利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法

专利名称：利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域的检测方法，具体是一种利用发光细 菌检测水中急性生物毒性的方法。
技术背景发光细菌是一种特殊的海洋细菌，它能在清洁的水中存活并发光， 当水质受到污染时其发光能力会减弱。利用发光细菌在不同受污染水体 中发光强度的差异可以显示水质生物急性毒性的情况。采用发光细菌法 对水质进行监测具有时间短、灵敏度高的特点，而且还能弥补常规理化 监测的不足，因此被广为采用。目前传统发光细菌监测方法存在结果重 现性不高、使用剧毒物质氯化汞作为毒性参照物毒性较高、容易造成环 境污染等问题。因此有必要对现行检测方法作进一步改进，降低参照物 毒性，优化检测方法。经对现有技术文献检索发现，GB/T 15441-1995《中华人民共和国国 家标准水质急性毒性的测定发光细菌法》规定，基于发光细菌相对发 光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关(/^0.05)，因而可通过生物 发光度计测定水样的相对发光度，以此表示其急性毒性水平。水质急性 毒性水平选用相当的参比毒物氯化汞浓度(以mg/L为单位)来表征，以 测试样品相对HgCl2浓度来划分毒性等级。氯化汞是剧毒物质，购买需要 繁琐的环节，使用过程中和使用后都存在一定的风险。发明内容本发明针对现有技术的不足，提供了一种利用发光细菌检测水中急 性生物毒性的方法，使其可取代剧毒物质氯化汞作为毒性参照物，并且 可有效提高检测结果精度。本发明采用毒性相对较低的ZnS04代替氯化汞
HgCl2作为毒性参比，通过实验确定ZnS04与HgCl2的毒性比例，在水样毒 性划分时进行相应的转换，回避了剧毒物质的使用，并应用发光细菌(市 售产品)达到同样的对水质急性生物毒性进行测定的目的。本发明通过以下技术方法实现。本发明具体包括以下步骤第一步，发光细菌新鲜菌悬液的制备检测所用发光细菌为明亮发光杆菌T3小种(Photobacterium phosphoreum T3 spp.，为市售产品，在中科院南京土壤所购得)。检测 前对发光细菌进行筛选、斜面培养和摇瓶菌液培养获得初始发光度不低 于1. 5X106 RLU/S的新鲜菌悬液，备用。第二步，测试样品的处理与稀释本发明所监测的生物急性毒性不考虑pH的影响，因此需排除pH因 素。将测试水样和CK (对照)(氯化钠3g/100mL)pH调整为水样中的 含Cu量高于其他金属以及有机物含量时为4. 5，水样中不含Cu同时其 它金属含量高于有机物含量时为5.4，水样中有机物含量高于金属含量 时为7.0;测试水样一律采用蒸馏水稀释。定容前，按构成NaCl 3g/100mL浓 度投加NaCl。第三步，发光细菌新鲜菌悬液投加在20 25'C条件下用微量注射器吸取按第一步制备的发光细菌新鲜 菌悬液，将稳定的发光细菌新鲜菌悬液逐一加入各测试管，盖上瓶盖， 用手颠倒数次，静置后测定发光度。第四步，测试样品急性毒性的计算参比毒物采用ZnS04，配制参比毒物系列标准溶液后分别置于5mLCK 管中，每管中加入第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液，充分混匀后进行 相对发光度测定。各测试水样的发光强度变化以相对发光度表示，计算 公式为样品管相对发光度=样品管的发光度(RLU/S) / CK (对照) 管的发光度(RLU/S)。根据不同参比毒物浓度时的相对发光度，以相对发光度为纵轴，参
比毒物浓度为横轴作图并进行线性拟合，通过参比毒物浓度与相对发光 度之间的相关方程，可计算出相对发光度减少50%时所测样品以ZnS04 浓度表示的ECs。值。通过以HgCl2为参照毒物的平行试验可得到HgCl 溶 液的毒性为同浓度ZnS(V溶液的12.458倍，以此换算可得测试样品以 HgCl2表示的急性毒性。本发明采用毒性相对较低的ZnS04代替剧毒物质氯化汞作为毒性参 比，通过实验确定ZnS04与HgCl2的毒性比例，在水样毒性划分时进行相 应的转换，回避了剧毒物质的使用，并应用发光细菌达到同样的对水质 急性生物毒性进行测定的目的。同时选择ZnS04作为毒性参照来代替 HgCl2不仅降低了检测成本、减弱了毒性、扩大了监测范围，而且具有较 好的稳定性。以HgCl2为毒物参比时，发光细菌的测试灵敏度为 0.025mg/L;而以ZnS04为毒物参比时，可明显提高发光细菌的测试灵敏 度，小于0.01mg/L。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案 为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发 明的保护范围不限于下述的实施例。实施例采用三种参比毒物0. OOmg / L 2. OOmg / L的ZnCl2系列标 准溶液；0. 00mg/L 2. 25mg/L的ZnS04系列标准溶液和0. 5 6mg / L的 HgCl2系列标准溶液进行比较实验。整个实施实现过程如下1.按以下要求准备实施材料，其中参比毒物采用ZnCl2、 ZnS04和 HgCL三种(这三种化学物质均有市售，但HgCl2属剧毒物质，需公安部 门审批并特殊输送)；测试菌种明亮发光杆菌T3小种(PhotobacteriumphosphoreumT3 spp.)，中科院南京土壤所可购得的市售产品。稀释液3%NaCl， 2%NaCl。单管发光检测仪Tube Luminometer Sirius V3. 1;恒温振荡器，培 养箱，高温灭菌器；10uL或20uL微量移液器，lmL注射器，容量瓶， 三角瓶等。2.实施方法2. 1发光细菌新鲜菌悬液的制备(1) 筛选菌种取所购发光细菌菌种涂布培养48h，挑取各种菌落 细菌进行镜检，挑选出所需发光细菌的菌落。(2) 斜面菌种培养测定前取发光细菌于新鲜斜面上接出第一代斜 面，20士0.5。C培养24h后立即转接第二代斜面，20土0.5。C培养24h， 再接出第三代斜面20土0.5。C培养12h后备用。每次接种量不超过一接 种环。(3) 摇瓶菌液培养取第三代斜面菌种近一环，接种于装有50mL 培养液的250mL三角瓶内，20±0. 5°C， 184rpm / min下培养12 14h备 用。(4) 将培养液稀释至每毫升108 109个细胞，初始发光度不低于 1. 5X106 RLU/S，备用。2.2样品的处理与稀释所监测的生物急性毒性不考虑pH的影响，因此需排除pH因素。将 测试水样和CK (对照)(氯化钠3g/100mL)pH调整为水样中的含Cu量 高于其他金属以及有机物含量时为4. 5，水样中不含Cu同时其它金属含 量高于有机物含量时为5. 4，水样中有机物含量高于金属含量时为7. 0; 对于有色样品测定干扰的校正参照GB/T 15441-1995的细则。样品采用蒸馏水稀释。定容前，按构成NaCl 3g/100ml的浓度投加 NaCl。2. 3发光细菌新鲜菌悬液投加在20 25'C条件下用微量注射器吸取10 u L发光细菌新鲜菌悬液， 将稳定的发光细菌新鲜菌悬液按样品排列顺序逐一加入各测试管(具标 准磨口塞，为制造比色管的玻璃料制作，由专业玻璃仪器厂制造)，盖上 瓶盖，用手颠倒数次，静置后采用单管发光检测仪测定发光度。2.4.测试样品急性毒性的计算 参比毒物采用ZnCl2、 ZnS(X和HgCl2三种，配制参比毒物系列标准溶 液后分别置于5mLCK管中，每管中加入步骤2. 1中制备的发光细菌新鲜 菌悬液，充分混匀后进行相对发光度测定。各标准样品的发光强度变化 以相对发光度表示，计算公式为样品管相对发光度=样品管的发光度 (RLU/S) / CK (对照)管的发光度(RLU/S)。根据不同参比毒物浓度时的相对发光度，以相对发光度为纵轴，参 比毒物浓度为横轴作图并进行线性拟合，通过参比毒物浓度与相对发光 度之间的相关方程，可计算出相对发光度减少50%时所测样品的浓度即 ECs。值。3.对每个参照毒物所对应的标准样品进行10组平行实验，分别计算 出它们的EC5。值。对所得结果进行统计学分析，检测结果如表l所示。表1毒性参照的重复测定结果 类别/组数 最小值最大值平均值标准偏差变异系数/% ZnCl2的EC50 0.968 1.202~"1. 1048 0.065 ZnS(X的EC5。
1.032 1.21 1.1499 0.054 4.71 HgCl2的ECs。
0.086 0.1030.0923 0.005 5.37结合3个实施例的变异系数分析，ZnS(X最小，为4.71%，数据比较 整齐；其次为HgCL，为5.37%;最大的是ZnCl2，为5. 88%。经过10组 数据的比较，HgCl2溶液的毒性为同浓度ZnS04溶液的12.458倍。不难看 出，选择ZnS04作为毒性参照来代替HgCl2不仅降低了实施成本、减弱了 毒性、扩大了监测范围，而且具有较好的稳定性。
权利要求
1、一种利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征在于，包括以下步骤第一步，发光细菌新鲜菌悬液的制备检测所用发光细菌为明亮发光杆菌T3小种，检测前对发光细菌进行筛选、斜面培养和摇瓶菌液培养获得初始发光度等于或者大于1.5×106RLU/S的新鲜菌悬液，备用；第二步，测试样品的处理与稀释将测试水样和对照pH调整为水样中的含Cu量高于其他金属以及有机物含量时为4.5，水样中不含Cu同时其它金属含量高于有机物含量时为5.4，水样中有机物含量高于金属含量时为7.0；第三步，发光细菌新鲜菌悬液投加取第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液，将稳定的发光细菌新鲜菌悬液逐一加入各测试管，盖上瓶盖，用手颠倒数次，静置后测定发光度；第四步，测试样品急性毒性的计算采用ZnSO4作为参比毒物，配制参比毒物系列标准溶液后分别置于管中，每管中加入第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液，充分混匀后进行相对发光度测定，各测试水样的发光强度变化以相对发光度表示，计算公式为样品管相对发光度＝样品管的发光度/对照管的发光度。
2、 根据权利要求l所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其特征是，第一步中，所述发光细菌新鲜菌悬液的制备，具体步骤为(1) 筛选菌种取发光细菌菌种涂布培养，挑取各种菌落细菌进行镜检， 挑选出所需发光细菌的菌落；(2) 斜面菌种培养测定前取发光细菌于新鲜斜面上接出第一代斜面， 20士0.5。C培养24h后立即转接第二代斜面，20士0.5。C培养24h，再接出第三代 斜面20土0.5。C培养12h后备用；(3) 摇瓶菌液培养取第三代斜面菌种近一环，接种于装有50mL培养液 的250mL三角瓶内，20士0.5。C， 184rpm / min下培养12 14h备用；(4) 将培养液稀释至每毫升108 109个细胞，初始发光度等于或者大于 1.5X106 RLU/S，备用。
3、 根据权利要求2所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其 特征是，步骤(1)中，所述培养，其时间为48h。
4、 根据权利要求2所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其 特征是，步骤(2)中，每次接种量等于或者小于一接种环。
5、 根据权利要求1所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其 特征是，第二步中，所述测试样品的处理与稀释，具体为测试水样采用蒸馏 水稀释，定容前，按构成NaCl 3g/100mL浓度投加NaCl。
6、 根据权利要求l所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其 特征是，第三步中，所述取第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液，是指在20 25'C条件下用微量注射器吸取按第一步制备的发光细菌新鲜菌悬液。
7、 根据权利要求l所述的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，其 特征是，第四步中，所述测试样品急性毒性的计算，具体为根据不同参比毒 物浓度时的相对发光度，以相对发光度为纵轴，参比毒物浓度为横轴作图并进 行线性拟合，通过参比毒物浓度与相对发光度之间的相关方程，计算出相对发 光度减少50%时所测样品以ZnS04浓度表示的ECs。值，通过以HgCl2为参照毒物的 平行试验可得到HgCl2溶液的毒性为同浓度ZnS04溶液的12. 458倍，以此换算得 测试样品以HgCl2表示的急性毒性。
全文摘要
一种环境监测技术领域的利用发光细菌检测水中急性生物毒性的方法，首先制备发光细菌新鲜菌悬，然后将测试水样pH调整为水样中的含Cu量高于其他金属以及有机物含量时为4.5，水样中不含Cu同时其它金属含量高于有机物含量时为5.4，水样中有机物含量高于金属含量时为7.0；采用ZnSO₄作为参比毒物，配制参比毒物系列标准溶液后分别置于管中，每管中加入发光细菌新鲜菌悬液，充分混匀后进行相对发光度测定，各测试水样的发光强度变化以相对发光度表示，计算公式为样品管相对发光度＝样品管的发光度/对照管的发光度。本发明回避了剧毒物质的使用，并应用发光细菌达到同样的对水质急性生物毒性进行测定的目的。
文档编号C12Q1/02GK101131384SQ20071004647
公开日2008年2月27日 申请日期2007年9月27日 优先权日2007年9月27日
发明者白晓慧, 良 马 申请人:上海交通大学