专利名称：一种海洋发光细菌的复壮方法
技术领域：
本发明涉及一种海洋发光细菌的复壮方法，该方法主要用于保藏或维持微生物的性能及繁殖能力，恢复海洋发光细菌制备冻干粉的能力并调节其发光强度。
背景技术：
随着环境污染日益严重，大量的有毒有害污染物被排放到湖泊、河流和海洋，对水生生态系统的生态平衡和生物体造成危害，由于发光细菌毒性测试法具有检测快速、简便等优点，该方法在国内外得到广泛应用。发光细菌毒性测试中应用最广泛的是海洋发光细菌(Photobacteriumphosporum),但由于反复传代或保藏不当等原因,造成海洋发光细菌性能退化，导致发光细菌因无法制备成冻干粉而不方便保藏和使用，甚至不能用于毒性测试， 因此需要对菌种进行复壮以恢复其性能。现有技术中菌种的复壮通常采用其专用培养基反复培养的方法实现，如明亮发光杆菌采用明亮发光杆菌培养基反复培养的方法复壮，但当菌种退化程度较严重时，该方法并不适用，即使经过数代培养仍无法恢复其性能。此外，不同种类的海洋发光细菌的发光强度范围相差较大，比如明亮发光杆菌的发光强度较强，费氏弧菌的发光强度较弱，而微弱光检测仪的检测范围有限，这样就限制了某些海洋发光细菌的推广应用。例如，BHP9511型水质毒性快速检测仪可检测OlOOOOOOs—1 范围的光强度，而对于明亮发光杆菌发出的较强的光则不能检测。因此有必要寻找一个途径以解决发光细菌的发光强度与微弱光检测仪的检测范围不匹配的问题。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中海洋发光细菌的复壮效果不理想及海洋发光细菌的发光强度与某些微弱光检测仪的检测范围不匹配的问题，提供一种海洋发光细菌复壮的新方法。为达到上述目的，本发明提供了一种海洋发光细菌的复壮方法，包括复壮培养、筛选和验证过程，其特征在于I)复壮培养过程所用的复壮培养基的配方为氯化铵O. 3g/L，碳酸钙lg/L，酪蛋白水解酶2-8g/L，硫酸镁O. 3g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化钠20_30g/L，甘油磷酸钠20_25g/L， 酵母膏 2. 5g/L，pH7±0.2 ;2)复壮培养时，将菌种接种到复壮培养基进行传代培养，并在每次传代培养21h 的时候检测菌液的发光强度，直至发光强度达到ΘΟΟΟΟΟ-ΙΟΟΟΟΟΟ Γ1为止；3)筛选过程中，用发光强度在600000-1000000^1之间的菌液分离单菌落，并选取发光强度与菌液的发光强度基本一致的单菌落保存备用；4)采用制作冻干粉的方式对所筛选的单菌落的菌种进行验证。上述用于检测发光强度的检测仪型号为BHP9511型水质毒性快速检测仪。本发明的复壮方法提高了海洋发光细菌的繁殖能力及传代稳定性，使其恢复制备冻干粉的能力，并且调节了海洋发光细菌的发光强度，以便与微弱光检测仪的检测范围相匹配。
具体实施例方式下面结合实施例做进一步描述。实施例I:费氏弧菌的复壮I)材料及设备衰退的费氏弧菌发光强度为5000-50000S-1 ；复壮培养基，其配方为氯化铵O. 3g/L，碳酸钙lg/L，酪蛋白水解酶3g/L，硫酸镁
O.3g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化钠25g/L，甘油磷酸钠24g/L，酵母膏2. 5g/L，pH7±0. 2 ；BHP9511型水质毒性快速检测仪检测范围为OIOOOOOOs'2)操作步骤首先进行复壮培养，即将菌种接种到复壮培养基上，在23°C，130r/min的条件下传代培养，每次传代21h的时候用BHP9511型水质毒性检测仪检测菌液的发光强度，直至发光强度达到600000-1000000S4之间为止；然后筛选菌种，即将选取的发光强度在600000-1000000^1之间的菌液接种到固
体培养基进行培养，并分离单菌落；观察菌落的发光强度，选取发光强度与菌液的发光强度基本一致的单菌落保存备用；最后，通过将所选取的单菌落制作成冻干粉的方式进行验证。实验证明，复壮后的费氏弧菌能制成冻干粉，并且发光强度在800000-1 lOOOOOs—1 之间。实施例2 :明亮发光杆菌的复壮I)材料及设备衰退的明亮发光杆菌菌种繁殖缓慢，发光强度4000000-5000000^ ；复壮培养基，其配方为氯化铵0. 3g/L，碳酸钙lg/L，酪蛋白水解酶7g/L，硫酸镁
0.3g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化钠30g/L，甘油磷酸钠21g/L，酵母膏2. 5g/L，pH7±0. 2 ；BHP9511型水质毒性快速检测仪检测范围为OIOOOOOOs'2)操作步骤将菌种接种到复壮培养基上，在18°C，130r/min的条件下传代培养， 每次传代21h的时候检测菌液的发光强度，选取发光强度在600000-1000000^1之间的菌液分离单菌落，观察单菌落的发光强度，选取发光强度与菌液的发光强度基本一致的单菌落， 将所选取的单菌落制作成冻干粉。实验证明，复壮后的明亮发光杆菌能制成冻干粉，并且发光强度在 1500000-2000000S 1之间，复壮后的明亮发光杆菌的发光强度与BHP9511型水质毒性快速检测仪的检测范围相匹配。
权利要求
1.一种海洋发光细菌的复壮方法，包括复壮培养、筛选和验证过程，其特征在于1)复壮培养过程所用的复壮培养基含有酪蛋白水解酶2-8g/L，甘油磷酸钠20-25g/L， 酵母膏2. 5g/L ；2)复壮培养时，将菌种接种到复壮培养基进行传代培养，并在每次传代培养21h的时候检测菌液的发光强度，直至发光强度达到ΘΟΟΟΟΟ-ΙΟΟΟΟΟΟ Γ1为止；3)筛选过程中，用发光强度在600000-1000000^1之间的菌液分离单菌落，并选取发光强度与菌液的发光强度基本一致的单菌落保存备用。
2.如权利要求I所述的海洋发光细菌的复壮方法，其特征在于所述复壮培养基还含有氯化铵0. 3g/L，碳酸钙lg/L，硫酸镁0. 3g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化钠20_30g/L，所述复壮培养基的pH为7±0.2。
3.如权利要求I或2所述的海洋发光细菌的复壮方法，其特征在于采用制作冻干粉的方式对所筛选的单菌落进行验证。
4.如权利要求I或2所述的海洋发光细菌的复壮方法，其特征在于所述用于检测发光强度的检测仪型号为BHP9511型水质毒性快速检测仪。
全文摘要
本发明涉及一种海洋发光细菌的复壮方法，通过将菌种接种到复壮培养基进行传代培养，并依据发光强度对菌种进行筛选，最后将筛选的菌种制成冻干粉进行验证。本发明的复壮方法主要用于保藏或维持微生物的性能及繁殖能力，恢复海洋发光细菌制备冻干粉的能力并调节其发光强度。
文档编号C12R1/01GK102604873SQ201210093948
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者吴雪静, 洪明章, 赵莹, 高金贺 申请人:北京滨松光子技术股份有限公司