专利名称：胡杨8种microRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及胡杨(Populus euphratica)8种microRNA及其应用
背景技术：
胡杨(Populus euphratica)是唯一能在干旱盐碱和温差剧烈变化的干旱沙漠地 区生长的乔木建群树种。作为天然的抗逆性极强的典型植物，胡杨已引起国际学术界的重 视。研究、开发和利用胡杨抗逆性基因资源，对于深入林木抗逆性机理以及定向培育抗逆林 木新品种具有重要的价值。MicroRNAs (microRNA)是一类来自真核生物自身基因组的非编码小RNA，长度约 为17 25个核苷酸，在mRNA降解，基因翻译抑制和染色体修饰过程中发挥着重要的调控 作用。由于不同物种之间microRNA的序列和功能拥有高度的同源性，microRNA很有可能 代表着较为原始的生理调控机制。在对植物的研究中发现，microRNA的表达量明显受到逆 境环境因子的调节，因此选择具有典型抗逆性植物材料胡杨(Populus euphratica,Oliv)， 研究在干旱和高盐胁迫下胡杨中的microRNA的调控机制，对于发现新的microRNA、研究 microRNA及其目标蛋白的作用机制、培育高抗逆性新品种具有深远的基础研究和应用研究 价值。
发明内容
本发明采用常规分子生物学实验方法，分离得到胡杨总RNA，使用商业试剂盒分离 小于40bp的small RNA部分，回收得到的small RNA两端连接RNA-DNA复合接头，经反转录 后得到胡杨的small RNA cDNA文库，将此文库连接到载体中克隆测序后获得1780个small RNA序列，通过生物信息学分析最终确定8个胡杨新的microRNA序列命名为peu-miRl至 peu_miR8。胃^ 卞艮ig microRNA(http //microrna. sanger. ac. uk/) ^ W l^iJI/!5^ 设计引物，使用荧光定量PCR的方法分析peu-miRl至peU-miR6在胡杨中受干旱胁迫的表 达情况及正负调控作用情况。peu-miR7、8在杨树microRNA数据库没有同源序列，为胡杨所 特有的microRNA。本发明的目的是提供8种新的胡杨抗旱相关microRNA、前体及其反义序列，该发 明涉及以上所述microRNA、microRNA前体及其反义序列在提高植物抗旱抗逆性状中的应
j IJ o
序列如下；
peu-miRlUUGACAGAAGAUAGAGAGCAC
peu_miR2UUUUCCCUACUCCACCCAUCCC
peu_miR3UGCACUGCCUCUUCCCUGG
peu_miR4UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA
peu_miR5CAGAAUUGCAGUGCCUUGAUU
peu_miR6UCGCUUGGUGCAGGUCGGGAA
peu-miR7 :UAGUUGGUGGAGCGAUUU⑶Cpeu-miR8 :UCUCGGACCAGGCUUCAUUCCC前体序列peu-miRl 前体GGUGAU⑶UGUUGACAGAAGAUAGAGAGCACAGAUGAUGAUAUGCAAUGGACUCUGCAUCCCACUCCUU U⑶GCUCUCUAUGCUUCU⑶CAUCACUUUCApeu_miR2 前体UUAUCGGGUGGGUGAGCGGGGAAGAUAACUUUG⑶UUUUGAGAUA⑶ACUU⑶UAUUUUCCCUACUCCA CCCAUCCCAUApeu-miR3 前体AGAGACAGAUGAAGACGGGGAACAGGCAGAGCAUGGAUGGAGCUACUAACAGAAGUACUU⑶UUUGGCU CUACCCAUGCACUGCCUCUUCCCUGGCUU⑶GGCUCpeu-miR4 前体GGUUCCUUGCUGGAGAAGCAGGGCACGUGCAAAAUCCUGAUGAAGUGCUUACACUUUGCACGCGCUCUU CUUCUCCAACACGGGCpeu-miR5 前体GAGGCCCUAAUCAGGGCACUGCAAUUCUAAAUGUCUGUUGGCAAGUGGCGAUGCCAGAC⑶UUGAAAUU UACUUAUCAUUUAUUA⑶CAGAAUUGCAGUGCCUUGAUUUGGGCUUUpeu-miR6 前体GGUCUCUAAUUCGCUUGGUGCAGGUCGGGAACUGAUUCGGCGAUUUGAUUGCCAGAUGGCUAAACACGA UUGGCU⑶GAGGCAAAUUAUAAAAAGAAAGAGAAUUGGAUCCCGCCUUGCAUCAACUGAAUCGGAGApeu-miR7 前体UAGUUGGUGGAGCGAUUUGUCUG⑶UAAUUCC⑶UAACGAACGAGACCUCAGCCUGCUApeu-miR8 前体GGGAAUGCUGUCUG⑶UCGAGACCAUUCACCUGAAGAGCACGCAUUCAUCUUUUGA⑶GAUCUCGGACC AGGCUUCAUUCCC据此，本发明所提供的七种胡杨microRNA反义寡核苷酸包含如下任一种序列peu-miRl 反义寡核苷酸AACTGTCTTCTATCTCTCGTCpeu-miR2 反义寡核苷酸AAAAGGGATGAGGTGGGTAGGGpeu-miR3 反义寡核苷酸ACGTGACGGAGAAGGGACCpeu-miR4 反义寡核苷酸ACCTCTTCGTCCCGTGCACGTpeu-miR5 反义寡核苷酸GTCTTAACGTCACGGAACTAApeu-miR6 反义寡核苷酸AGCGAACCACGTCCAGCCCTTpeu-miR7 反义寡核苷酸ATCAACCACCTCGCTAAACAGpeu-miR8 反义寡核苷酸AGAGCCTGGTCCGAAGTAAGGG据此，本发明提供的8种新型胡杨mirocRNA前提基因在杨树染色体上的定位分别 为peU-miRl前体基因定位于杨树基因组十五号染色体上；peU-miR2前体基因定位于杨树 基因组scaffold_131上；peU-miR3前体基因定位于杨树基因组二号染色体上；peU_miR4 前体基因定位于杨树基因组二号染色体上；peU-miR5前体基因定位于杨树基因组十三号染色体上；peU-miR6前体基因定位于杨树基因组scaffold_86上；peU_miR7前体基因定位 于杨树基因组EST序列gi 52374032 ；peU-miR8前体基因定位于杨树八号染色体上。本发明所提供的8种胡杨新型microRNA均来自胡杨成熟叶片细胞，成熟microRNA 序列的长度为17 25nt，其前体序列均可形成microRNA前体的典型二级结构，符合 microRNA的结构特征。RT-PCR和实时荧光定量PCR检测结果表明，8种新型胡杨microRNA 在受到干旱胁迫诱导的胡杨材料中均有表达，且表达程度随干旱胁迫强度的增加呈现规律 性变化，说明这8种microRNA在胡杨调节自身水分利用效率时具有重要的生物学功能。因 此，在胡杨不同组织中过表达peu-miR-1 peu-miR-8、peu-miR-1 peu-miR-8前体分子 或采用microRNA反义寡核苷酸抑制peu-miR-l peu-miR-8的表达将影响胡杨的水分利 用效率和应对水分胁迫的能力。
图1为8种胡杨新microRNA序列；图2为8种胡杨新microRNA前体序列；图3为8种胡杨新microRNA反义寡核苷酸；图4为8种胡杨新microRNA的典型hairpin 二级结构图；图5为RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果；左侧marker从下往上大小依次为20bp，40bp，60bp，80bp，lOObp...第二至第九泳 道依次为8种杨树microRNA基因RT-PCR产物，据图得知所得PCR产物长度在60bp左右与 microRNA加上两侧结头的长度相符合。图6为不同干旱处理条件下microRNA的实时荧光定量PCR检测结果；microRNA荧光定量PCR结果显示，peu-miRl，3，5，6表达量在干旱诱导的初期 (15分钟 1小时内)明显升高，表明peu-miRl，3，5，6参与胡杨受干旱诱导的正调控。 peu-miR2，4表达量在干旱诱导的初期(2小时内)明显降低，表明peu_miR2，4参与胡杨受 干旱诱导的负调控。测序结果表明peU-miR7，8为胡杨区别于其他杨树品种的microRNA，其 本身与胡杨抗旱生理特性相关。
具体实施例方式实施例1，胡杨总RNA的提取、small PNA的分离在2ml离心管中加入1. 5ml、CTAB-PVA buffer,加入2 %终体积的巯基乙醇后， 65°C温育；用液氮研磨胡杨材料后，按0. Ig材料/lml buffer的比例加入65°C抽提液中， 剧烈震荡；65°C,10min水浴，其间振荡2 3次；15000r/min,4°C, IOmin离心取上清；等体 积V(苯酚)V(氯仿)V(异戊醇)=25 24 1抽提2次，每次充分振荡5min，离 心(15000r/min,4°C, IOmin)；取上清加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(ρΗ5· 2)，2. 5倍体积 的无水乙醇，充分混勻，_80°C，沉淀10 30min ；离心(15000r/min，4°C，IOmin)，去上清后 用80%乙醇洗沉淀，溶于50 μ LRNase-free水；_80°C保存备用。使用 Ambion 公司出 品的的 FlashPAGETM Fractionator 及 FlashPAGETMReaction Clean-Up Kit，根据标准操作方法从总RNA中分离小于40nt的smallRNA。应用该实施例可 以从植物组织中分离得到含有全部mi croRNA的smallRNA.
实施例2，构建胡杨smal 1 RNA反转cDNA文库及RT-PCR检测使用Takara公司出品的small RNA cloning kit，对Small RNA进行反转录克隆。 首先将Small RNA进行BAP处理，5’端去磷酸化。BAP处理后的Small RNA的3’端与生物 素化的RNA/DNA接头连接。用标记Str印to avidin的磁珠，回收带有生物素的RNA/DNA接 头的Small RNA，然后进行5’端磷酸化反应。将5’端连接上RNA/DNA嵌合的接头后，使用 RT Primer和M-MLV反转录酶进行反转录反应。从磁珠上回收合成的cDNA后，进行RT-PCR 反应，反转录及 RT-PCR 的引物为PCR-R&RT-Primer :5，-GTCTCTAGCCTGCAGGATCGATG-3，； 5，-AAAGATCCTGCAGGTGCGTCA-3，。PCR片段或经限制酶酶切后的DNA片段的回收、克隆、测 序。应用该实施例可以得到包含植物材料microRNA的smallRNA序列信息。实施例3，胡杨microRNA序列分析克隆测序得到到胡杨small RNA序列去除接头序列后，使用perl (http://www. perl, org/)程序筛选长度在17 25nt的序列、去除冗余。使用blast (http //www, ncbi. nlm. nih. gov/blast)程序将 small RNA 序列与杨树基因组(http://genome, jgi-psf. org/ poplar/)进行比对；使用perl程序于smallRNA在基因组上的位置左右各150bp截取序列， 使用 RNAfold(http://rna. tbi. univie. ac. at/cgi-bin/RNAfold. cgi)软件对截取的序列 进行hairpin 二级结构分析。使用mircheck软件综合分析microRNA前体hairpin 二级 结构，根据文献(Jones-Rhoades, M. ff. , Bartel, D. P. and Bartel, B. (2006)MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annu. Rev. Plant. Biol. 57,19-53.)中的方法蹄选 mircheck的结果，最终获得七种新型胡杨microRNA序列及其二级发卡结构。应用该实施例 可以从大量small RNA序列中筛选出microRNA序列。实施例4，胡杨microRNA实时荧光定量PCR胡杨的干旱胁迫处理将一年生胡杨幼苗整株游离土壤，清洗后暴露在37°C培养 箱中。在经过15分钟、1小时、2小时、4小时、6小时收集材料立即冻于-80°C液氮中。按照 实施例1、2的方法提取材料总RNA、分离small RNA。用NEB公司的poly (A)聚合酶给从总RNA中分离的得到的small RNA加上poly A 尾。在 50ul 反应体系中力口入 1. 5ug small RNA、5ul poly A polymerase、5ul 10X 缓冲 液、lmmol/1 ATP，37°C反应1小时，使用苯酚/氯仿抽提，_80°C沉淀1小时，15000rpm离心 30分钟，弃上清后用70%的乙醇洗涤沉淀，将沉淀重溶于40ul水中，加入50um的oligo dT 锚定引物(GCTGTCAACGATACGCTACCTGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTA、G CTGTCAACGATACGCTACCTGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG、GCTGTCAACGAT ACGCTACCTGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTC) 5ul、MMLV 5ul、10 X 缓冲液 lOulUOum dNTP 10ul、ddH20 30ul。42°C反应1小时、72°C 15分钟而后置于冰上冷却得到 microRNA实时荧光定量PCR的cDNA模板。使用ABI公司的Power SYBR Green Mix试剂盒进行定量PCR反应。在20ul体系 中加入cDNA模板 lul、正反向引物各 lul、2. 5uM dNTP lul、2XPower SYBRGreen Mix 10ul、 ddH20 6ul。使用如下程序进行定量PCR反应并生成溶解曲线
Read fluorescence
lOmin
30sec
30sec
>
40 Cycles
60 °C30sec
95 °C15sec
60 °Clmin
95°C15sec Read fluorescence every+0. 3°C
正向引物
peu-miRl TTGACAGAAGATAGAGAGCAC peu-miR2 TTTTCCCTACTCCACCCATCC peu-miR3 :GCACTGCCTCTTCCCT peu-miR4 TGGAGAAGCAGGGCACGTGC peu-miR5 CAGAATTGCAGTGCCTTGAT peu-miR6 GCTTGGTGCAGGTCGGGAA 反向引物
通用反向引物ACGATACGCTACCTAACGGCAT
应用该实施例可以分析特定microRNA在植物应答特定生理胁迫中的作用( 序列表
<110>夏新莉、尹伟伦、李博生
<120>胡杨8种microRNA及其应用
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CN 10<223> 胡杨 microRNA-peu-miR7 反义寡核苷酸<400〉atcaaccacc tcgctaaaca g 21<210>24<211>22<212>RNA<213>人工序列<220><223> 胡杨 microRNA-peu-miR8 反义寡核苷酸<400>agagcctggt ccgaagtaag gg 2权利要求
八种胡杨新microRNA，其特征在于包含如下任一种microRNA序列1)peu-miR1UUGACAGAAGAUAGAGAGCAC2)peu-miR2UUUUCCCUACUCCACCCAUCCC3)peu-miR3UGCACUGCCUCUUCCCUGG4)peu-miR4UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA5)peu-miR5CAGAAUUGCAGUGCCUUGAUU6)peu-miR6UCGCUUGGUGCAGGUCGGGAA7)peu-miR7UAGUUGGUGGAGCGAUUUGUC8)peu-miR8UCUCGGACCAGGCUUCAUUCCC
2.根据权利要求1所述的八种胡杨microRNA的前体RNA包含如下序列 peu-miRl 前体G⑶GAU⑶UGUUGACAGAAGAUAGAGAGCACAGAUGAUGAUAUGCAAUGGACUCUGCAUCCCACUCCUUUGUG CUCUCUAUGCUUCU⑶CAUCACUUUCA peu-miR2 前体UUAUCGG⑶GG⑶GAGCGGGGAAGAUAACUUUG⑶UUUUGAGAUAGUACUU⑶UAUUUUCCCUACUCCACCCA UCCCAUApeu-miR3 前体AGAGACAGAUGAAGACGGGGAACAGGCAGAGCAUGGAUGGAGCUACUAACAGAAGUACUU⑶UUUGGCUCUAC CCAUGCACUGCCUCUUCCCUGGCUU⑶GGCUC peu-miR4 前体GGUUCCUUGCUGGAGAAGCAGGGCACGUGCAAAAUCCUGAUGAAGUGCUUACACUUUGCACGCGCUCUUCUUC UCCAACACGGGCpeu_miR5 前体GAGGCCCUAAUCAGGGCACUGCAAUUCUAAAUGUCUGUUGGCAAGUGGCGAUGCCAGAC⑶UUGAAAUUUACU UAUCAUUUAUUA⑶CAGAAUUGCAGUGCCUUGAUUUGGGCUUU peu_miR6 前体GGUCUCUAAUUCGCUUGGUGCAGGUCGGGAACUGAUUCGGCGAUUUGAUUGCCAGAUGGCUAAACACGAUUGG CU⑶GAGGCAAAUUAUAAAAAGAAAGAGAAUUGGAUCCCGCCUUGCAUCAACUGAAUCGGAGA peu-miR7 前体UAGUUGGUGGAGCGAUUUGUCUG⑶UAAUUCC⑶UAACGAACGAGACCUCAGCCUGCUA peu-miR8 前体GGGAAUGCUGUCUG⑶UCGAGACCAUUCACCUGAAGAGCACGCAUUCAUCUUUUGA⑶GAUCUCGGACCAGGC UUCAUUCCC
3.根据权利要求1所述的八种胡杨microRNA的反义寡核苷酸包含如下任一种序列1)peu-miRl反义寡核苷酸AACTGTCTTCTATCTCTCGTC2)peu-miR2反义寡核苷酸AAAAGGGATGAGGTGGGTAGGG3)peu-miR3反义寡核苷酸ACGTGACGGAGAAGGGACC4)peu-miR4反义寡核苷酸ACCTCTTCGTCCCGTGCACGT5)peu-miR5反义寡核苷酸GTCTTAACGTCACGGAACTAA6)peu-miR6反义寡核苷酸AGCGAACCACGTCCAGCCCTT7)peu-miR7反义寡核苷酸ATCAACCACCTCGCTAAACAG8)peu-miR8反义寡核苷酸AGAGCCTGGTCCGAAGTAAGGG
4.权利要求3所述的八种胡杨microRNA的反义寡核苷酸可以是DNA或RNA。
5.权利要求3所述的八种胡杨microRNA的反义寡核苷酸可以进行硫代、甲氧基修饰。
6.权利要求1 3所述的任一种寡核苷酸在改变植物性状和培育抗旱植物中的用途。
全文摘要
本发明提供了八种胡杨新的microRNA序列、microRNA前体序列和反义寡核苷酸序列，以及其在调节植物水分利用效率和提高植物抗旱性状中的用途。
文档编号C12N15/11GK101864415SQ20091000905
公开日2010年10月20日 申请日期2009年2月16日 优先权日2009年2月16日
发明者夏新莉, 尹伟伦, 李博生 申请人:夏新莉;尹伟伦;李博生