专利名称：一种海洋细菌生物农药生产菌株选优的方法
技术领域：
本发明涉及生物农药制备技术，具体是一种海洋细菌生物农药生产菌株选优的方法。
现有技术中，生物农药的制备分为两种类型。一是农用抗菌素(放线菌等产生的次生代谢产物)，二是农用杀虫剂(苏云金杆菌的活性孢子、半孢晶体)。农用抗菌素生物农药的制备，常用菌种活化后，进行深层发酵培养，而后板框过滤除去菌丝体，发酵液经减压真空浓缩后，制备成品；农用杀虫剂生物农药的制备，菌种活化后，或用深层发酵法浓缩活性孢子，或用固体发酵法增殖活性孢子，而后制备成产品，不论那一种生物农药制备方式，其首要问题是生产菌株的选优，高产优良生产菌株的获得，是生物农药制备的关键，常规生产菌株活化，手续烦琐，选择时无明显标记，传代活化后仍很难保护优良菌株的高产，优质农用抗菌素的特性，因此在生产应用时，有时往往会出现发酵水平的不稳定。
为了克服上述不足，本发明的目的是提供一种操作简单易行，结果准确可靠，生产成本较低，生产菌株活化复壮效果好的海洋细菌生物农药生产菌株选优的方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案是在如下两个常规步骤中添加NaCl和探针，具体为①在活化培养海洋细菌生物农药优良生产菌株的基质中添加NaCl和探针，在琼脂平板上分离活化后，挑选出脱氧核糖核酸高表达特征单菌落纯的纯培养物，并移接到斜面上培养活化；②在模拟生产用的培养基与发酵工程工艺的摇瓶发酵试验中，再加入NaCl和探针进行调控；所述NaCl添加量为基质的20～40‰；所述探针添加量为基质的1～10ppm。
本发明具有如下优点1．操作简便，结果准确可靠，高活性生产菌株活化复壮效率高。采用本发明，可获得高活性生产菌种的优良菌株，可使海洋细菌生物农药制备的成功率几乎达到100％，发酵损失倒罐率有可能降低到1％以下。
2．工作效率高，经济效益大。本发明应用BAC探针技术选优高产菌株的检出，发酵工程工艺模拟的调控试验，工作效率高，相对经济效益明显，与常规方法比较，工作效率提高约200％，经济效益翻一番。
3．应用范围广。本发明原则上可应用到各行业的微生物发酵工程中有关制备工序中高产优质生产菌株的选优，特别适用于海洋细菌生物农药生产菌株的选优。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1本发明可按以下步骤操作1．琼脂平板稀释与影印技术相结合的定向检出采用9912海洋细菌1000g培养基制备琼脂、倒平板(平皿)，冷却后备用，对保存的生产菌株分别做10-5、10-6、10-7稀释度的菌悬液，涂平板(平皿)，然后按常规培养温度(28℃)进行恒温培养48h，将培养好的平板(平皿)，选其中出现单菌落数在50个的平板，添加NaCl40g，添加探针0.01g，应用微生物遗传学上通用影印技术，对好菌落在皿中的坐标位置，影印到另一个加有NaCl和探针基质的琼脂平板上，然后再放入到28℃恒温箱中培养48h，取出，挑选出具有特征性的单菌落(或具有特征性的色泽，或具有特征性的形态，或具有特征性的透明环)，进行编号，移入斜面中，28℃保温培养48h后，放冰箱(10℃)中保存备用，经验证达标高产优良菌株的检出率占总量的20％以上；
2．摇瓶试验采用模拟生产工艺培养基质的配方与发酵条件，在500ml三角瓶中分装培养基50ml(如用250ml三角瓶中分装时，则只装25ml)，这种摇瓶培养基中加有20g NaCl，并添加有0.01g探针基质，按常规摇瓶培养方法工序进行消毒灭菌，在旋转式摇床中保温培养24h(120～160r.p.m)，取出，发酵液经20000r.p.m冷冻高速离心机离心5分钟，弃沉淀、取滤液，控海洋细菌生物农药(农用抗菌素)测定方法检测，达标高产生物农药(农用抗菌素)的发酵成功率在90％以上。
在添加NaCl的高渗条件选择上，由于海洋细菌多生活在20～40‰ NaCl的海水环境中，故需模拟此特点，以提高优良生产菌株的检出率，若采用小于20‰ NaCl浓度杂菌入选机会就多，采用大于40‰ NaCl浓度，所需检出高产优质的目的菌株，往往生长不好或不生长，所以高渗条件的选择十分重要，以选择20～40‰ NaCl浓度范围内最为理想，探针的添加量以1～10ppm最为理想，这样的高渗探针的综合效果就高。
所述探针采用中国科学院沈阳应用生态研究所钓取的海洋细菌高产生物农药菌株优选用BAC探针。
实施例2本发明可按以下步骤操作1．琼脂平板稀释与影印技术相结合的定向检出采用9601海洋细菌1000g培养基制备琼脂、倒平板(平皿)，冷却后备用，对保存的生产菌株分别做10-5、10-6、10-7稀释度的菌悬液，涂平板(平皿)，然后按常规培养温度(28℃)进行恒温培养48h，将培养好的平板(平皿)，选其中出现单菌落数在10个的平板，添加NaCl 20g，添加探针0.001g，应用微生物遗传学上通用影印技术，对好菌落在皿中的坐标位置，影印到另一个加有NaCl和探针基质的琼脂平板上，然后再放入到28℃恒温箱中培养48h，取出，挑选出具有特征性的单菌落(或具有特征性的色泽，或具有特征性的形态，或具有特征性的透明环)，进行编号，移入斜面中，28℃保温培养48h后，放冰箱(4℃)中保存备用，经验证达标高产优良菌株的检出率占总量的20％以上；2．摇瓶试验采用模拟生产工艺培养基质的配方与发酵条件，在500ml三角瓶中分装培养基50ml(如用250ml三角瓶中分装时，则只装25ml)，这种摇瓶培养基中加有20g NaCl，并添加有0.01g探针基质，按常规摇瓶培养方法工序进行消毒灭菌，在旋转式摇床中保温培养24h(120～160r.p.m)，取出，发酵液经20000r.p.m冷冻高速离心机离心5分钟，弃沉淀、取滤液，控海洋细菌生物农药(农用抗菌素)测定方法检测，达标高产生物农药(农用抗菌素)的发酵成功率在90％以上。
实施例3本发明可按以下步骤操作1．琼脂平板稀释与影印技术相结合的定向检出采用9602海洋细菌1000g培养基制备琼脂、倒平板(平皿)，冷却后备用，对保存的生产菌株分别做10-5、10-6、10-7稀释度的菌悬液，涂平板(平皿)，然后按常规培养温度(28℃)进行恒温培养48h，将培养好的平板(平皿)，选其中出现单菌落数在30个的平板，添加NaCl 30g，添加探针0.005g，应用微生物遗传学上通用影印技术，对好菌落在皿中的坐标位置，影印到另一个加有NaCl和探针基质的琼脂平板上，然后再放入到28℃恒温箱中培养48h，取出，挑选出具有特征性的单菌落(或具有特征性的色泽，或具有特征性的形态，或具有特征性的透明环)，进行编号，移入斜面中，28℃保温培养48h后，放冰箱(2℃)中保存备用，经验证达标高产优良菌株的检出率占总量的20％以上；2．摇瓶试验采用模拟生产工艺培养基质的配方与发酵条件，在500ml三角瓶中分装培养基50ml(如用250ml三角瓶中分装时，则只装25ml)，这种摇瓶培养基中加20g Nacl，并添加有0.01g探针基质，按常规摇瓶培养方法工序进行消毒灭菌，在旋转式摇床中保温培养24h(120～160r.p.m)，取出，发酵液经20000r.p.m冷冻高速离心机离心5分钟，弃沉淀、取滤液，控海洋细菌生物农药(农用抗菌素)测定方法检测，达标高产生物农药(农用抗菌素)的发酵成功率在90％以上。
权利要求
1．一种海洋细菌生物农药生产菌株选优的方法，其特征在于在如下两个常规步骤中添加NaCl和探针，具体为①在活化培养海洋细菌生物农药优良生产菌株的基质中添加NaCl和探针，在琼脂平板上分离活化后，挑选出脱氧核糖核酸高表达特征单菌落纯的纯培养物，并移接到斜面上培养活化；②在模拟生产用的培养基与发酵工程工艺的摇瓶发酵试验中，再加入NaCl和探针进行调控。
2．按照权利要求1所述海洋细菌生物农药生产菌株选优的方法，其特征在于所述NaCl添加量为基质的20～40‰。
3．按照权利要求1所述海洋细菌生物农药生产菌株选优的方法，其特征在于所述探针添加量为基质的1～10ppm。
全文摘要
本发明涉及一种海洋细菌生物农药生产菌株选优的方法。是在如下两个常规步骤中添加Nacl和探针,具体为①在活化培养海洋细菌生物农药优良生产菌株的基质中添加NaCl和探针,在琼脂平板上分离活化后,挑选出脱氧核糖核酸高表达特征单菌落纯的纯培养物,并移接到斜面上培养活化;②在模拟生产用的培养基与发酵工程工艺的摇瓶发酵试验中,再加入NaCl和探针进行调控;NaCl添加量为基质的20～40%;探针添加量为基质的1—10ppm。本发明操作简单,结果准确,成本低,菌株活化复壮效果好。
文档编号A01N63/00GK1301812SQ9912268
公开日2001年7月4日 申请日期1999年12月29日 优先权日1999年12月29日
发明者王书锦, 薛德林, 胡江春, 马成新, 刘全永 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所