专利名称：一种海洋溢油生物毒性快速检测方法
技术领域：
本发明涉及了 一种海洋溢油生物毒性快速检测方法。
背景技术：
随着工业化进程的加快，人们对石油的依赖越爱越大，使港口和沿海油轮密度增大，使得原已十分繁忙的通航环境更加复杂，导致船舶溢油污染的风险增大。近几年的溢油事件造成了大面积的海洋污染，给海域的生态环境带来巨大的损失，已经引起了人们的重视。目甜对于油品毒性的检测很大程度上依靠化学手段和动物实验，但是这种方法价格昂贵、需要很多动物，而且费时。因而近年来更倾向于一种快速、简便的方法，发光细菌的毒性检验方法就是符合这些要求的生物检测方法之一。目前我国己经制定了发光细菌的水质检测标准(GB/T15441-1995)，国内外的一些学者也通过发光细菌对一些油品的生物毒性进行了检测，但是由于实验采用的发光细菌是从海洋中提取来的，而在以往的检测过程中都是利用纯水作为配制水融合组分的溶剂，这样就改变了发光细菌的盐度，给结果来了一定的影响。
发明内容
本发明针对上述问题，提供了一种海洋溢油生物毒性快速检测方法，它通过人工海水作为水融合组分制备的溶剂，并采用半数效应载荷率EL5o作为油类在水中生物毒性的判定标准，使难溶的油类的生物毒性判定更加科学和准确，从而实现油品生物毒性的分级。
本发明的技术方案是 一种海洋溢油生物毒性快速检测方法，具体步骤如下-
一、 发光细菌的培养
菌种采用明亮发光杆菌T3变种(P/^o^"m'ww/7/m;^we,)，制备发光菌新鲜菌悬液n)斜面菌种培养在新鲜斜面上接出第一代斜面，25'C土0.5。C培养24h后立即转接第二代斜面，25。C土0.5。C培养24h后再转接第三代斜面，25'C土0.5。C培养24h后备用。
(2) 摇瓶菌液培养取第三代斜面菌种近一环，接种于装有30ml细菌培养液的100ml三角烧瓶中，25°C±0. 5°C, 160r/min下培养24h备用。
(3) 将培养后的发光细菌菌悬液稀释至每毫升108个~109个细胞，初始发光度不低于800mV，备用。
斜面和菌液的营养基为
胰蛋白胨0.5gNaCl 3gNa2HP04 0.5g KH2P04 0.5g
酵母0.5g &油0.3g蒸馏水100ml固体培养基加琼脂1.69g
二、 水融合组分的制备
在毒性试验中实际评定的是油类在水中溶解的成分和在水相中稳定存在的小油珠部分，既水融合组分WAF。我们将配置好的人工海水作为WAF中的水溶液和稀释水溶液。人工海水
的配方为
NaCl 20gMgS04 3.6gMgCl 7.2 g
无水CaCl2 0.7g蒸馏水 1000ml
油类在水中的载荷率可以直接根据单位体积溶液添加的材料的重量(w/v)为基础进行添
加。设置10g/L、 8 g/L、 6 g/L、 4 g/L、 2 g/L、 1 g/L、 0.5 g/L等7个载荷率梯度。
如果试验材料比水密度小，应采用从容器底部搅拌试验材料的搅拌器，而对于那些密度比水大的试验材料，则应采用从容器顶部搅拌试验溶液的搅拌器，搅拌器的搅拌速度应该适当、匀速， 一般液面漩涡的深度为WAF溶液制备容器中试验液高度的1(W-35%。对于同一种油溶液WAF的制备，搅拌速度应相同。搅拌时速度不要太快，速度在1200-1500rpm/min为宜，防止乳化现象的产生。
在制备WAF溶液时，为了使油与水充分融合，需要一定的搅拌时间，随搅拌时间的延长，.水中油的含量增加，但增加量逐渐平缓。 一般需要搅拌24h，搅拌后，为使混合液中非分散的油成分与已分散和溶解组分分离，应静置4h。
在为一种油制备不同载荷率的WAF时，必须用一个载荷率制备一种WAF，不能仅制备--种WAF，经过稀释后制成试验用WAF系列，因为试验材料在较低载荷率时，各种成分的溶解度不同。
三、 发光细菌相对发光度的测定
测定时的室温要控制在2o 25'c，同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过士rc。取
若干试管，给每支作为对照管的试管加1.98ral的人工海水，给每支作为样品管的试管加1. 98ml的WAF溶液。向每管中加入步骤一制备的备用的发光细菌菌液0. 02ml，放入发光光度计中检测。
i-s甜ttf弁w、 _样品管发光度(w^)相对放光度(%) I照管发光度(附巧
四、 半数效应载荷率EL5o的确定
(1) 绘制试验材料载荷率(mg/L)与其相对发光度(％)的相关曲线或相关方程。
(2) 在相关曲线坐标图上，相对发光度50。/。处画一水平线，与相关曲线有一交点，该点的载荷率即是半数效果载荷EL5o值。如建立了相关方程，也可代入该方程求出样品的仏50值。(3)根据表2的化5。值鉴别不同油品的生物毒性。
表2.难溶物质急性生物毒性分级标准毒性等级EU。载荷率/ (tng' L—')毒性级别
> 10000无毒
I10000-5000微毒
II5000-1000低毒
III1000-100中毒
IV100-10重度
V10-1咼毒
VI< 1剧毒
本发明的有益效果是通过人工海水配置水融合组分，可以在检测过程中更加满足发光细菌的生活条件，减少细菌由于反应条件的影响而给结果带来的误差，使检测结果更加科学可靠。
图1为实施例相对发光度与载荷率的关系曲线及相关方程。
具体实施例方式
一、 发光细菌的培养
菌种采用明亮发光杆菌T3变种(P/zotoZw"erz'wn;^ow/ orewM)，制备发光菌新鲜菌悬液、1)斜面菌种培养在新鲜斜面h接出第一代斜面，25'C土0.5'C培养24h后立即转接第二代斜面，25°C±0. 5'C培养24h后再转接第三代斜面，25°C±0. 5。C培养24h后备用。
(2) 摇瓶菌液培养取第三代斜面菌种近一环，接种于装有30ml细菌培养液的100ml三角烧瓶屮，25°C±0. 5°C， 160r/min下培养24h备用。
(3) 将培养后的发光细菌菌悬液稀释至每毫升108个~109个细胞，初始发光度不低于800mV，备用。
斜面和菌液的营养基为
胰蛋白胨0.5gNaCl 3gNa2HP04 0.5g KH2P04 0.5g
酵母0.5g 甘油0.3g蒸馏水100ml固体培养基加琼脂1.69g
二、 水融合组分的制备
在毒性试验中实际评定的是油类在水中溶解的成分和在水相中稳定存在的小油珠部分，既水融合组分WAF。将配置好的人工海水作为WAF中的水溶液和稀释水溶液。人工海水的配方为-.NaCl 20g MgS04 3.6g MgCl 7.2 g
无7jC CaCl2 0.7g 蒸馏水 1000ml
将润滑油设置为10g/L、 8 g,/U 6 g/U 4 g/L、 2 g/L、 1 g/L、 0.5 g/L等7个载荷率梯度。
丙为润滑油密度比水小，所以采用从容器底部搅拌试验材料的搅拌器，搅拌器的搅拌速 度应该适当、匀速，液面漩涡的深度为WAF溶液制备容器中试验液高度的10y。-35y。。匀速搅拌， 速度不要太快，转速为1200-1500卬m/min，防止乳化现象的产生。搅拌时间为24h，随搅拌时 间的延长，水中油的含量增加，但增加量逐渐平缓。搅拌后，为使混合液中非分散的油成分 与己分散和溶解组分分离，静置4h。
三、发光细菌相对发光度的测定
测定时的室温要控制在2(K25'c，同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过士rc。在
试管架上按下列方式排列测试管左侧放对照管，右侧放样品管(从低载荷率到高载荷率依 次排列)，每管3个重复，具体摆放位置见表l。
表l.试管在试管架上的排列
对照管样品管
空白l空白2空白3样l样l样l样2样2样2…样n样n样n
给每支作为对照管的试管加1.98ml的人工海水，给每支作为样品管的试管加1.98ml的 润滑油WAF溶液。向每管中加入步骤一制备的备用的发光细菌菌液0.02ml，放入发光光度计 中检测。
相对放光度
对照管发光度(wr) 四、半数效应载荷率EL5o的确定
以相对发光度与载荷率之间的关系做出关系曲线并得到相关方程，根据方程求的 EL50=2901.96 mg/L。根据表2得知润滑油的毒性属于低毒。
权利要求
1、一种海洋溢油生物毒性快速检测方法，其特征在于，该方法步骤如下一、发光细菌的培养菌种采用明亮发光杆菌T3变种(Photobacterium phosphoreum)，制备发光菌新鲜菌悬液(1)斜面菌种培养在新鲜斜面上接出第一代斜面，25℃±0.5℃培养24h后立即转接第二代斜面，25℃±0.5℃培养24h后再转接第三代斜面，25℃±0.5℃培养24h后备用；(2)摇瓶菌液培养取第三代斜面菌种近一环，接种于装有30ml细菌培养液的100ml三角烧瓶中，25℃±0.5℃，160r/min下培养24h备用；(3)将培养后的发光细菌菌悬液稀释至每毫升108个～109个细胞，初始发光度不低于800mV，备用；斜面和菌液的营养基为胰蛋白胨0.5g NaCl 3g Na2HPO40.5g KH2PO40.5g酵母0.5g甘油0.3g 蒸馏水100ml 固体培养基加琼脂1.69g二、水融合组分的制备配置人工海水作为WAF中的水溶液和稀释水溶液，人工海水的配方为NaCl 20gMgSO4 3.6gMgCl 7.2g无水CaCl2 0.7g蒸馏水 1000ml将润滑油设置10g/L、8g/L、6g/L、4g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L 7个载荷率梯度；制备WAF溶液，如果试验材料比水密度小，应采用从容器底部搅拌试验材料的搅拌器，而对于那些密度比水大的试验材料，则应采用从容器顶部搅拌试验溶液的搅拌器，搅拌器的搅拌速度应该适当、匀速，为1200-1500rpm/min，一般液面漩涡的深度为WAF溶液制备容器中试验液高度的10％-35％，搅拌时间为24h，搅拌后，静置4h；三、发光细菌相对发光度的测定测定时的室温要控制在20～25℃，同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过±1℃。取若干试管，给每支作为对照管的试管加1.98ml的人工海水，给每支作为样品管的试管加1.98ml的WAF溶液。向每管中加入步骤一制备的备用的发光细菌菌液0.02ml，放入发光光度计中检测；四、半数效应载荷率EL50的确定(1)绘制试验材料载荷率(mg/L)与其相对发光度(％)的相关曲线或相关方程；(2)在相关曲线坐标图上，相对发光度50％处画一水平线，与相关曲线有一交点，该点的载荷率即是半数效果载荷EL50值，如建立了相关方程，也可代入该方程求出样品的EL50值；(3)根据的EL50值鉴别不同油品的生物毒性。
全文摘要
本发明涉及一种海洋溢油生物毒性快速检测方法，该方法通过发光细菌作为检验海洋溢油生物毒性的受试生物，同时利用人工海水配制水融合组分(WAF，water accommodation friction)，解决了以往发光细菌实验中由于应用纯水作为配制水融合组分的溶剂，从而降低了海洋发光细菌的盐度，改变了发光细菌的生活条件而给实验带来的误差。
文档编号C12N1/20GK101551336SQ20091001042
公开日2009年10月7日 申请日期2009年2月20日 优先权日2009年2月20日
发明者刘长安, 张世宇 申请人:国家海洋环境监测中心