具有整合微流化生物标记物光学检测阵列装置的发现工具和使用方法

专利名称：具有整合微流化生物标记物光学检测阵列装置的发现工具和使用方法
技术领域：
具体的实施方式涉及科学和医学研究，癌症、心血管疾病、糖尿病、肾病、肺病、病 毒性和细菌性传染病、以及神经变性、免疫学和代谢病等疾病的诊断。具体来说，提供了具 有相关科学和医学应用的生物标记物的检测，以及蛋白质和酶活性、相互作用、抑制和活化 的测量。
背景技术：
近年来，对于分子生理学的科学理解方面的快速发展受到许多因素的推动，其中 包括人类基因组序列的完成，以及对在生物学和医学上感兴趣的分析物进行高灵敏度和整 体性的并行检测系统的出现。具体来说，用于感兴趣的生物分析物或生物标记物的这些检 测系统在科学研究中变得越来越重要，尤其是对临床病人而言。采用光谱检测系统的分析 方法经常被用于检测和量化生物标记物，经常提供关于生物标记物与各种测试分子的相互 作用的信息。这些化验方法可以在分子诊断术的鉴定、表征和显影过程中在一开始就采用， 也可以作为分子诊断测试采用从而对生物样品进行化验。因此，这些化验方法可以用来测 量病人的健康状态，或者用来提供能支持医疗决策的信息。拉曼光谱是一种测量单色光的非弹性散射(称为拉曼散射)的光谱技术，常用于 查询样品的分子振动或转动状况。通常采用可见光、近红外光或近紫外光范围的激光来激 发样品/体系。然后激光光子的能量向上或向下迁移(称为拉曼效应或拉曼迁移)，这种能 量的迁移(波长、频率或波数)提供了关于该体系的分子振动或转动状况的信息。当光与 分子或者与具有多个分子或原子的分子配合物的键的电子云相互作用时，发生拉曼效应； 因为入射光导致的电子云的变形量级是该分子极化性的反映，决定了反射能量的强度和频 率以及特征性的类似指纹的拉曼光谱。表面增强的拉曼光谱(SERS)是一种高灵敏度的方法，它能增强从小样品发射的 低概率或弱拉曼光谱的信号强度。事实上已经证明SERS能检测单个分子的拉曼光谱。用 于对生物学或医学上感兴趣的分析物进行检测的SERS系统通常将感兴趣的分析物、底物 或配合物固定在固体上或者固定在与固体相邻的位置，所述固体通常是金属或金属合金表 面，或者是与其他具有拉曼增强、阻抑或调节能力的非金属材料配合的金属。通常将其称为 SERS-活性结构。感兴趣的分析物、底物或配合物与金属表面和金属表面衍生物之间的相互 作用导致强度得到增大或调节，和得到特定曲线的拉曼散射辐射。因此，可以根据其产生的 特征性的类似指纹的拉曼光谱，检测和比较不同的结合事件和化学反应，例如磷酸化作用 和脱磷酸作用。在生物学和医学应用中使用SERS对于直接测量在医学和科学上感兴趣的分子相 互作用以及蛋白质和酶的活性而言具有巨大的潜力。具体来说，可以采用SERS测量蛋白 质_底物结合结合事件和反应，例如那些涉及例如蛋白质_蛋白质、蛋白质_小分子、小分 子-小分子、核酸_蛋白质、和核糖蛋白-核酸的相互作用。所以，这种应用的可能能够进行单分子检测的灵敏度为检测非常低拷贝数的蛋白质和来自稀少细胞的溶胞产物组分提 供了可能。虽然近年来在DNA(序列)、RNA(基因表达技术)和蛋白质(蛋白质组学)的高 通量测量方面取得了进展，但是目前在技术上仍然没有达到对蛋白质活性、尤其是酶活性 的高通量测量。这种信息在医学和科学上显然都是很有价值的。例如，虽然人们已经清楚 了解病人的完整DNA序列或者细胞中所有基因或蛋白质水平表达的价值，但是事实上了解 细胞中所有蛋白质的活性能提供更多信息，代表了更高层次的生物学信息。这是因为蛋白 质组水平的信息直接与功能和细胞表型相关。微流化装置和整合微流化装置的系统采用与固体基材相连或整合的小毛细管或 微通道在许多分析、化学和生化应用中进行非常小规模的操作。例如，整合微流化装置可以 首先采用电场，以有效分离核酸、蛋白质或感兴趣的其他大分子，然后使用微型检测系统对 分离产物进行表征和分析。这些微流化装置采用非常小的反应体积实现这些操作，所述反 应体积可以比常规方法小至少几个量级。这些系统的小尺寸使得能够利用较小的试剂体积 增大反应速率，占用远少得多的实验、临床或工业空间。因此微流化系统能够提供有吸引力 的效率增益，从而获得明显的经济优点。微流化装置特别适合进行采用光谱检测系统的分析方法。有多种光谱技术能与微 流化装置联合使用，包括光散射光谱如拉曼光谱。在研究或工业设定中，微流化装置通常用 于利用光谱检测系统来量化标记的或未标记的感兴趣的分子的生化化验或基于细胞的化 验中。例如，这种化验测量用候选的感兴趣的小分子或生物药物处理之后的哺乳动物细胞 中的发绿色荧光的蛋白质的表达。另一个例子是在用于基因扩增的微流化装置中使用定量 的聚合物链反应技术(PCR)以及用嵌入的荧光染料作为光谱指示剂进行分析。其他例子包 括但并不限于普通的酶反应和生化反应，化学反应，相变检测等。微流化装置通常采用微型通道和储存器的整合网络，其中对材料进行传输、混合、 分离和检测，整合网络中嵌有各种检测器和传感器或者将它们设置在外部用于定量，还包 括致动器和其他附件用于操作流化样品。复杂材料传输系统的发展使得可以开发易于自动 化操作和高度可重现性的系统。这些操作可自动进行，可以结合在高通量系统中，在许多工 业和研究应用中获得巨大优点。微流化装置经常使用塑料作为基材。虽然聚合物材料能提 供容易制造、低成本和可用性的优点，但是聚合物材料容易产生荧光。例如，用激发光照射 样品时，光散射器可能导致明显的背景信号，特别是当激发路径和发射路径相同时。还可以 使用其他材料，如玻璃、硅、金属和金属氧化物。对生物标记物进行分析很快成为疾病早期检测、病人分级管理和监控治疗功效的 优选方法。对生物标记物的变化进行快速而高灵敏度的检测在技术上经常是不可能的，或 者可能需要涉及多个处理步骤、必需使用大样品体积并延长诊断/预后时间的冗长程序。 来自病人的样品的体积经常是有限的，不能进行处理或者进行需要多个步骤的延长处理时 间的程序。本发明的装置和方法提供了相当多的优点，能够减轻这些问题，使得可以在实时 的微流化环境中进行生物和化学样品的SERS光谱检测。发明概述在一种实施方式中，本发明涉及将SERS基材整合到微流化系统中。所述SERS基 材包括多种纳米规格的结构，例如纳米柱、纳米环、纳米三角形、纳米蝴蝶结、纳米球、纳米 棒和/或纳米螺旋。
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在一种实施方式中，本发明提供一种使用表面增强的拉曼光谱(SERS)系统测定 目标生物分子的活性的方法。所述方法包括将流体样品引入微流化光学室中，该光学室包 括具有从其延伸的多个基材的拉曼活性表面。流体样品通过微流化光学室的通路使得流体 样品中的生物分子与所述许多基材之间发生特定的结合和/或相互作用。流化样品中的酶 或蛋白质对表面固定的生物分子通过化学基团的裂解或加成产生作用。这些变化的作用可 通过在表面上用SERS读取拉曼信号而得到检测。在一种实施方式中，本发明对于洗涤流体样品具有最小程度的要求，或者没有这 种要求。可以在流化样品中的分子不产生明显干扰的情况下对表面结合的生物分子的变化 进行测量。在一些实施方式中，将激光引导至微流化光学室中的流体样品，激光与流体样品 的相互作用产生SERS信号，该信号对于该生物分子和该基材之间的相互作用而言是特定 的。在一些实施方式中，可以在与所述多个基材结合之后对生物分子的拉曼散射光谱 的变化进行记录，从而检测该生物分子的存在、数量和/或活性。在一种实施方式中，将细胞溶解，将溶胞产物施涂于SERS表面上的目标分子，而 不对来自该溶胞产物的酶进行纯化。不进行酶醇化步骤使得能够对酶活性进行直接快速测 量，并减小因为样品操作造成的偏差。在一种实施方式中，不需要用额外的标签对目标蛋白质进行标记。在另一种实施方式中，在表面上以微阵列形式、或直线行列形式、或折叠通道形式 如蜿蜒通道固定一组蛋白酶底物肽。在另一种实施方式中，在酶底物上偶联拉曼标签分子、金属离子和/或纳米复合 物以增强拉曼信号。还可以在样品中加入有机溶剂来增强拉曼信号。在一种实施方式中，在表面上以微阵列形式、或直线行列形式、或折叠通道形式如 蜿蜒通道固定一组激酶底物肽。在一种实施方式中，样品体积等于或小于10微升，在一种优选的实施方式中，样 品体积小于1微升。进行检测要求的浓度范围可以等于或小于1微摩尔。在一种实施方式中，可以实时而不是以终点方式进行反应动力学的测量，符合本 领域标记方法的要求。可以以大约1毫秒/次测量至1分钟/次测量的数据速率从反应获 得多个数据点，持续时间约为1分钟至24小时。在另一个实施方式中，在实时测量中不需要清洗步骤，因为SERS检测是一种近场 光学检测方法，因此只能检测SERS基材表面的分子反应情况。在距离该表面大约100纳米 处发生的反应不会对信号产生明显影响。在该实施方式中，通过背景化合物从SERS基材表 面的自然或受促的扩散，实现对背景化合物产生的噪声的去除。在另一种实施方式中，可以通过采用多通道微流化系统进行多通道测量。这些测 量可以同时完成而不会互相干扰。在一种实施方式中，可使用高速光学扫描系统以适时方式对多个通道进行扫描。 在一种具体的实施方式中，高速光学系统包括使用马达驱动的检流镜来扫描多个样品。在一种实施方式中，微流化操作完全自动进行，包括样品装载、样品混合、试剂交 换、样品加热和温度控制等。流化致动方法包括但并不限于机械泵抽，光抽运和热抽运。
在一种实施方式中，可以在光学测量过程中控制液体流动，以便进行试剂混合，增 大溶胞反应最终产物从表面的扩散，并防止分子沉淀，等等。在另一种实施方式中，可以使用偏振激光器作为激发源，以增大的信噪比测量分 子手征性。附图简要描述联系附图并通过以下详细描述能最好地理解具体实施方式
。需要强调的是，根据 惯例，附图的各特征不一定要求是成比例的。在一些情况中，可以为了清楚起见任意地放大 或缩小各特征的尺度。

图1A-1F显示根据本发明实施方式制造基于硅的表面增强的拉曼散射(SERS)基 材装置的方法实例。图2A-2F显示根据本发明实施方式在SERS芯片上印刷各分子探针的过程图。图3A-3B显示根据本发明实施方式的具有示例性微流化分子诊断装置的完整组 件的组装过程实例。图4A-4B显示根据本发明实施方式的用于制造两通道装置的微型制造掩模的应 用实例。图5A-5B显示根据本发明实施方式在示例性微流化SERS芯片中进行蛋白酶和/ 或核酸酶生物标记物检测的原理。图6A-6B显示磷酸化事件的原理。根据本发明实施方式在示例性微流化SERS芯 片中检测到生物标记物的变化。图7A-7B显示根据本发明实施方式的整合孔板和硅微流化装置结构的示意图。图8显示根据本发明实施方式用于微流化蛋白酶/核酸酶生物标记物诊断装置的 荧光检测系统的示意结构图。图9显示根据本发明实施方式用于微流化蛋白酶/核酸酶生物标记物诊断装置的 拉曼检测系统的示意结构图。图10显示根据本发明实施方式用于微流化蛋白酶/核酸酶生物标记物诊断装置 的高通量拉曼检测系统的示意结构图。图11显示根据本发明实施方式进行激酶生物标记物检测时肽探针拉曼信号增强 的示意图。图12显示根据本发明实施方式制造用于微流化光学装置的结构的方法实例的流 程图。图13显示根据本发明实施方式制造用于发现流体样品特征的装置的方法实例的 流程图。图14显示根据本发明实施方式使用发现装置进行流体样品分析的方法实例的流 程图。图15显示检流镜图。该马达驱动的检流镜使得能够对多个底物配对 (coordinates)进行快速扫描。发明详述在描述本发明实施方式的方法和装置之前，应该理解本发明并不限于所述的任何具体实施方式
，因此当然是可以变化的。还应该理解，本文所用的术语的目的仅仅是描述具
7体实施方式，并不意在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限制。提供值的范围时，应该理解，还具体揭示了该范围上限和下限之间的各个居间值， 直至下限单位的十分之一，除非上下文中有清楚的其他指示。本发明包括指出范围中任何 指出值或居间值之间的各个较小的范围，以及该指出范围中任何其他指出值或居间值。这 些较小的范围的上限和下限可以独立地包括在该范围中或者被排除在外，本发明还包括各 个范围的上下限中的任何一个都包括在较小的范围中、或者这两个上下限都不包括在较小 的范围中、或者这两个上下限都包括在较小的范围中的情况，服从指出范围中被排除的任 何具体的限制。当指出范围包括该上下限中的一个或者包括这两个上下限的时候，本发明 还包括排除这些包括的界限中的任何一个或者排除这两个包括的界限的范围。除非有另外的定义，否则，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属 领域技术人员普遍理解的术语相同的含义。虽然本发明的实施或测试中可以使用与本文所 述类似或相同的任何方法和材料，但是，以下描述优选的方法和材料。本文提到的所有出版 物都通过参考结合于此，用于揭示和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。当本申 请与参考结合的出版物之前出现矛盾时，以本申请为准。必须注意，如本文所用以及在所附权利要求中，单数形式的“一个”、“一种”和“该” 包括复数指代物的情况，除非上下文中有另外的清楚指示。因此例如，对“一种肽”的引用 包括多种此类肽的情况，对“该方法”的引用包括一种或多种方法以及本领域技术人员已知 的其等同项的情况，等等。 本文讨论的出版物仅仅提供在本申请提交日期之前的揭示内容。不应将本文中的 内容理解为承认以下陈述，g卩，本发明并不先于这些作为现有技术的出版物。而且，提供的 出版日期可能与实际出版日期不同，需要进行单独确认。定义术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用，表示脱氧核糖核苷酸或核糖 核苷酸，以及单股或双股形式的它们的聚合物。该术语一般包括含有已知的核苷类似物或 改性的主链残基或连接的核酸，它们是合成的、天然产生的、和非天然产生的，具有与参照 核酸类似的结合性质，以与参照核苷类似的方式进行代谢。这些类似物的例子包括但并不 限于硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，膦酸甲酯，手征性_膦酸甲酯，2-0-甲基核糖核苷酸，肽_核 酸(PNA)。术语“氨基酸”表示天然产生的和合成的氨基酸，以及以与天然产生的氨基酸类似 的方式工作的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是那些通过遗传密码编码 的氨基酸，以及那些随后改性的氨基酸，例如羟基脯氨酸、羧基谷氨酸盐、和0-磷酸丝 氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然产生的氨基酸相同的基础化学结构的化合物，例如与 氢键合的碳、羧基、氨基和R基团，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。 这些类似物具有改性的R基团(如正亮氨酸)或改性的肽主链，但是保留与天然产生的氨 基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的一般化学结构、但是以 与天然产生的氨基酸类似的方式工作的化合物。如本文所用，“生物样品”是生物组织的样品或者被怀疑含有感兴趣的分析物的化 学流体。样品包括例如体液，如全血、血清、血浆、脑脊髓液、尿、淋巴液，和呼吸道、肠道和泌 尿生殖道的各种外分泌，如眼泪、唾液、精液、乳液等；以及其他生物流体，如细胞培养悬浮
8液、细胞抽提液、细胞培养上清液。样品还可包括组织活体检查，如来自肺、肝、脑、眼、舌、结 肠、肾、肌肉、心脏、胸、皮肤、胰腺、子宫、宫颈、前列腺、唾液腺等。样品还可以是显微活体检 查、小样品或者甚至是从病人提取并随后进行处理(例如使用激光捕获显微切割)的单细 胞。可以将样品悬浮或溶解在例如缓冲剂、提取剂、溶剂等中。样品可以来自任何天然产 生的生物体或重组的生物体，包括例如病毒、原核生物或真核生物、和哺乳动物(如啮齿动 物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物)。生物体可以是没有患病的生物体，怀疑患病的生物 体，或患病的生物体。取得样品的哺乳动物对象可能被怀疑患病，或者患有疾病，例如癌症、 自身免疫性疾病、或心血管疾病、肺病、胃肠疾病、肌与骨骼失调、中枢神经系统失调、传染 病(如病毒性、真菌性或细菌性感染)。术语“生物样品”还表示为了研究生物过程或者发 现或筛选候选药而有意产生的研究样品。这些样品包括但并不限于掺杂有细菌、病毒、DNA、 多肽、天然或重组蛋白质、金属离子、或候选药及其混合物的水性样品。术语“肽”和“肽化合物”在本文中可以互换使用，表示约10-50个氨基酸的氨基 酸聚合物形式(可以由至少10个且不超过50个氨基酸组成)，该形式可包含编码和未编码 的氨基酸、化学或生物化学改性或者衍生的氨基酸、L"或D-氨基酸、具有改性的肽主链的 肽、以及包含氨基酸类似物的肽。所述氨基酸可仅限于人体中天然产生的氨基酸。所述肽 化合物可以是以下的聚合物(a)天然产生的氨基酸残基；(b)非天然产生的氨基酸残基， 如N-取代的甘氨酸、氨基酸取代基等；或(c)天然产生的和非天然产生的氨基酸残基/取 代基。换言之，所述肽化合物可以是肽或拟肽。W0 91/19735中描述了拟肽化合物及其制 备方法，该文献的揭示内容通过参考全文结合于此。本发明的肽化合物可以包含23个氨 基酸、或18-28个氨基酸、或20-26个氨基酸，或者由它们组成。本发明的活性氨基酸序列 包含可能重叠的以下三个功能域，或者由这三个功能域组成，它们是整合素结合功能域序 列、糖胺聚糖结合功能域序列、和钙_结合功能域。“蛋白质”表示链长度足以形成更高级别的三级和/或四级结构的氨基酸序列。要 将这个概念与不具备这种结构的“肽”或其他小分子量药进行区别。蛋白质的分子量通常 约为15-20kD至约20kD。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，表示氨基酸残基的聚合物。 该术语应用于其中的一个或多个氨基酸残基是相应天然产生的氨基酸的人造化学模拟物 的氨基酸聚合物，还可以应用于天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。在生化语境中使用术语“底物”时，表示酶进行作用的分子。酶催化涉及底物的化 学反应。底物与酶的活性位置结合，形成酶_底物复合物。底物分解成产物，并从该活性位 置释放。在材料科学语境中使用术语“基材”时，该术语用于描述进行处理以形成材料的新 的膜或层如沉积的涂层，以及使核酸、肽、糖和脂肪酸等附着的基础材料或表面。“激酶”是一种催化磷酸酯基(如来自ATP或GTP)转化成目标分子如激酶底物，使 底物发生磷酸化作用的酶。“激酶底物”表示能部分或完全地被激酶磷酸化的分子。“磷酸酶”是一种催化从磷酸酶底物除去磷酸酯基从而对该底物进行部分或完全 的脱磷酸作用的分子。在本文中使用术语“处理”表示治疗处理和预防手段。待处理的对象包括已经发生紊乱以及要预防或防止紊乱的对象。一般来说，这个概念包括获得所需的药理学和/或 生理学效果，例如刺激血管生成。该效果可以是预防性的，即完全或部分地防止疾病或其症 状，以及/或者该效果可以是治疗性的，即部分或完全地治愈疾病和/或该疾病引起的负面 影响。在本文中使用该术语包括哺乳动物、尤其是人类的任何疾病处理，包括(a)防止预 先倾向于产生疾病但是尚未诊断出的对象产生疾病或病症(如防止软骨缺损)；(b)抑制疾 病，如阻止软骨缺损；或(c)缓解疾病(如加强软骨生长)。术语“对象”、“个体”、“病人”和“寄主”在本文中可以互换使用，表示任何脊椎动 物，尤其是任何哺乳动物，最具体包括人类对象、家畜、和哺乳类宠物。对象可以处于医生之 类健康护理专业人员的护理之下，但是不一定必须如此。作为处理的目的，“哺乳动物”表示任何分类成哺乳动物的动物，包括人类、牲畜和 家畜、动物园动物、运动动物或宠物，如狗、马、猫、母牛等。优选哺乳动物指人类。“失调”是指能得益于用肽进行处理的任何病症。这种概念包括慢性和急性失调或 疾病，这些失调或疾病包括预先使得哺乳动物容易产生所述失调的那些病理学病症。在本 文中待处理的失调的非限制性例子包括骨骼缺损或脆弱以及骨缺陷或骨折。“表面增强的拉曼光谱”或“表面增强的拉曼散射”经常缩写成SERS，这是一种表 面灵敏技术，能够通过吸附在粗糙金属表面上的分子使拉曼散射增强。该增强因子可以高 达1014-1015，使得该技术足够灵敏，能够检测单分子。“拉曼散射”或“拉曼效应”是光子的非弹性散射。当光从原子或分子散射时，大部 分光子发生弹性散射。散射光子的能量(频率)和波长与入射光子的相同。但是，有小部 分散射光是被激发散射的，散射光子的频率不同于入射光子的频率，一般小于入射光子的频率。优选实施方式说明本发明的一些实施方式包括微芯片，该微芯片具有微流化样品流动通道、活性纳 米结构化表面、光学窗口、和连接的用于多路光学检测的分子探针阵列。优点包括超小的样 品体积，优于常规分子诊断方法和装置的高检测速度、通量、灵敏度、可靠性和完成度，以及 2-3倍量级的较低的成本。该微芯片可应用于实验室和临床环境中的分子水平疾病诊断，具 有史无前例的灵敏度、准确性和成本可承受性。为用于对硅或塑料基材中的微通道进行表面增强的拉曼散射(SERS)检测的设备 提供了方法和装置。可以通过以下方式形成硅装置对具有适当掩模和不同保护涂层和层 的微结构分别进行蚀刻和机加工，在最终蚀刻之前可以除去所述掩模、涂层和层，以提供深 的微结构，通过进行化学和物理表面粗糙化，形成独特的纳米结构作为SERS基材。该装置 能容纳并行的流体物流，能够聚焦激光以照射SERS基材表面。对于用聚合物材料进行模 制，该硅装置可以重复两次，利用聚合物获得所需的结果。本发明验证了一种具有亚微升体积的整合微型流化室和用于SERS光谱的纳米结 构化表面。该微型光学室具有一个透明表面，该表面使得光能够传输到该室中并照射在 SERS基材表面上。这还使拉曼散射光能够传输离开该室并得以采集。与用于拉曼测量的常 规光学室或小试管相比，这种拉曼检测流化室的体积可以小于1微升。较短或较浅的微通 道使得芯片中的检测模块得以进一步小型化。通过分光照相机能检测SERS信号，但是要求 的体积可能比常规拉曼光谱所用的体积小1000倍以上。光学室的微型尺度使得能够将多个独立的光学室整合在一个芯片中，由此可以使用一次性容纳所有样品的单独一个装置实 现 2、3、8、16、32、48、96、192、384、768、甚至 1536 个样品的多路 SERS 光谱。因此，一些实施方式在芯片上同时进行SERS光谱检测并提供高灵敏度的生物分 子检测。可以通过外部电子设备和/或机械微型泵对微型室中的流化样品流动和反应温度 进行控制。由于微芯片和流化样品的较小体积，流速和加热/冷却速率可以比大型类似装 置高几个量级，从而能够进行许多特殊应用，例如芯片内PCR和快速流化交换。一些具体实施方式
包括整体制造的纳米结构化SERS基材，该基材也密封在微流 化室中，使得生物/化学样品的SERS光谱检测能够在微流化环境中进行。本文所述独特的 显微制造、纳米制造和封装使得能够在模拟的水性生物环境中进行SERS光谱检测。可以在微流化室中的SERS基材上固定多种生物或酶底物延伸物，如小肽和核苷， 也可以是专门针对多种生物标记物，如酶，例如与癌症、心血管疾病、糖尿病和神经疾病相 关的。可以将人类和动物的流化样品引入微流化室中，与连接的探针反应。可以通过SERS 光谱检测对探针的化学变化进行检测。按常规是将化学或生物样品滴在SERS基材上，并干燥用于拉曼光谱分析。但是， 实时生物变化可能只在水溶液中发生。本发明的具体实施方式
能够在模拟的生物流化环境 中对静态和动态的生化反应进行生物分子拉曼信号检测。纳米结构可以位于微流化通道的表面上，用以提供对光学信号的增强，或者用以 将酶底物延伸物固定从而捕获用于检测的目标分子或微粒。可以将底物延伸物化学连接在 芯片中微流化室的表面上，所述底物延伸物是例如抗体、适体、DNA或RNA寡核苷酸和较长 的延伸物，包括肽、多糖、聚合物、小分子等。还可以将酶底物延伸物连接在物理制造的纳米 结构上，从而在微流化室中形成纳米生物_混杂探针。如本文所述的具体实施方式
可以应用于诊断测试和分子诊断中。例如，分子诊断 (尤其是检测与癌症相关的生物标记物的分子诊断)测量生物标记物，所述生物标记物包 括小分子代谢物或代谢中间产物、核酸、碳水化合物、蛋白质、蛋白质片段、蛋白质复合物和 /或其衍生物或组合。在这些生物标记物的检测和量化中可以使用化学化验，例如采用光谱 检测系统的分析方法，可以提供关于生物标记物与测试分子之间的相互作用的信息，所述 测试分子是例如小分子、酶、碳水化合物、核酸探针、核酸或蛋白质适体、肽核酸、肽、或者多 克隆或单克隆抗体。在分子诊断的鉴定、表征和显影过程中，在开始时可以采用这些化验方 法，也可以采用这些化验方法作为分子诊断测试，用于化验生物样品，从而测量病人的健康 状态，或者提供可以支持医疗决策的信息。具体的实施方式还可以应用于分子治疗。例如，药靶的鉴定和表征可以包括对生 物样品中的这种药靶进行检测和量化。可以采用利用光谱检测系统的化学化验和分析方 法，检测和量化潜在的药靶，所述药靶包括蛋白质，如细胞表面蛋白、细胞外蛋白、肽激素、 跨膜蛋白、受体蛋白、信号蛋白、胞液蛋白或酶、核蛋白、DNA-结合蛋白、RNA分子包括信使 RNA或微RNA、和/或DNA。这些化验和方法还可以提供关于药靶与与药物的相互作用的信 息，所述药物是例如小分子、多克隆或单克隆抗体、治疗蛋白或治疗酶、反义核酸、小-干扰 RNA、核酸或蛋白质适体、肽核酸、或其他药物和潜药。在分子治疗的鉴定、表征和显影过程 中，在开始时可以采用这些化验方法，也可以将这些方法应用于鉴定接受药物或潜药处理 的个体病人响应性的测试中，从而提供可以支持医疗决策的有价值的信息。
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对于只能检测浓度的常规抗体亲合性结合化验基材而言，优选硅晶片。在一些实 施方式中也可以使用其他半导体晶片(如GaAs、InP、GaP、GaSb、InSb、InAs、CaF2、LaAl203、 LiGa02、Mg0、SrTi0Q、YSZ和ZnO)。用于晶片的合适半导体材料包括但并不限于元素周期表 上第 II-VI 族的元素(ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、MgS、MgSe、MgTe、 CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe 等)，和第 III-V 族的元素(GaN、GaP、 GaAs、GaSb、InN、InP、InAs、InSb等)和第IV族的元素(Ge、Si等)，以及它们的合金或混 合物。用于表面涂层的合适金属和金属氧化物包括但并不限于Au、Ag、Co、Ni、Fe203、Ti02 等。用于表面涂层的合适碳纳米颗粒包括例如碳纳米球、碳纳米洋葱、碳纳米管、和富勒烯。在具体的实施方式中，除了蛋白质浓度，还可以检测酶活性。例如就前列腺肿瘤而 言，尽管现在能检测前列腺-特异性抗原(PSA)浓度，但是这种化验不一定能鉴别该抗原是 否为活性的，可能提供误解的测量。本发明一些实施方式的一个方面包括不仅就浓度而且 就活性提供信息。而且，具体的实施方式还包括代替芯片扫描仪的检测系统。在一些实施方式中，用于液体样品显微光谱的系统一般可包括与微流化光学装置 (如芯片或集成电路(IC)部分)相连的检测设备(如仪器部分)。该检测设备可包括光 源，用于将光传送通过待表征的液体样品，该检测设备还包括摄谱仪和/或分析单元，用于 对受样品分子影响的光进行分析(如荧光、吸光率等)。可以使用半导体加工技术制造微流 化光学装置，可以对其进行封装，以保护其中的半导体并容纳用于液体样品的进口 /出口。参见图1A-1F，所示为根据本发明实施方式的基于硅的表面增强的拉曼散射 (SERS)衬底装置的制造过程实例。图1A显示在单晶晶片102的上表面和下表面上热沉积较薄的多晶硅层104-0和 104-1。例如，多晶硅层104-0和104-1的厚度可约为100-500纳米，例如约200-400纳米， 更具体约为300纳米。图1B显示通过激光钻孔或化学蚀刻形成通孔116，该通孔穿透晶片102和多晶硅 104-0/104-1。蚀刻剂可以是热的氢氧化钾，采用30瓦的二氧化碳激光器。在一种实施方 式中，通孔116的直径/宽度约为100微米。当然，在具体实施方式
中可以采用任何合适的 通孔宽度(例如约为80-120微米，或约为50-150微米)。例如，可以对这些通孔宽度进行 设计，产生过滤功能，例如不允许较大的分子流进微流化光学室中，以下将更详细地进行讨 论。图1C显示施用于一部分多晶硅104-0上的光刻胶106，能够对待蚀刻区域进行光 刻图案化。图1D显示对多晶层104-0进行等离子体蚀刻108，形成硅纳米结构110。等离子 体蚀刻108可包括多个步骤，从而在硅纳米结构110的表面上形成几何形状或其他合适的 “粗糙化”。例如，可以通过进行等离子体处理(包括HBr+02进行小于约10秒)，形成纳米四 棱锥阵列。用HBr进行约10-20秒的等离子体蚀刻能形成纳米柱阵列。然后可通过包括如 SF6的等离子体蚀刻，从这些纳米柱上除去氧化物部分。接下来，可以用HBr等离子体对表 面进行约1-2分钟的等离子体蚀刻。这种措施能产生高度约为50-200纳米、更具体约100 纳米的纳米四棱锥。在一些实施方式中可以形成任何合适类型的纳米结构。可以采用能够在底物改 性之后对一些固有或表观的频率产生增强的任何形状，例如通过以下详细讨论的酶底物适应。其他示例性纳米结构可包括具有增强性质的不同几何形状，如纳米环、纳米正方形、纳 米丝网、平行丝、纳米沟槽等，这些结构可以使用电子束、平版印刷或任何合适加工方法形 成。图1E显示薄膜114的金属沉积112。例如，沉积的金属114可包括金、银、钼、钯、 或铜等，薄膜114的厚度约为10-80纳米，例如约20-60纳米，更具体约为40纳米。图1F显示除去光刻胶106，使薄金属纳米颗粒114退火，从而形成层114的平化的 金属涂覆表面。合适的退火温度约为200-300°C，更优选为250°C。
具体实施方式
中的层114的表面可以较粗糙，或者可以包含其他几何特征，例如 具有尖锐的边缘/点，从而围绕这些边缘产生增强的电磁场。参见图2A-2F，所示为根据本发明实施方式在SERS芯片上印刷各种分子探针的流 程图。可以使用微型触针或注射器将不同类型的肽或核苷滴在金属化的纳米结构SERS衬 底上。形成的酶底物延伸物与SERS衬底表面共价结合。图2A显示位于单晶晶片102的各表面上的多晶硅104-0和104_1，以及金属纳米 颗粒114和通孔116。可以对探针204进行定位，以施加肽或核苷的液滴202-0。图2B显 示酶底物延伸物206-0，其由金属纳米颗粒114和肽/核苷液滴202-0之间的共价键形成。图2C显示携带有不同液滴202-1的探针204的重新定位，图2D显示对应的酶底 物延伸物206-1。可以对探针204进行多次的重新定位，从而形成多个与金属纳米颗粒114 结合的酶底物延伸物。图2E显示酶底物延伸物206-0、206-1、206-2和206-3。然后可以使探针204重新 定位，如图所示释放液滴202-4。图2F显示SERS衬底芯片210中完整的一组酶底物延伸 物，包括对应于液滴202-4的延伸物206-4。另外，可以改变围绕每个酶底物延伸物的电磁 场，金属114可以作为一些频率的电磁激发或光子激发的增强器。参见图3A和3B，所示为根据本发明实施方式完整的示例微流化分子诊断装置组 合件的组装过程实例。一般来说，组装过程中可包括三个独立的单元。可以用聚二甲基硅 氧烷(PDMS)部分306-0和液体样品进口 302和出口 304形成顶层。由于可以将光学设备 或仪器部分设置在与进口/出口通道(如顶侧)相对的芯片侧(如底侧)上，所以有相当 大的余地来设置进口和出口通道而不会干扰光学分析。中间单元可包括具有酶底物延伸物 的SERS衬底芯片210。底层可包括PDMS部分306-1和透明窗口 310，用于将微流化通道容 纳在其中。在具体的实施方式中，透明窗口 310 —般可以比较薄，使得因为窗口吸收造成的 光损失最小化(例如小于约10% )。典型的窗口厚度可以约为1-3毫米，而具体实施方式
的窗口厚度约为200-300微米。而且，在一些实施方式中，可以由对该光谱透明的任何合适 材料(如Si02、PDMS、环烯烃共聚物(C0C)聚合物、或任何紫外(UV)透明塑料等)形成透明窗口。图3B显示组装的发现工具装置实例。将图3A所示的三个独立单元组装成图3B 的组合件，包括在硅表面(如多晶硅层104-0、104-1)上的二氧化硅和PDMS表面(如306-0 和306-1)上的活性硅氧烷基团之间使用共价结合。该组装过程还可以包括形成微流化光 学室318，用于对经由进口 302输入并经由出口 304输出的样品流体进行分析。一般来说，一些实施方式可包括以下更详细讨论的仪器部分，以及集成电路(IC)部分210。透明窗口 310将IC部分210与仪器部分隔开。IC部分可包括半导体材料102， 其中具有通孔116，用于容纳如图所示的进口 302和出口 304。半导体材料102可包括任何 合适的半导体材料，如硅(Si)、锗、二氧化硅、砷化镓(GaAs)等。用于晶片的合适半导体材 料包括但并不限于元素周期表上第II-VI族的元素(ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、 HgSe、HgTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe 等)，和第 III-V 族的元素(GaN、GaP、GaAs、GaSb、InN、InP、InAs、InSb 等)，和第 IV 族的元素(Ge、Si 等)，以及它们的合金或混合物。在一些实施方式中，可以对光学室318中样品溶液的混合进行控制，从而在将溶 液泵入进口的同时观察到不同化学试剂和/或多种组分的实时反应。而且，可以将进口 302 和/或出口 304与任何合适种类的管道(如塑料管道)连接，通孔直径可约为100微米至 约1毫米。而且，进口和出口通道或端口的尺寸可以变化，从而通过不同的样品体积、分子 尺寸等提供过滤功能，这取决于具体应用。在一种实施方式中，通孔为液体样品提供路径从而流过微流化光学室318，因此可 以将该液体操作单元安装在硅芯片的与微型光学室定位侧不同的一侧之上。没有液体操作 单元(如储存器、连接器、管道或泵)来阻挡微型光学室时，光学系统能够对室318形成相 当大面积的照射。而且，在一些实施方式中，室318的长度可延伸至大约10微米至10厘米 的长度，例如约为500微米至2厘米，更具体约为1厘米，以容纳多个酶底物延伸物206。室 318的深度可约为10-200微米，从而提供微升或亚微升的样品体积。例如，室318可以容纳 约0. 10-2微升样品体积的流体。进口 302和/或出口 304可以连接多个通道，可以对路径进行规划，排列成阵列形 式，从而便于经由机器人装载(例如保持用于这种装载的标准距离)。还可以在组合件中使 用聚合物结合层，可包括任何合适的软塑料或硬塑料的层(如PDMS、环氧材料、粘合橡胶、 金属等)。还可以通过等离子体增强的化学气相沉积(PECVD)或电子束蒸发，对硅装置的表 面进行氧化。另外，可以用液体操作包封物包围该结构的左侧和右侧边缘，并且用密封材料 (如环氧材料、PDMS、橡胶、玻璃、石英等)沿着顶部进行覆盖。参见图4A，显示根据本发明实施方式的用于制造两通道装置的微型制造掩模的顶 视图。在该实施例中，可以用装置掩模、进口 /出口储存器404掩模、微流化光学室406掩 模、以及通孔掩模层限定硅晶片402。如图4B中掩模结构的特写顶视图实例所示，通孔掩模 层408可以与微流化光学室406的边缘对齐，并且保持在进口 /出口储存器404掩模层之 内。参见图5A和5B，所示为根据本发明实施方式在示例微流化SERS芯片中对蛋白酶 和核酸酶生物标记物进行检测的原理。SERS衬底表面114上的各种线型代表示例的肽/核 苷酶底物延伸物，如206-3和206-4。成对的三角形(如502和504代表生物流化样品中示 例的蛋白酶和/或核酸酶生物标记物。图5B显示生物标记物酶反应的分解程序，按照以下顺序510 (引入生物标记物酶 502和504)，512 (生物标记物酶502和504与酶底物延伸物206-3和206-4发生特异性结 合)，514 (酶底物延伸物的限制性裂解)，和516 (清洗反应残余物，留下改性的酶底物底物 延伸物 206-3'和 206-4')。参见图6A和6B，所示为根据本发明实施方式的另一种示例微流化SERS芯片中对激酶生物标记物进行检测的原理。SERS衬底表面114上的各种线型代表示例的酶底物延伸 物，如206-1和206-2。成对的三角形(如602和604)表示微流化样品中的激酶生物标记 物。注意到底物延伸物并不限于酶，还包括本文提到的各种其他分子，如抗体、适体、DNA或 RNA寡核苷酸，以及较长的延伸物，包括非酶肽、多糖、聚合物、小分子等，所有这些都可以作 用于引入的生物微流化样品中的分子以及/或者被引入的生物微流化样品中的分子改性。 所有这些底物延伸物都能够与芯片中微流化室的表面形成化学键合。类似地，602和604不 一定在所有本发明实施方式中都表示酶生物标记物。相反，引入的待分析的生物标记物可 以包括核酸(DNA和RNA)、其他非酶蛋白质、肽、糖/碳水化合物、代谢物和小化合物。图6B显示示例的生物标记物酶反应的分解程序，按照以下顺序610 (引入生物标 记物酶602和604)，612 (生物标记物酶602和604与酶底物延伸物206-1和206-2发生特 异性结合)，614 (酶底物延伸物的磷酸化作用606)，和616 (清洗反应残余物)。参见图7A，显示根据本发明实施方式的整合孔板和硅微流化装置结构的顶视图。 图7B显示图7A示例结构的截面图。硅装置704顶部为微流化网络层(如PDMS)706，以及 孔板702。因此，这样的多通道形式能够使孔穿透至用于微流化通道或路径层的结构的顶 部。在这种构造方式中，可以将微流化光学芯片与例如96、384、1536个微型孔板整合，所述 微型孔板符合标准微型孔板尺寸。然后可以将微流化光学芯片与微型孔板的组合件与标准 机器人液体操作系统相适应。参见图8，所示为根据本发明实施方式的用于微流化蛋白酶/核酸酶生物标记物 诊断装置的荧光检测系统的构造实例。可以通过蛋白水解/核酸水解反应除去位于各肽/ 核苷自由端的荧光酶底物延伸物，作为生物标记物诊断的光学信标。通过这种方式，酶底物延伸物可以为样品溶液中的酶提供标靶，由此按动态识别 连接蛋白酶，然后催化。因此，在具体的实施方式中，在酶底物延伸物(如206-3、206-4等) 上发生化学反应。相反，常规手段通常包括位于表面之上的DNA探针，测量溶液中的其他 DNA，但是事实上不能改变底物，而是提供结合或识别结果。但是在一些实施方式中发生初 始结合，随后发生能观察到的催化作用。其原因在于，溶液中用于分析的酶有效地改变了底 物(例如通过从底物除去磷酸酯基)。在图8中，光源802提供光束，使用荧光激发滤光器814对该光束进行过滤。然后 过滤后的光束被二向色镜反射，通过物镜820聚焦，通过光学透明窗口 310传输至微流化光 学室318。光源802能提供任何合适光形式的辐射/激发光束，例如白光、激光(如可见激 光、紫外(UV)激光、近红外(IR)激光等)，发光二极管(LED)，超级发光二极管，偏振光，卤 素灯产生的光，连续或脉冲氙灯，汞光源，氩光源，氘光源，钨光源和氘-钨-商素混合光源 灯。一般来说，微流化光学室318中装有待表征的液体或样品的分子，该液体经由进口 302 输入，经由出口 304输出。微流化光学室318中的光反射离开选择的酶底物延伸物之后，经由物镜820发生 吸收，传递至镜822，传输至荧光发射滤光器824，在检测器830中接收。检测器830还包括 电荷耦合装置(CCD)，用于对接收的光束中包含的各种波长进行分析。通过这种方式，可以 根据在检测器830中对接收的荧光和/或吸收光进行分析，确定室318中发现的样品的一 种或多种特征。而且，如以下更详细讨论的，本文提到的光学室的微型尺寸使得能够在一个 芯片中整合多个独立的光学室，因此能够实现对2、96、甚至384个样品的多路光谱。
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参见图9，所示为根据本发明实施方式的示例微流化蛋白酶/核酸酶和/或激酶/ 磷酸化酶生物标记物诊断装置的拉曼检测系统的构造实例。发生蛋白水解/核酸水解反应 的结果是，除去了位于各肽/核苷的自由端的拉曼酶底物延伸物。也可以通过磷酸化/去 磷酸反应对它们进行改性。因此，它们可以作为生物标记物诊断的光学信标。在这个具体实施方式
中，点检测方法能够在一个时刻对一种酶底物延伸物进行检 测。因此，可以平移微流化光学装置和/或相关仪器检测每种酶底物延伸物。而且，还可以 通过平移或步进仪器部分操作其他微流化光学装置(如图4A所示排列)。此处所述的仪器 部分包括激光器902，该激光器能提供激光束，反射离开镜906。分束器908从镜906接收 反射的激光束，经由透镜904为微流化光学室318提供分裂束。反射光经由透镜904返回， 通过分束器908、镜912和910，然后提供至摄谱仪914用于分析。在这个实施例中，摄谱仪914提供显示没有反应的光谱或波长范围，而不同的光 谱表明在特定的酶底物延伸物上发生了反应。确定是否发生反应，或者确定液体样品的另 一种特征，包括出现新的峰、现有的峰消失、现有的峰迁移、多个峰合并、峰的分裂、或者摄 谱仪能够测量的任何变化。通过这种方式，可以使用酶底物延伸物和周围区域的光学和/ 或电磁学性质检测化学变化。因此，在一些实施方式中可能不需要对酶底物进行荧光标记。 在这些实施方式中，对具有观察到的复杂信息的化学、电磁学、声学或任何合适性质进行检 测并加以利用。能观察到的变化可能比较微弱，因此，可以增加合适的纳米结构(如层114表面上 的纳米四棱锥)的组合来增强酶底物延伸物(如206-3、206-4等)附近的局部电磁场，从 而提高检测。另外，在具体的实施方式中，虽然该分析不一定采用标记步骤，但是可以实时 进行该步骤。其原因在于可以不对底物进行纯化，而且发生任何荧光反应之前不需要等待 时间。在一个实施例中，肿瘤可能在血液中转移，与正常细胞相比对激酶活性曲线产生 影响。测量激酶活性能了解癌症的具体种类或阶段，因此例如可以用适当的化疗和/或免 疫疗法进行处理。发生癌症时，一些蛋白酶含量可能上调。它们也可能表现出变化的酶活性 曲线，可使用本发明的具体实施方式
进行鉴别。可以将活体切片置于溶液中，使用温和的清 洁剂使细胞溶解，为溶胞产物的分析提供微升范围的体积。溶胞产物可能包含许多酶(如 蛋白酶、核酸酶、激酶、磷酸酶等)。为了观察不同的酶，将对应的不同的酶底物延伸物置于 微阵列上(参见例如图4A的排列)。可以将截然不同的酶底物延伸物设置在微阵列上，对 多种酶反应同时进行测量。而且，本发明的具体实施方式
除了酶反应以外还能测量结合反 应。在这些实施方式中，可以例如使用表面等离子体共振(SPR)检测蛋白质蛋白质结合和 /或相互作用。本发明的具体实施方式
还可利用抗体阵列，因此不同的抗体可以具有不同的光谱 特征(例如对于分裂之类不同情况、不同化学反应、结合和/或识别情况)。具体的实施方 式可以分析能够利用的任何血浆或流体(如唾液、尿、脊髓液等)，而不需要进行大量的处 理或样品制备工作。但是，与相应的未经制备的样品相比，经过制备的样品可能因为除去了 干扰性的流体成分而使测量值增大。摄谱仪914支持比较大的测量范围，使得能够从干扰 的背景噪声中分离出可测量的信号。参见图10，所示为根据本发明实施方式用于微流化蛋白酶/核酸酶生物标记物诊断装置的高通量拉曼检测系统的构造实例。在光路中可以使用快速扫描镜1006来将类似 点的激光激发转化成类似线的激光激发，由此可以通过使用二维光谱1014同时激发和检 测SERS衬底表面上的多个酶底物延伸物，从而在一个时刻记录这些底物延伸物的SERS光
■；並如以上讨论的，具体的实施方式还可以包括扫描平台，从而一个接一个地扫描不 同的酶底物延伸物。包括扫描镜1006，以及用于仪器部分的一个或多个部件的移动阶梯； 它们各自都是步进马达驱动的，用于获得高精确度。另外，一些实施方式还包括自动聚焦和 /或其他图案识别装置，用于相对于进行分析的酶底物延伸物正确定位光束。在一些实施方式中，可以使用数字式光操作(“DLP”)装置通过计算机控制的反馈 精细调节光的入射角。例如，在图10所示构造实例中，可以使用这种DLP代替扫描镜1006。除了 SERS以外，可以采用其他光谱模块和/或扫描类型，例如机械的、电磁的和/ 或光学的等。例如，可以通过不同的化学反应改变分子振动，可以使用不同的电磁和声学频 率以及IR来测量旋转或滚动，获得待测量分子的内部频率(例如从非常低的到非常高的， 如微波频率)。参见图11，所示为根据本发明实施方式的激酶生物标记物检测中的对肽探针进行 拉曼信号增强的例子。由于一些实施方式中的SERS衬底包含多晶硅和金属，因此具有示例 性底物延伸物的衬底是导电性的。对于磷酸化作用检测而言，可以在SERS衬底(如金属部 分114)上施加正向的DC电压，向相关的反应缓冲剂施加负向的DC电压。在1102中，带正 电荷的肽延伸物受到排斥并被拉直，而带负电荷的激酶变得更靠近肽。在1104中，激酶和 肽因为接近而结合。在1106中，磷酸化反应之后，肽携带带负电荷的磷酸酯基，由此能被吸 引至SERS衬底表面，而激酶丧失负电荷，被排斥推开。磷酸化反应之后肽的比较大的构象 变化可能在进行分析的SERS光谱中引发更显著的改变。在检测或仪器模块中，可以对所施加光的吸光率和/或荧光进行分析。荧光的波 长通常大于激发光的波长。具体的实施方式还可以支持光子或多光子激发，其激发波长大 于发射波长，具体的实施方式还支持落射荧光应用，其利用独立的滤光器。一些实施方式还包括测量散射光(如X射线小角度散射光谱)。测量还可以使 用圆二向色(⑶，dichrotomomy)应用中的偏振光进行，包括测量样品分子角运动的响应度 数。对于傅立叶变换红外(FTIR)应用而言，还可以测量荧光寿命，以及拉曼散射和发光。在特定的实施方式中还可以包括Sra和核磁共振(NMR)谱。对于这些应用，照明 窗口可以接收光抽运的超偏振光，这种光抽运以及光学实现通常可以紧接着发生。NMR通常 可利用进行测量的均勻场，因为这种方式通常利用金属线圈，磁场可以反向，光抽运能通过 室318，磁场是围绕室318的。在这种方式中，微流化光学室可以是光活化的。还可以结合其他电磁源来操纵微流化光学室中的材料样品。例如，具体的实施方 式允许使用热学、电磁学、光学、介电、非均相等方式操纵样品的物理性质。本发明一个具体实施方式
的另一方面涉及硅材料102的比较强的导热性质，由此 能够通过连接热装置(加热和/或冷却)控制室318的温度。例如，可以使用金属块或金 属结不仅在室温而且在低至约0°C到高达约300°C的温度下对样品材料进行测量，或者根 据样品材料本身的限度确定。因此，如果蛋白质是活性的，为了防止在较高温度变性，可以 在约37°C进行样品测量。在另一种实施方式中，热稳定酶(如Taq聚合酶，以及从嗜热微生物分离或产生的其他热稳定酶)允许进行较高温度(如高达约99°C)的测量。如果没有连 接比较大体相的加热/冷却元件，可能不能使用标准小试管进行这种测量。在具体的实施方式中，这种温度控制以及相关的感应单元可以整合在微流化光学 装置中。例如，这种整合的温度控制和感应单元可以是Peltier连接加热器或金属线电阻 加热器。这种方式能够在不同的温度对样品进行热循环分析，例如较低的温度以防止蛋白 质发生加热变性，较高的温度用于通过聚合酶链反应(PCR)进行实时基因扩增。通过这种方式，可以在室318中进行对温度的化学、生物和/或物理反应的测量。 可以分离任何依赖于温度的特征，例如测量化学试剂熔点用于评估化学纯度。另外，一些应 用中还包括使用照相机。PCR可以包括循环温度(例如大约55-95°C )，观察反应中的荧光 (例如大约10毫秒/框架至大约1秒/框架)从而观察实时PCR信号。另外，可以利用本 发明具体实施方式
的微流化光学室测量任何数量的不同酶的浓度和活性，这些酶是例如但 并不限于核酸酶、蛋白酶、激酶、聚合酶、糖基化酶、拓扑异构酶、连接酶和磷酸酶。参见图12，所示为根据本发明实施方式的微流化光学装置结构的示例性制造方法 流程图。该过程从1202开始，将多晶硅层沉积在单晶硅晶片的各侧之上(1204)。然后形成 通孔，例如通过化学蚀刻或激光钻孔形成(1206)。然后使用光刻法对晶片前侧上随后要蚀 刻的区域进行图案化(1208)。然后在经过图案化的区域中蚀刻硅纳米结构(例如使用等离 子体)(1210)。例如，这种纳米结构能提供任何合适形状的表面粗糙特征，例如纳米四棱锥 阵列。然后在经过蚀刻的区域上沉积金属(如金、银等)(1212)。除去剩余的光刻胶，对薄 的金属纳米颗粒进行退火(1214)，完成这个过程(1216)。参见图13，所示为根据本发明实施方式的用于发现流体样品特征的装置的示例 性制造方法流程图。该过程从1302开始，将至少一个酶底物延伸物放置在金属化的纳米 结构表面上(1304)。包括酶底物延伸物的结构可以翻转，使得延伸物位于微流化光学室 中(1306)。然后将具有进口和出口的顶层与结构连接(1308)。然后在该结构上连接具 有透明窗口的底层，形成具有用于微流化分析的光学室的发现装置(1310)，完成这个过程 (1312)。参见图14，所示为根据本发明实施方式的用于流体样品分析的发现装置的示例 性使用方法流程图。该过程从1402开始，在进行分析的微流化光学室中接受流体样品 (1404)。然后通过微流化光学室的透明窗口在酶底物延伸物上提供激发光(如从激光器提 供)(1406)。然后接收从酶底物延伸物返回的光(1408)。例如，可利用透镜、镜和分束器采 集这些返回的光。然后分析返回的光(例如使用摄谱仪或光谱仪)，确定是否发生反应从而 使酶底物延伸物改性(1410)，完成这个过程(1412)。参见图15，所示为根据本发明实施方式的高速系统的示例性使用方法流程图。使 用马达驱动的转动的检流镜(1506)，在SERS表面上对多种配合物进行快速扫描。各配合物 通过不同的生物分子结合(1518)，这些生物分子作为酶或者感兴趣的其他分子的标靶。例 如来自激光器(1502)的激发光接触镜(1510)，重新定向至转动的检流镜(1506)。光从此 处传递至二向色镜(1508)，通过并到达物镜(1510)。拉曼滤光器(宽带)(1512)位于光谱 仪(1514)之前。各生物分子(1518)被固定在芯片表面(1516)上。如图15所示，具体实施方式
包括固定在表面上的生物分子。例如，这些生物分子 可以包括核酸(DNA和RNA)、蛋白质、肽、糖/碳水化合物、代谢物和小化合物。另外，可以对固定在表面上的生物分子和化学分子进行图案化，形成生化化验的微型阵列。还可以在 微流化光学室的表面上沉积多种生化库，用于进行组合检测。官能基团可包括反应活性基 团。官能基团还可包括具有两个能够能与两个或更多个不同官能标靶(如肽、蛋白质、大分 子、表面涂层/表面等)形成连接的反应活性基团的双官能交联剂。在一些实施方式中，该 双官能交联剂是具有两个不同的反应活性基团的异相双官能交联剂。为了使生物分子与表 面发生共价结合，合适的反应活性基团包括例如硫醇基(-SH)、羧酸(COOH)、羧基(-C00H)、 羰基、胺(NH2)、羟基(-0H)、醛基(-CH0)、醇(ROH)、酮(R2CO)、活性氢、酯、巯基(SH)、磷酸酯 基(-PO3)、或光致反应活性部分。胺反应活性基团可包括例如异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基 叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、乙醛和乙二醛、环氧化物和环氧乙烷、碳酸酯、芳基化试剂、酰亚 胺酯、碳二亚胺、和酐。硫醇_反应活性基团包括例如卤代乙酰基和烷基卤化物衍生物、马 来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基衍生物、酰基化试剂、和硫醇_ 二硫化物交换试剂。羧酸酯反应 活性基团包括例如重氮基烷烃和重氮基乙酰基化合物，例如羰基二咪唑和碳二亚胺。羟基 反应活性基团包括例如环氧化物和环氧乙烷，羰基二咪唑，用高碘酸盐、N, N' - 二琥珀酰 亚氨基碳酸酯或N-羟基琥珀酰亚氨基氯甲酸酯氧化，酶氧化作用，烷基卤，和异氰酸酯。醛 和酮反应活性基团包括例如用于席夫碱形成或还原胺化的胼衍生物。活性氢反应活性基团 包括例如用于曼尼希缩合和碘化反应的重氮衍生物。光致反应活性基团包括例如芳基叠氮 化物和卤代的芳基叠氮化物、苯甲酮、重氮化合物、和双吖丙啶衍生物。在一种实施方式中，异相双官能交联剂包含两个不同的反应活性基团，这两个基 团形成能够与底物肽相互作用的杂环。例如，异相双官能交联剂如半胱氨酸可包含胺反应 活性基团和硫醇_反应活性基团，这两个基团与衍生的肽上的醛相互作用。用于异相双官 能交联剂的反应活性基团的其他组合包括例如胺和巯基反应活性基团，羰基和巯基反应活 性基团，胺和光致反应活性基团，巯基和光致反应活性基团，羰基和光致反应活性基团，羧 酸酯和光致反应活性基团，以及精氨酸和光致反应活性基团。同样在具体的实施方式中，微流化光学芯片能自动传输，并与相关的光谱成像系 统对齐。例如，可以通过计算机使用优化算法控制这种传输和/或对齐。同样，微流化芯片 上可以包括特定的标记物，可以用于自动图案识别。一些实施方式还可以提供整合在通道中的电极，从而在微流化光学室上施加电压 电势，形成毛细管电泳系统。例如，然后可以实现利用电泳和等电聚焦的DNA和蛋白质分 离，实时监控生物分子的光谱。同样在一些实施方式中，微流化光学室中的内含物可以是气相材料，而不是固体。 可以实时地连续测量或监控气体的光学性质。例如，可以监控空气中的微粒浓度。在一些实施方式中，将抗体固定在芯片表面上。可以测量样品中相应抗原的存在 和/或浓度。在涉及癌症诊断的实施方式中，将对一些癌症生物标记物具有特异性的抗体 固定在表面上。在受体酪氨酸激酶中，EGF受体基因家族包括EGFR和erb B2，它们在人类 癌症中得以最频繁地复制。例如，已经确定对人类胃癌EGFR和erb B2扩增分别约为3_5% 和 10-20 % (Albino 等人，(1995)，Eur. J. Surg. Oncol. ,21 :56_60 ；Sato 等人，(1997)， Pathol. Int.，47，179-182 ；Hung 和 Lao，(1999)，Semin. Oncol. ,26 :51_59)。已经报告了对 于肠型胃癌促胃酸激素和erb B2的共同扩增(Vidgren等人，(1999)，基因染色体癌(Genes Chromosomes Cancer)，24，24-29)。因此，伴随升高的促胃酸激素水平的EGFR和erb B2蛋白质水平升高指示产生肠癌。本发明的灵敏度便于在这些蛋白质水平提高临界值的检测。 这种提高的灵敏度是很重要的，因为大多数胃癌直到癌症发展到更严重的阶段才能得到诊 断。而且，本发明方法中对蛋白质水平的测量只要求很小的样品体积，因此适合于测试活体 检查样品。适用于本发明的抗体量级可以从AbCam、BioMol、Sigma等供应商处购得。在具体的实施方式中，还可以检测酶活性和浓度。将酶的底物固定在表面的纳米 结构商，测试样品包含在有益于发生催化反应的条件下能与底物结合/培养底物的酶。该 底物可以是蛋白酶、激酶、磷酸酶、核酸酶、转甲基酶、转乙酰酶、转脂酰基酶、转氨酶、转糖 基酶等的底物。底物长度范围为至少约4个残基至最高约10、30、50、200或500个残基。因此，用 于蛋白酶的底物约为4个氨基酸，可以最高约为50、200或500个氨基酸。这种底物可以具 有一个或多个能被该酶识别的识别序列。这种底物可以另外包含非自然产生的氨基酸、核 苷和/或糖残基。另外，这种底物可以通过酶或化学过程改性，增加或除去官能团。蛋白酶活性的检测在具体的实施方式中，使用本发明检测蛋白酶活性。不仅正常细胞功能的维护需 要蛋白酶，而且对于各种人类疾病的发病机理而言，蛋白酶也是关键。寄生虫感染、真菌感 染、病毒感染、癌症、炎症、呼吸疾病、心血管疾病和神经变性疾病的发展需要蛋白水解活 性。作为疾病产生或产生可能性的诊断/预兆标志，对蛋白酶浓度和/或活性进行检测是 很有价值的。而且，对抑制蛋白酶活性进行检测也能用于为许多病理学处理进行蛋白酶抑 制剂筛选。根据本发明能被检测和/或量化的“蛋白酶”是通常在蛋白质/肽中的一对氨基 酸之间水解肽键，产生较短的蛋白质/肽的酶。这种活性也表示为蛋白水解。通过SERS 获得的光谱、电磁共振测量或声学测量中的变化可以检测蛋白质/肽底物的蛋白水解。通 常参考酶的催化中心中的亲核试剂来定义蛋白酶。最常见的亲核试剂来自于丝氨酸、天 冬氨酸和半胱氨酸的侧链。因此，将蛋白酶区分为蛋白酶家族，如丝氨酸蛋白酶(Paetzel 等人(1997)，Trends Biochem. Sci. 22 :28_31)，天冬氨酰蛋白酶(Spinelli 等人(1991)， Biochemie 73 1391-1396)，和半胱氨酸蛋白酶(Altschuh 等人(1994)，Prot. Eng. 7 769-75,1994)。金属蛋白酶通常在催化中心包含锌催化金属离子(Klimpel等人(1994)， Mol. Microbiol. 13 :1093_1100)。“蛋白酶识别位置”是肽或蛋白质中包含一对能被特定蛋白酶水解的氨基酸的氨 基酸序列。蛋白酶识别位置中的这种特定的氨基酸序列通常取决于蛋白酶的催化机理，由 蛋白酶活性位置的官能团的性质限定。因此，蛋白酶如胰岛素使羰基官能受赖氨酸或精氨 酸残基支配的肽键水解，而不考虑改肽/蛋白质的长度或氨基酸序列。其他蛋白酶具有更 高的特异性，例如Factor Xa识别异亮-谷-甘-精(IIe-Glu-Gly-Arg)序列，使得精氨酸 的C-端侧上的肽键水解。各种优选的蛋白酶识别位置包括但并不限于以下家族的蛋白酶的蛋白酶识别位 置丝氨酸蛋白酶家族、金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、和/或天冬氨酸蛋白酶家族、和/或 谷氨酸蛋白酶家族。蛋白酶识别位置是本领域普通技术人员众所周知的。已经为事实上所有已知的蛋 白酶确定了识别位置。因此，例如Earnshaw等人(1999) Annu. Rev. Biochem. 68 :383_424中描述了半胱天冬氨酸酶的识别位置(肽底物)，该文献通过参考结合于此。在一些实施方式中，将激酶或磷酸酶的底物与装置的纳米结构表面连接。这种连 接是通过触针、注射器或共价键实现的。可以将不同的激酶或磷酸酶底物定位于表面上的 特定位置，从而提供一个阵列，用于检测一种或多种激酶和/或磷酸酶以及/或者用于量化 一种或多种激酶和/或磷酸酶的活性。将会了解，虽然本发明描述的设备、方法和组合物是 用于检测底物的磷酸化作用，但是，这些设备、方法和组合物也可用于检测底物的脱磷酸作 用。激酶/磷酸酶活性检测磷酸化作用是一种常见的蛋白质转译后改性作用，对蛋白质结构和功能以及在细 胞生理学所有方面都起到关键作用。蛋白质激酶包含保持良好的适体，组成人类基因组中 最大的蛋白质家族。致癌作用和一些其他病理状况中包括蛋白质激酶的突变。其他生物分 子的磷酸化作用也在细胞生理学和病理学中起到关键作用。脂类激酶如磷酸肌醇_3激酶 家族成员是对生长因子、激素和神经传递素的细胞响应的关键调节剂，参与癌症产生之中。 核苷和核苷激酶调节磷酸供体和核酸前体的细胞内水平，参与对外伤和局部缺血的细胞响 应之中。糖激酶调节糖代谢、能量产生和转录活化速率，参与细胞转化和凋亡的过程之中。 因此对激酶活性进行检测和/或测量能够检测细胞/组织内环境稳定、生理学、诊断疾病状 况等的变化。可以被激酶磷酸化的任何分子以及/或者可以被磷酸酶脱磷酸化的任何分子都 可以作为本文所述设备、方法和组合物的激酶/磷酸酶底物。这些分子包括蛋白质、肽、糖 (如己糖、葡萄糖、果糖等)、核酸、乙酸酯、丁酸酯、脂类、神经酰胺等。表1提供了已知激酶 及其酶委员会号(EC号)的示例性列表，它们可以通过采用本发明的方法进行检测。激酶 的名称通常鉴别出该酶起作用的底物。众所周知通过磷酸化作用改性的大多数底物都能通 过磷酸酶被脱磷酸化。因此可以通过首先对底物进行磷酸化而使其改性，从而将其上连接 有激酶底物的表面用于磷酸酶化验中。表1.说明性激酶和相应的酶委员会(EC)号
权利要求
一种设计用于分析样品的设备，所述设备包括设计用于经由进口接收样品并经由出口排出样品的室，其中所述进口和出口位于该室的第一侧；多个与该室第一侧上的表面连接的酶底物延伸物，该表面具有纳米颗粒结构；位于该室第二侧上的照射体，该第二侧与第一侧相对，对该照射体进行定位，向多个酶底物延伸物中选择的一个提供激发束；和设计用于从选择的酶底物延伸物接受反射束并由其确定样品是否使选择的酶底物衍生物发生改性的分析模块。
2.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述设备还包括步进控制马达，该马达设计 用于相对于选择的酶底物延伸物对照射体和分析模块进行定位。
3.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述分析模块包括镜和光谱仪。
4.如权利要求3所述的设备，其特征在于，所述光谱仪的波形峰指示样品对选择的酶 底物延伸物产生的改性作用。
5.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述纳米颗粒结构包括位于纳米四棱锥阵 列上的金属。
6.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述激发束包括激光。
7.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述分析模块包括数字式光处理器(DLP)。
8.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述多个酶底物延伸物中的至少一个包括多肽。
9.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述多个酶底物延伸物中的至少一个包括核酸。
10.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述多个酶底物延伸物中的至少一个包括多糖。
11.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述改性作用包括选择的酶底物延伸物和 来自样品的酶之间的磷酸化作用。
12.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述改性作用包括选择的酶底物延伸物和 来自样品的酶之间的脱磷酸作用。
13.如权利要求1所述的设备，其特征在于，所述改性作用包括选择的酶底物延伸物和 来自样品的酶之间的裂解作用。
14.一种制造微流化光学装置的方法，所述方法包括 在硅晶片的各侧上沉积多晶硅层；形成透过该硅晶片的通孔； 对该硅晶片的前侧进行图案化； 在通过前侧图案化形成的区域中蚀刻硅纳米结构； 在由蚀刻的硅纳米结构形成的区域中沉积金属； 除去剩余的光刻胶并对沉积的金属进行退火；和利用操作单元连接与硅晶片分开的芯片以及与微流化光学装置中的室相连的透明窗
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述通孔的形成包括利用化学蚀刻。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述通孔的形成包括利用激光钻孔。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述芯片的连接包括将进口与出口和通 孔形成相连。
18.—种表征液体样品的方法，所述方法包括经由进口接收液体样品，并经由出口排出样品，其中所述进口和出口位于该室的第一 侧上；向多个酶底物延伸物中选择的一个提供激发束，该酶底物延伸物与该室第一侧上的表 面相连，该表面具有纳米结构；在分析模块中从选择的酶底物延伸物接受反射束；和从接受的反射束确定样品是否对选择的酶底物延伸物产生改性作用。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对选择的酶底物延伸物 附近的电压进行调节。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法还包括相对于选择的酶底物延 伸物对分析模块进行定位。
21.一种使用表面增强的拉曼光谱(SERS)系统确定目标生物分子的活性的方法，所述 方法包括将流体样品引入微流化光学室中，其中所述光学室包括拉曼活性表面，该表面上具有 多个底物延伸物；使流体样品的生物分子与所述多个底物之间发生特异性的相互作用；将激光引导至流体样品，其中激光与流体样品的相互作用产生对于生物分子和底物之 间的相互作用具有特异性的SERS信号；和通过与对照样品的拉曼散射光谱进行比较，检测生物分子的拉曼散射光谱的变化，检 测生物分子的活性。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述目标生物分子是蛋白质。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述目标生物分子是酶。
24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述目标生物分子是激酶。
25.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述目标生物分子是抗体。
26.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述目标生物分子是用于酶反应的底物。
27.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述目标生物分子的DNA结合蛋白质，该 底物是核酸。
28.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述目标生物分子与所述多个底物之间 的相互作用是蛋白质-配体结合相互作用。
29.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述目标生物分子与所述多个底物之间 的相互作用是蛋白质_蛋白质结合相互作用。
全文摘要
本发明涉及包括具有用于多路光谱学的增强拉曼表面的微流化光学室的微芯片领域。本发明的实施方式使得能够采用与光谱学中使用的常规小试管或装置相比超小的样品体积，以及高检测速度和通量。具体的实施方式涉及科学和医学研究，癌症、心血管疾病、糖尿病等疾病的诊断，尤其涉及具有相关科学和医学应用的生物标记物的检测和蛋白质活性的测定。
文档编号G01J3/44GK101978248SQ200880124597
公开日2011年2月16日 申请日期2008年10月31日 优先权日2008年1月7日
发明者K·蒋, L·蒋, P·沈, 陈仲中 申请人:动态通量生命科学仪器有限公司