTTACCACAACGCCACGTTT 357MtFNS GCTTTTGCACCCTATGGCGAATATTGGAGATTTATTAAMAACTTAGTATGAATGAGCTT 402GFNS-1 GCGTTTGCACCTTACGACACTTACTGGAAGTTCATGAAAAAACTMGCACCACTGAGCTC 417MtFNS TTGGGCTCTCGTAGCATTAGTAGCTTCCAACACTTGCGTTTACAAGAGACTCACAACCTC 462GFNS-1 TTGGGMACAAMCCCTCGGACACTTCCTACCTATTCGGACGAGGGAAGTTCATGACATC 477MtFNS CTTAAGCTTTTCGCTGATAAAGCGMMACTACGAGGCTGTGAATGTGACACAAGAGTTG 522GFNS-1 ATTCAATTTTTGTTCCATAAATCAAAGGCCCAAGAGAGCGTGAACCTCACCGAAGCGCTT 537MtFNS CTAAAGTTGTCAAACAACGTCATTTCTAAAATGATGTTGGGGG-----------------565GFNS-1 TTGAGTCTTTCCAACAACGTAATATCGCAGATGATGTTGAGCATTAAGAGCTCCGGTACA 597MtFNS -------AAGCTGAGGAGGCTAGGGATGTTGTGCGAGATGTGACCGAGATTTTTGGAGAG 618GFNS-1 GACAGCCAGGCAGAGCAGGCACGGACTTTGGTTCGTGAAGTGACGCAGATTTTCGGGGAG 657MtFNS TTTAATGTATCGGATTTTATTTGGTTGTTTAAGAAACTTGATTTGCAAGGGTTTGGGAAG 678GFNS-1 TTTAACGTGTCGGATTTCTTAGGTTTCTGCAMAACTTGGACTTGCAAGGTTTCAGGAAG 717MtFNS AGGATAGAGGATTTGTTTATGAGGTTTGATACATTGGTGGAMGGATTATTAGTAAAAGA 738GFNS-1 AGGGCATTGGACATACATAAGAGGTACGATGCTCTGCTAGAGAAGATCATCTCTGATCGT 777MtFNS GAAGAGTTGAGGAAGAACAAAGGMGGAAAGAAAATAAGGGTGAGCAAGGTGCTGAATTC 798GFNS-1 GAGGAGTTGAGAAGGAAATCMAGGTAGATGGCTGTGAAGATGGAGATGATGAGAAAGTG 837MtFNS AGAGACTTTCTTGATATATTGCTTGATTGTGCCGAGGATCAAAATTCAGAAATAAAAGTT 858GFNS-1 AAGGATTTTCTTGACATTTTGTTGGATGTTGCTGAGCAGAAAGAATGCGAGGTCCAGTTA 897MtFNS CAMGGGTTCACATCAAGGCCTTGATTATGGATTTCTTTACAGCAGGAACAGACACAACA 918GFNS-1 ACTCGGAACCATGTCAAATCATTGATCTTGGATTATTTTACGGCAGCTACTGACACAACT 957MtFNS TCMTTTCAACAGAATGGGCATTAGTTGAGCTAATGAACAACCCTTCATTGTTACAAAAA 978GFNS-1 GCCATATCAGTGGAATGGACAATAGCAGAACTATTTAACAATCCMAGGTGTTMAGAAA 1017MtFNSGCTCGTGAAG嵐TAGACAATGTAGTAGGGAAAAACAGACTAGTAGATGAATCTGACGGA 1038GFNS-1 GCGCAAGAGGAAGTTGATAGAGTCACCGGMACACGCAATTAGTGTGTGAAGCAGACATT 1077MtFNSCCMATCTTCCTTATATTCAAGCCATMTMAAGAMCATTTCGTCTACACCCACCGGTT 1098GFNS-1 CCAAACCTTCCTTATATTCATGCCATCATAAAAGAAACMTGAGACTTCACCCGCCAATA 1137MtFNSCCTATGGTCACTAGMGATGTGTCACGCAATGCAAAATTGAAAATTATGTGATCCCAGAA 1158GFNS-1 CCMTGATTATGAGGAAAGGMTCGAAGACTGCGTGGTTAATGGAAACATGATTCCAAAA 1197MtFNSAATAGTTTAATCTTTGTGAATAATTGGGCTATGGGAAGMACTCAGCTTATTGGGACAAA 1218GFNS-1 GGTTCAATAGTTTGTGTAAACATTTGGGCTATGGGAAGGGACCCAAATATCTGGAAGAAC 1257MtFNSCCATTGGMTTTAATCCAGAMGATTTCTAAAAAATTCMCAAATTCCAATGGGGTTATT 1278GFNS-1 CCTTTAGMTTCAAGCCAGAGAGGTTTCTAGAAGGTGAAGGAAGT---------GCTATA 1308MtFNSGATGTGAGGGGGCAMATTTTCAGATTTTGCCATTTGGGTCAGGMGMGGATGTGTCCT 1338GFNS-1 GATACCAMGGGCATCATTTTGAGTTGTTGCCATTTGGCAGTGGAAGGAGAGGGTGTCCT 1368MtFNSGGGGTTACTTTAGCMTGCAAGAAGTTCCAGCTTTGCTTGGTGCCATAATTCAATGCTTT 1398GFNS-1 GGMTGCCTTTGGCCATGCGTGAATTGCCCACCATCATTGGAGCACTCATACAATGCTTT 1428MtFNSGATTTTAATTTTGTGGGTCCTAAGGGTGAGATTTTGAAGGGTGGTGATATTGTTATTGAT 1458GFNS-1 GAGTGGAAGATGTTAGGTTCACAAGGTGAMTCTTAGATCATGGAAGAAGCTTMTCAGT 1488MtFNSGTGAATGMAGGCCAGGATTGACTGCTCCTAGGGTGCATGATTTGGTTTGTGTTCCTGTT 1518GFNS-1 ATGGATGMCGGCCAGGATTGACTGCCCCAAGGGCCAATGATCTTATTGGCATTCCTGTT 1548MtFNS GAAAGGTTTGCTTGTGGTGGACCTCTTCAMGCCTTGGATGTTGA 1563 GFNS-1 GCACGATTGAATCCCACTCCTTTTCGTCAAA—TGTAG------- 1584GFNS-1: GfnsII-1大豆黄酮合成酶核苷酸序列； MtFNS:苜蓿fnsll的核苷酸序列(DQ354373); "*"表示一致的序列。 步骤二、 GfnsII-l大豆黄酮合成酶基因的表达和鉴定 1、 GFNSII-1酵母表达载体的构建 用AbH和5"朋B I分别酶切GFNSII-1和pPIC9K (购自invitrogen公司)酵母表达载体，按照pPIC9K: GFNSII-1摩尔浓度比为1: 3的比例，用T4连接酶16 。C连接过夜，将连接产物导入大肠杆菌DH5 a 。挑选阳性克隆，提取质粒，用^^ II酶切成线性质粒。2、 转化酵母(1) 挑取酵母GS115 (购自invitrogen公司)单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml三角瓶中，30°C， 250r/min-300r/min培养过夜；YPD培养基购自 上海生物工程有限公司，内含1%酵母抽提物，2%胰蛋白胨，2%右旋葡萄糖，各百 分数均为质量百分比；(2) 取100!il的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28 。C 30。C, 250r/min 300r/min培养过夜，至OD,达到1. 3 1. 5;(3) 将细胞培养物于4'C， 1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将 菌体沉淀重悬；(4) 4°C， 1500g离心5min，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；(5) 4°C， 1500g离心5min，用20ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；(6) 4°C， 1500g离心5min，用lml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀 重悬，其终体积约为1.5ml;(7) 将5u g 20n g的用设JII酶切成线性质粒的溶解在1 10u 1 TE溶 液中，与80u l感受态的酵母混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；(8) 将电转化杯冰浴5min;(9) 电击完毕后，加入lml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的 灭菌管中；(10) 将菌体悬液涂布于MD平板上，该MD平板具体为0. 34%酵母基础氮源 培养基，1%的硫酸铵，0.00004%生物素，2%葡萄糖，2%琼脂，各百分数均为质量 百分比；每200n 1 600u 1涂布一块平板；(11) 将平板置于30'C培养，直至单个菌落出现。3、 GFNSII-1在酵母中表达(1)挑选阳性菌落，置于装有25mlMGY培养基的250ml摇瓶中，于28匸_30 。C， 250rpm-300rpm培养至OD600为2-6;其中MGY培养基为0. 34%酵母基础氮源培养基，1%的硫酸铵，1%甘油，0.00004%生物素，各百分数均为质量百分比；(2) 室温下，1500g 3000g离心5min，收集菌体，用薩溶液重悬菌体，加 入100ml 200ml觀溶液，其中MM溶液中含质量分数为0. 34%酵母基础氮源培养基， 质量分数为1%的硫酸铵，质量分数为0. 00004%的生物素，体积分数为0. 5%的甲醇， 使菌体0D6。。=1.0;(3) 将重悬菌体置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28。C -30。C， 250rpm 300rpm的摇床上继续生长；(4) 每24h向培养基中添加纯甲醇至甲醇终体积分数为0. 5% 1. 0%;(5) 按0、 6、 12、 24、 36、 48、 60、 72、 84和96h时间点分别取菌液样品， 取样量为lml，置于1.5mlEP管中，16， 000g离心2 min 3min，分别收集上清和 菌体，分析GFNSII-1的表达量；(6) 测定GFNSIH的酶活性(Martens S. and Forkmann G. Genetic control of flavone synthase II activity in flowers of Gerbera hybrids. Phytochemistry， 1998, 49(7) : 1953-1958.非洲菊中控制黄酮合成酶II的基因. 植物化学，1998年，49巻第七期，1953-1958页)，表明GFNS II-l具有完全黄酮 合成酶活性。实施例2GfnsII-2大豆黄酮合成酶基因的克隆、表达和鉴定 大豆组织的处理、TRIzol法提取根中的总RNA实施例1中相同。 步骤一，GfnsII-2基因cDNA的克隆以根中总RNA为模板，用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反 转录为cDNA。用正向引物5'-ATGATATCTGAGTCCCTCTTGTTAG-3，和反向引物 5'-CTACACTTGAGGAAAAGAGGTGGG-3'所列的引物与高保真的Taq酶PCR得 到1600bp左右的片断，连入pMD18—T载体，导入大肠杆菌DH5a 。测序验证得到 SEQIDNO. 2，测序结果用GCG软件包(Wisconsin group, USA)中的BLAST和FASTA 软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知豆科科 植物苜蓿(J/e力'c浙o tr朋cato")中FNSII基因同源性很高，具体见表2。酵母 表达证实SEQ ID NO. 2是大豆黄酮合成酶基因，与已知的苜蓿(ife力'cago tr"/7cst〃7a， DQ354373)中FNSII同源度为63%、欧亚甘草(W/c/rr/ i^3 ec力i"ata，AB001380)为59。/。、非洲菊(6"er/ era /y^rjVa， AF156976)为66%、金鱼草 (^y "rr/ i"，历aAB028151)为65% ，三色董(7bre/7ia /u^rjVa， AB028152) 为65% ，翠菊(Ca〃istep/ 〃s c/LZ'/7e/7sis， AF188612)为66%，紫苏 (Zferz77a /]r"tesce77s， AB045592)为67%，三花龙胆(6te/7tia/ a tri/7ora， AB193314)为 65%。表2 Gf ns II -2大豆黄酮合成酶蛋白与苜蓿MtFNS II的核苷酸序列同源比较表MtFNS ------ATGGAACCTCTACTATTGGCCTTCA-CATTATTTCTTTCATCACTCATTTGCT- 52GFNS-2 ATGATATCTGAGTCCCTCTTGTTAGTATTCCTCATTGTCTTCATTTCTGCTTCCCTTCTC 60MtFNS --ACATAATTTTCCAGCCAATTTTAAACCG-----TCACAAMACCTCCCTCCATCGCCT 105GFNS-2 AAACTCTTGTTTGTGAGAAAAAACAAACCMAGGCTCACTTGAAGTACCCTCCMGCCCC 120MtFNS CTATTCAMCTTCCGATCATTGGCCACATGCACATGTTAGGTCCCCTTCTCCACCACTCC 165GFNS-2 CCAGCAATAC—-CCATAATAGGTCATCTCCACCTCCTTAAACCACTCATCCATCACTCA 177MtFNS TTCGACCGCCTCTCCCAAAAATACGGACCMTATTTTCACTTAACTTTGGTTCCGTCCTC 225GFNS-2 TTCCGAGACCTTTCTCTCCGATATGGGCCCCTCCTAAGCCTTCGMTTGGTTCCGTTAAG 237MtFNS TGCGTTGTTGCATCCACTCOTCACTACGCAMACAAATCCTTCMATCAACGAACACGC 284GFNS-2 TTCATAGTTGCMGCACCCCATCACT-CGCCMAGAGTTTCTCAAGACCAACGAGCTCAC 296MtFNS CTTTAATTGTCGTAATGAATCAACTGCAATTMACGCCTCACCTAT—-GAAGCATCTCT 341GFNS-2 ATACTCTTCCCGCAMATGAACATGGCCATCMCACGGTCACCTACCACAACGCCACTTT 356MtFNS AGCTTTTGCACCCTATGGCGAATATTGGAGATTTATTAMAAACTTAGTATGAATGAGCT 401GFNS-2 CGCGTTTGCACCTTACGACACTTACTGGAAGTTCATGAMAMCTAAGCACCACTGAGCT 416MtFNS TTTGGGCTCTCGTAGCATTAGTAGCTTCCAACACTTGCGTTTACMGAGACTCACAACCT 461GFNS-2 CTTGGGAMCAAAACCCTCGGACACTTCCTACCTATTCGAACTCAGGAAGTTCATGACTT 476MtFNS CCTTAAGCTTTTCGCTGATAAAGCGAAAAACTACGAGGCTGTGAATGTGACACMGAGTT 521GFNS-2 TATTCAAATTTTGTTCCATAAATCAAAGGCCCAAGAGAGCGTGAACCTCACCGMGCGCT 5 36MtFNS GCTAAAGTTGTCAAACAACGTCATTTCTAAAATGATGTTGGG-------------GGAA- 567GFNS-2 TTTGAGGCTTTCCAACAACGTCATATCGCGGATGATGTTGAGCATTAAGAGCTCCGGAAC 5恥MtFNS ----------GCTGAGGAGGCTAGGGATGTTGTGCGAGATGTGACCGAGATTTTTGGAGA 617GFNS-2 TGATAGTCAGGCAGAGCAGGCACGGGCTTTGGTTCGTGMGTGACGCGGATTTTCGGGGA 656MtFNS GFNS—2
GTTTAATGTATCGGATTTTATTTGGTTGTTTAAGAAACTTGATTTGCMGGGTTTGGGAA 677 GTTTAACGTGTCGGATTTCTTAGGGTTTTGCMAAACATGGACTTGCMAGTTTCAGGAA 716
MtFNS GFNS—2
GAGGATAGAGGATTTGTTTATGAGGTTTGATACATTGGTGGMAGGATTATTAGTAAAAG 737 GAGGGCATTGGACATACATAAGAGGTACGATGCTCTGCTAGAGAAGATCATCTCTGATCG 776
MtFNS GFNS-2
AGMGAGTTGAGGAAGAACAMGGAAGGAAAGAAAATAAGGGTGAGCMGGTGCTGAATT 797 TGAGGAGTTGAGAAGGAMTCAMGGMGAGGGTTGTGAAGATGGAGGTGATGAGAAAGT 836
MtFNS GFNS—2
CAGAGACTTTCTTGATATATTGCTTGATTGTGCCGAGGATCAAAATTCAGMATAMAGT 857 TAAGGATTTTCTTGACATTTTGCTGGATGTTTCTGAGCAGAMGAATGCGAGGTCCAGTT 896
MtFNS GFNS—2
TCMAGGGTTCACATCAAGGCCTTGATTATGGATTTCTTTACAGCAGGAACAGACACAAC 917 AACTCGGMCCATGTCAAATCATTGATCTTGGATTATTTTACGGCAGCTACTGACACAAC 956
MtFNS GFNS—2
ATCAATTTCAACAGMTGGGCATTAGTTGAGCTAATGAACAACCCTTCATTGTTACAAAA 977 TGCCATATCAGTGGAATGGACAATAGCAGAACTATTCAACAATCCAAAGGTGTTGMGAA 1016
MtFNS GFNS—2
AGCTCGTGAAGAAATAGACAATGTAGTAGGGAAAAACAGACTAGTAGATGAATCTGACGG 1037 AGCTCMGAGGAGGTAGAGAMGTCACCGGAAACAAGCGATTAGTGTGTGMGCAGACAT 1076
MtFNS GFNS—2
ACCAAATCTTCCTTATATTCMGCCATAATAMAGAAACATTTCGTCTACACCCACCGGT 1097 TTCAAACCTCCCTTATATTCATGCCATCATTMAGAAACAATGAGACTTCACCCGCCAAT 1136
MtFNS GFNS—2
TCCTATGGTCACTAGAAGATGTGTCACGCAATGCAAAATTGMAATTATGTGATCCCAGA 1157 ACCAATGATTACGAGGAMGGAATCGMGACTGCGTGGTTAATGGAAACATGATTCCAAA 1196
MtFNS GFNS-2
AAATAGTTTAATCTTTGTGAATAATTGGGCTATGGGAAGAAACTCAGCTTATTGGGACAA 1217 AGGTTCAATAGTTTGCGTAAACATTTGGGCTATGGGGAGGGACCCAAATATCTGGMGAA 1256
MtFNS GFNS-2
ACCATTGGAATTTAATCCAGAAAGATTTCTAAAAAATTCAACAAATTCCAATGGGGTTAT 1277 CCCTTTAGAATTCATGCCAGAGAGGTTTCTAGAAGGTGMGGAAGT---------GCTAT 1307
MtFNS GFNS—2
TGATGTGAGGGGGCAAAATTTTCAGATTTTGCCATTTGGGTCAGGAAGAAGGATGTGTCC 1337 AGATACCMAGGGCATCATTTTGAGTTGTTGCCATTTGGTAGTGGAAGGAGAGGGTGTCC 1367
MtFNS GFNS—2
TGGGGTTACTTTAGCAATGCAAGAAGTTCCAGCTTTGCTTGGTGCCATAATTCAATGCTT 1397 TGGAATGCCTTTGGCCATGCGTGAATTGCCCACTTTCATTGGAGCACTCATACTGTGTTT 142 7
12MtFNS TGATTTTAATTTTGTGGGTCCTAAGGGTGAGATTTTGAAGGGTGGTGATATTGTTATTGA 1457
GFNS-2 TGAGTGGAAGATGTTTGGTTCACMGGTGMATCTTAGACCACGGAAMAGTTTAATCAA 1487
MtFNS TGTGAATGAAAGGCCAGGATTGACTGCTCCTAGGGTGCATGATTTGGTTTGTGTTCCTGT 1517
GFNS-2 CATGGATGAACGACCAGGATTGACTGCTCCAAGGGCCAATGATCTTATTGGCATTCCTGT 1547
MtFNS TGAAAGGTTTGCTTGTGGTGGACCTCTTCAAAGCCTTGGATGTTGA 1563 GFNS-2 TGCACGATTGAATCCC-----ACCTCTTTT-—CCTCAAGTGTAG- 1584
GFNS-2: Gfns II _2大豆黄酮合成酶核苷酸序列； MtFNS:苜蓿f ns II的核苷酸序列(DQ354373); "*"表示一致的序列
步骤二、 GFNSII-2黄酮合成酶表达和鉴定 1 、 GFNS II -2酵母表达载体的构建
用Abf I和5"朋B I分别酶切GFNS II _2和pPIC9K (购自invitrogen公司)酵 母表达载体，按照pPIC9K: GFNSII-1摩尔浓度比1: 3的比例，用T4连接酶16 'C连接过夜，将连接产物导入大肠杆菌DH5ci中。挑选阳性克隆，提取质粒，用
《wn酶切成线性质粒。
2、 转化酵母
转化方法与实施例l相同。
3、 GFNSII-2在酵母中表达
(1) 挑选阳性菌落，置于装有25ml MGY培养基的250ml摇瓶中，于28'C-30 °C ， 250rpm-300rpm培养至0D6。。为2-6;
(2) 室温下1500g 3000g离心5min,收集菌体，用MM重悬菌体，加入100 200ml丽溶液，使0D,二1.0;
(3) 将重悬菌体置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28'C -30。C， 250rpm 300rpm的摇床上继续生长；
(4) 每24h向培养基中添加纯甲醇至甲醇终体积分数为0. 5% 1. 0%;
(5) 按0、 6、 12、 24、 36、 48、 60、 72、 84和96h时间点分别取菌液样品， 取样量为lml，置于1.5mlEP管中，16， OOOg离心2 min 3min，分别收集上清和菌体，分析GFNSI1-2的表达量；
(6)测定GFNSII-2的酶活性(Martens S. and Forkmann G. Genetic control of flavone synthase II activity in flowers of Gerbera hybrids. Phytochemistry， 1998， 49(7) : 1953-1958.非洲菊中控制黄酮合成酶II的基因. 植物化学，1998年，49巻第七期，1953-1958页)，表明GFNSII_2具有完全黄酮 合成酶活性。
实施例3
GfnsII-1与GfnsII-2基因RNAi植物表达载体的构建与功能鉴定 步骤一，GfnsII-1与GfnsII-2基因RNAi植物表达载体的构建 鉴于GfnsII-l与GfnsII-2基因的高度同源性，取两基因序列近3'端完全 相同的约300bp作为构建RNAi植物表达载体的目的片断。设计扩增出目的片断的 引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，具体视选用的载体而 定，以便构建表达载体。以实施例1中获得的GfnsII-l为模板，构建RNAi载体 只要其中一个基因为模板就可以。经PCR扩增及酶切后，以正反不同方向连接在 含有CaJ/K 5"5"启动子与nos终止子的pHannibal质粒上，中间以一段内含子片断 隔开，此为RNAi表达载体。为了使载体能够在植物中转化表达，再将构建好的RNAi 载体上的CaMV35S启动子、正义片断、内含子、反义片断、终止子一起切下，连 接到经pCAMBIA1304+pBI121质粒上。得到的最终产物经过序列分析及酶切验证即 为所需的RNAi植物表达载体，导入到农杆菌LBA4404，可用于植物转化分析。 步骤二，转化大豆品种合丰47
(1) 大豆种子经过消毒，放在MSB5培养基上萌发5天，MSB5培养基具体为 MS大量成分(Murashige and Skoog， 1962) + B5微量成分(Gamborg et al， 1968)， 含0.4mg/L 6-BA(6-节氨基嘌呤)，pH值为5.8;去顶芽并制造伤口，得到外植体， 放在含有10mg/L的6-BA和0. 2 mg/L的IBA， ffl为5. 8的MSB5培养基预培养一 天；
(2) 无菌条件下，用含有构建的GfnsII基因RNAi植物表达载体的农杆菌 LBA4404感染大豆品种合丰47，时间为10分钟 20分钟，感染时菌浓度为0D6M "0. 5，放在MSB5+6-BA 1. 0mg/L+ IBA 0. 2 mg/L培养基上共培养3天，该培养基 的pH为5. 8;取出放在MSB5+6-BA 0. 5mg/L+ IBA 0. 1 mg/L+头孢霉素300 mg/L+羧苄青霉素300 mg/L培养基上除菌2周，该培养基的pH为5. 8;
(3) 除菌后的外植体放在MSB5+卡那霉素80 mg/L培养基上，该培养基的pH 为5. 8;每2周转接一次，进行筛选至出现不定芽。伸长到lcm 2cm时切除子叶， 至伸长到3 4cm;
(4) 切下外植体上的不定芽并放在1/2 MSB5+卡那霉素50 mg/L培养基上， 该培养基的PH为5. 8;进行转化芽诱导生根15 20天，移栽到大盆直至获得转化 植株产生的种子；
(5) 收获T2代种子，进行分析
步骤三，GfnsII基因RNAi植物表达载体的功能鉴定
根据Northern blot和RealTime PCR分析结果证明，转基因植株Gfns II基因 转录水平表达量显著减弱，干扰效率对照非转基因植株平均达到95%以上。在HPLC 分析中，转基因植株在三羟基异黄酮与总黄酮(黄豆甙原+豆素+羟基异黄酮)含 量上高于对照非转基因植株15%-25%。
豆科植物中已发现的植保素到目前为止有102种，主要是类异黄酮的衍生物， 用低浓度的异黄酮类植保素一大豆素处理大豆疫霉根腐病菌的菌丝，发现它可以 抑制固体培养基中的菌丝的辐射生长；鉴于植物最主要的一种方式是依赖于植物 叶片中广泛存在的类黄酮化合物，可以吸收280nm-315咖波长的辐射，起着"UV 过滤器"的作用，可以保护植物体器官，尤其是光合作用组织免受或少受辐射伤 害。鉴于类黄酮在玉米抗铝中毒中有特定的作用，耐铝毒害玉米品种在铝诱导条 件下，可在10 mm根尖处分泌类黄酮化合物儿茶精与槲皮素；铝敏感品种的根大 量分泌五羟基黄酮与儿茶素等类黄酮化合物，并以固定比例与铝结合。
通过Gfns II -1与Gfns II -2基因脂Ai ，可进一步对转基因植株Gfns II基因进 行抗大豆疫霉根腐病、抗铝毒害、抗UV—B等方面的鉴定。在接种大豆疫霉根腐 病黑龙江省流行的15号优势生理小种条件下，转基因植株根系正常，非转基因植 株根腐病严重，植株生长缓慢，最后枯萎而死；在铝毒害50txmol/LAr胁迫24h 条件下，耐铝毒害转基因品种在铝诱导条件下，可在10mm根尖处分泌类黄酮化合 物儿茶精与槲皮素，非转基因植株生长缓慢，最后枯萎而死，转基因植物依然能 正常生长；在紫外线辐射UV—B (280nm-315nm)条件下，突变体光合作用效率明 显下降，而野生型则保持正常。转基因植株接种大豆疫霉根腐病；铝毒害和紫外
15线辐射的逆境条件下明显表现出比对照未转基因植株生长正常。这都证明GfnsII 基因具有有效的和广泛的抗逆境的功能，将可用于利用转基因技术改良大豆疫霉
根腐病、抗铝毒害、抗UV — B的研究和产业化生产中。序列表
<110〉上海交通大学 〈120〉黄酮合成酶基因及其编码的多肽 〈歸 4
<170〉 Patentln version 2.1 〈210〉 1 〈211> 1584 〈212〉 DNA
〈213〉 大豆(67，'/ e迈ar (L ) Merr.) 〈220〉 〈221〉 CDS
〈222〉 (1)…(1584) 〈400〉 1
atgatttctg agtccctctt aaactcttgt ttgtgagaga cctgcaatac ccataatagg cgagacctct ctctccgata atagttgcaa gcaccccatc tcttcccgca aaatgaacat tttgcacctt acgacactta ggaaac犯aa ccctcggaca caatttttgt tccataaatc agtctttcca acaacgtaat agccaggcag agcaggcacg aacgtgtcgg atttcttagg gcattgga^c3 tacat肌gag gagttgagaa ggaaatcaaa gattttcttg acattttgtt cggaaccatg tcaaatcatt atatcaigtgg肌tggacaat c肌gaggaag ttgatagagt aaccttcctt atattcatgc atgattatga ggaaagg肌t tcaatagttt gtgta幼cat ttagaattca agccagagag catcattttg agttgttgcc gccatgcgtg aattgcccac ttaggttcac aaggtgaaat ccaggattga ctgccccaag cccactcctt ttcgtcaaat
〈210> 2 〈211〉 527 <212> PRT 〈213> 大豆(67，'/ e鹏i (L) Merr.) 〈400〉 2
Met lie Ser Glu Ser Uu Leu Leu Val Phe Uu lie Val Phe lie 1 5 10 15
gttagtattc ctcattgtct tcatttctgc ttcccttctc 60
aaacaaacca aaggcccact tgaagaaccc accaagccca 120
tcatctccac ctccttaaac cccteatcca tcactcattc 180
tgggcccctc ctaagccttc gaattggttc cgttaagttc 240
actcgcccaa gagtttctca agaccaacga gctcacatac 300
ggccatcaac atggtcactt accacaacgc cacgtttgcg 360
ctggaagttc atgaaaaaac taagcaccac tgagctcttg 420
cttcctacct attcggacga gggaagttca tgacatcatt 480
aaaggcccaa gagagcgtga acctcaccga agcgcttttg 540
atcgcagatg atgttgagca ttaagagctc cggtacagac 600
gactttggtt cgtgaagtga cgcagatttt cggggagttt 660
tttctgcaaa aacttggact tgcaaggttt caggaagagg 720
gtacgatgct ctgctagaga agatcatctc tgatcgtgag 780
ggtagatggc tgtgaagatg gagatgatga gaaagtgaag 840
ggatgttgct gagcagaaag aatgcgaggt ccagttaact 900
gatcttggat tattttacgg cagctactga cacaactgcc 960
agcagaacta tttaacaatc caaaggtgtt aaaga犯gcg 1020
caccggaaac acgcaattag tgtgtgaagc agacattcca 1080
catcataaaa gaaacaatga gacttcaccc gccaatacca 1140
cgaagactgc gtggttaatg gaaacatgat tccaaaaggt 1200
ttgggctatg ggaagggacc caaatatctg gaagaaccct l加O
gtttctagaa ggtgaaggaa gtgctataga taccaaaggg 1320
atttggcagt ggaaggagag ggtgtcctgg aatgcctttg 1380
catcattgga gcactcatac aatgctttga gtggaagatg 1440
cttagatcat ggaagaagct taatcagtat ggatgaacgg 1500
ggccaatgat cttattggca ttcctgttgc acgattgaat 1560
gtag 1584Ser Ala SerLeuLeuL ysLeuLeuPheValArgGluAsnLysPro
20 25 30
Lys Ala HisLeuLysAsnProProSerProProAlalieProlie
35 40 45
lie Gly HisLeuHisLeuLeuLysProLeulieHisHisSerPhe
50 55 60
Arg Asp LeuSerLeuArgTyrGlyProLeuLeuSerLeuArglie
65 70 75
Gly Ser ValLysPhelieValAlaSerThrProSerLeuAlaGin
80 85 90
Glu Phe LeuLysThrAsnGluLeuThrTyrSerSerArgLysMet
95 100 105
Asn Met AlalieAsnMetValThrTyrHisAsnAlaThrPheAla
110 115 120
Phe Ala ProTyrAspThrTyrTrpLysPheMetLysLysLeuSer
125 130 135
Thr Thr GluLeuLeuGlyAsnLysThrLeuGlyHisPheLeuPro
140 145 150
lie Arg ThrArgGluValHisAsplielieGinPheLeuPheHis
155 160 165
Lys Ser LysAlaGinGluSerValAsnLeuThrGluAlaLeuLeu
170 175 180
Ser Leu SerAsnAsnVallieSerGinMetMetLeuSerlieLys
185 190 195
Ser Ser GlyThrAspSerGinAlaGluGinAlaArgThrLeuVal
200 205 210
Arg Glu ValThrGinliePheGlyGluPheAsnValSerAspPhe
215 220 225
Leu Gly PheCys Lys Asn Leu Asp Leu Gin Gly Phe Arg Lys Arg230 235 240
Ala Leu AsplieHisLysArgTyrAspAlaLeuLeuGluLyslie
245 250 255
lie Ser AspArgGluGluLeuArgArgLysSerLysValAspGly
260 265 270
Cys Glu AspGlyAspAspGluLysValLysAspPheLeuAsplie
275 280 285
Leu Leu AspValAlaGluGinLysGluCysGluValGinLeuThr
290 295 300
Arg Asn HisValLysSerLeulieLeuAspTyrPheThrAlaAla
305 310 315
Thr Asp ThrThrAlalieSerValGluTrpThrlieAlaGluLeu
320 325 330
Phe Asn AsnProLysValLeuLysLysAlaGinGluGluValAsp
335 340 345
Arg Val ThrGlyAsnThrGinLeuValCysGluAlaAspliePro
350 355 360
Asn Leu ProTyrlieHisAlalielieLysGluThrMetArgLeu
365 370 375
His Pro ProlieProMetlieMetArgLysGlylieGluAspCys
380 385 390
Val Val AsnGlyAsnMetlieProLysGlySerlieValCysVal395400405
AsnlieTrpAlaMetGlyArgAspProAsn lieTrpLysAsnPro
410415420
LeuGluPheLysProGluArgPheLeuGlu GlyGluGlySerAla
425430435
lieAspThrLysGlyHisHisPheGluLeu LeuProPheGlySer
440445450
GlyArgArgGlyCysProGlyMetProLeu AlaMetArgGluLeu
455460465
ProThrlielieGlyAlaLeulieGinCys PheGluTrpLysMet
470475480
LeuGlySerGinGlyGlulieLeuAspHis GlyArgSerLeulie
485490495
SerMetAspGluArgProGlyLeuThrAla ProArgAlaAsnAsp
500505510
LeulieGlylieProValAlaArgLeuAsn ProThrProPheArg
515520525
GinMet
527
<110>上海交通大学
<120>黄酮合成酶基因及其编码的多肽
<160> 4
<170> Patentln version 3. 1 <210> 3 <211> 1584 <212> DNA
<213> 大豆(67y"'/7e顶股(L) Merr.)
〈220〉
〈221> CDS
<222> (1)…(1584) 〈400〉 3
atgatatctgagtccctcttgttagtattcctcattgtcttcatttctgcttcccttctc60
aaactcttgtttgtgagaaaaaac aaac c aaaggctcacttgaagtaccctccaagcccc120
ccagcaatacccataataggtcatctccacctcctta幼ccactcatccatcactcattc180
cgagacctttctctccgatatgggcccctcctaagccttcgaattggttccgttaagttc240
atagttgcaagcaccccatcactcgccaaagagtttctcaag3ccaacg3gctcacatac300
tcttcccgcaggccatcaacacggtcacctsccacaacgccactttcgcg360
tttgcaccttacgacacttactggaagttctaagcaccactgagctcttg420
ccctcggacacttcctacctattcgaactcagg犯gttcatgactttatt480
caaattttgttccataaatcaaaggcccaag卿gcgtgaacctcaccgaagcgcttttg540
aggctttccaacaacgtcatatcgcggatgatgttgagcattaagagctccggaactgat600
agtcaggcagagcaggcacgggctttggttcgtgaagtgacgcggattttcggggagttt660
aacgtgtcggatttcttagggttttgcaaaaacatggacttgcaaagtttcaggaagagg720
gcattggacatacaitaagaggtacgatgctctgctagagaagatcatctctgatcgtgag780
gagttg柳aggaagagggttgtg肌gatggaggtgatgag肌agtt肌g840gattttcttg acattttgctggatgtttctgagc卿犯g朋tgcg鄉tccagttaact900
cgg犯cc3tg tcaaatcattgatcttggattattttacggcagctactgacacaactgcc960
3tatc3gtgg犯tggac犯tttcaacaatcC8犯ggtgttgaag333gct1020
caagaggagg tag卿卿tC3CCgg333C33gCg3tt3gtgtgtg肌gc3gacatttc31080
aacctccctt atattcatgcgacttcacccgccaatacca1140
3tg3tt3cga gga肌ggeiatcgaagactgcgtggtt组gtccaaaaggt1200
tcaatagttt gcgtaaacatttgggctatggaagaaccct1260
tta^ga^ttc3 tgccagagaggtttctagaaggtg犯ggaagtgct3tagataccaaaggg1320
catcattttg agttgttgccatttggtagtgg卿g卿gggtgtcctggaatgcctttg1380
gccatgcgtg犯ttgcccactttcattggagcactcatactgtgttttgagtgg卿atg1440
tttggttcac aaggtgaaatcttagaccacgga犯aagtttaatcaacatggatgEieicga1500
ccaggattg3 ctgctccaagggCCMtg3tcttattggcattcctgttgcacgattgaat1560
cccacctctt ttcctcaagtgteg1584
<210> 4
〈211> 527
<212> PRT
<213> 大豆(67y"'"e鹏x (L.) Merr.)
<棚> 4
Met lie SerGluSerLeuLeuLeuValPheLeulieValPhelie
1 5 10 15
Ser Ala SerLeuLeuLysLeuLeuPheValArgLysAsnLysPro
15 20 30
Lys Ala HisLeuLysTyrProProSerProProAlalieProlie
35 40 45
lie Gly HisLeuHisLeuLeuI>ysProLeulieHisHisSerPhe
50 55 60
Arg Asp LeuSerLeuArgTyrGlyProLeuLeuSerLeuArglie
65 70 75
Gly Ser ValLysPhelieValAlaSerThrProSerLeuAlaLys
80 85 90
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95 100 105
Asn Met AlalieAsnThrValThrTyrHisAsnAlaThrPheAla
110 115 120
Phe Ala ProTyrAspThrTyrTrpLysPheMetLysLysLeuSer
125 130 135
Thr Thr GluLeuLeuGlyAsnLysThrLeuGlyHisPheLeuPro
140 145 150
lie Arg ThrGinGluValHisAspPhelieGinlieLeuPheHis
155 160 165
Lys Ser LysAlaGinGluSerValAsnLeuThrGluAlaLeuLeu
170 175 180
Arg Leu SerAsnAsnVallieSerArgMetMetLeuSerlieLys
185 190 195
Ser Ser GlyThrAspSerGinAlaGluGinAlaArgAlaLeuVal
200 205 210
Arg Glu ValThrArgliePheGlyGluPheAsnValSerAspPhe
215 220 225
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AlaLeuAsplieHisLysArgTyrAspAlaLeuLeuGluLyslie
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lieSerAspArgGluGluLeuArgArgLysSerl>ysGluGluGly
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485490495
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500505510
LeulieGlylieProValAlaArgLeuAsnProThrSerPhePro
515520525
GinVal
52权利要求
1、一种黄酮合成酶基因，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1584位所示的核苷酸序列。
2、 一种根据权利要求1所述的黄酮合成酶基因编码的多肽，其特征是，具有 SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
3、 一种黄酮合成酶基因，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO. 3中从核苷酸 第1-1584位所示的核苷酸序列。
4、 一种根据权利要求3所述的黄酮合成酶基因编码的多肽，其特征是，所述 基因序列编码具有SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及的是生物技术领域的黄酮合成酶基因及其编码的多肽。其中①一种黄酮合成酶基因具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1584位所示的核苷酸序列，该黄酮合成酶基因编码的多肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；②另一种一种黄酮合成酶基因具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第1-1584位所示的核苷酸序列，该黄酮合成酶基因编码的多肽具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。本发明可获得在高异黄酮、抗WGE、抗铝毒害、抗UV-B等方面具有重要特性的大豆品种；利用本发明的大豆黄酮合成酶，通过各种常规筛选方法，可筛选出与大豆黄酮合成酶相关发生相互作用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等。
文档编号C12N15/52GK101514344SQ20091004635
公开日2009年8月26日 申请日期2009年2月19日 优先权日2009年2月19日
发明者刘贤雯, 姚陆铭, 姜伊娜, 武天龙, 彪 王 申请人:上海交通大学