专利名称：：山杨的组织培养和快速繁殖培养基的制作方法
技术领域：
：本发明属生物工程
技术领域：
。具体的讲，本发明属植物生物技术的杨树生物技术研究领域。杨树作为林木细胞工程的模式种，其组织培养技术一直为国内外学者所关注。从六十年代末起，国外就开始对杨树的组织培养进行研究(Winton等，1968)。Winton等人分别于1970年和1971年对美洲山杨(Populustremuloides)和欧洲山杨(P.tremula)组织培养获得成功。我国的杨树离体培养工作开始于七十年代，但主要以毛白杨(P.tomentosa)、银白杨(P.alba)及一些杂交杨为主。有关山杨(P.davidiana)的组织培养报道仅集中发表在1993年出版的山杨育种研究一书中，其中徐妙珍、刘培林等人发表了山杨组织培养的研究，详细报道了有关山杨的组织培养技术。他们虽然完成了山杨的组织培养，但并没有筛选出一种最佳培养基。本发明的目的在于提供一种山杨的组织培养基，其分化率高，单芽分化率可达数十倍的山杨的组织培养和快速繁殖培养基。本发明采用的技术方案是培养基的组成成分a、该培养基的组成成分是KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、Ca(NO3)2、K2SO4、CaCl2·2H2O、KH2PO4、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、KI、NaMoO4·2H2O、EDTA-Fe、烟酸、肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺、盐酸吡哆醇、琼脂、蔗糖，本发明的特征是在原来WP培养基基础上增加了6-BA、NAA及IBA，提高了KH2PO4的含量，同时降低了K2SO4和CaCl2·2H2O的含量。b、配置培养基配方为<tablesid="table1"num="002"><table>成分含量(mg/L)KNO3、NH4NO3MgSO4·7H2OCaCl2·2H2OKH2PO440040037040-60150-300Ca(NO3)2556K2SO4500-800Na2-EDTAFeSO4·7H2O37.327.8KI0.83H2BO3MnSO4·H2OZnSO4·7H2OCuSO4·5H2ONa2MoO4·2H2O6.222.38.60.250.25烟酸肌醇甘氨酸盐酸硫胺盐酸吡哆醇0.550255琼脂蔗糖8000-1500020000-250006-BANAAIBA0.5-0.80.005-0.010.8-1</table></tables>本发明的优点在于本发明减少了激素含量和种类，降低了成本。分化率高，单芽分化率可达数十倍。试管苗期闻即表现出很强的生长势，木质化程度高，叶片鲜绿，叶面积大。下面对本发明的实施例作进一步详细描述。培养基的组成成分a、该培养基的组成成分是KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、Ca(NO3)2、K2SO4、CaCl2·2H2O、KH2PO4、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、KI、NaMoO4·2H2O、EDTA-Fe、烟酸、肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺、盐酸吡哆醇、琼脂、蔗糖，本发明的特征是在原来WP培养基基础上增加了6-BA、NAA及IBA，提高了KH2PO4的含量，同时降低了K2SO4和CaCl2·2H2O的含量。6、配呈培养基配方为各个时期所用培养基配方具体包括以下三种类型分化培养基WP+6-BA0.5-0.8mg/L+NAA0.01-0.05mg/L继代培养基WP+6-BA0.5-1mg/L+NAA0.05-0.2mg/L生根培养基WP+IBA0.8-1mg/L所述的生根苗移植培养环境的湿度要保持在90-100％或过饱和状态，光照强度在500-8000勒克司。应用以上培养基，用山杨的顶芽、侧芽、叶片经消毒后接种在该培养基上，两个月可以产生丛生芽。转移到适当的培养基里培养7-10天，即可诱导生根。待生根苗生长健壮后，即可进行移栽，经温室培养两周，逐渐移至苗圃培养。发明人曾用中国山杨(PopulusdavidianaDove)的叶片和芽进行培养，取得成功，具体操作如下于12月至次年3月从生长健壮、无病虫害的优良母树上采集枝条，枝条采回后，及时修剪成适于保存的枝段，用塑料布包好，保存于4℃冰箱即可。接种前将枝段截成直径约0.5-0.8cm的小枝段于室温下水培3-5天，待芽膨大时即可用于接种。接种前首先要进行外植体的表面消毒处理。①、芽外植体消毒将芽取下后，首先用肥皂水冲洗数次，再用自来水冲洗干净，然后用70％乙醇消毒2分钟，无菌水冲洗3次，然后转移在超净工作台中再用3％次氯酸钠清洗10分钟，无菌水冲洗3次，即可用于接种。②、叶片外植体消毒取以充分展开的叶片，先用无菌水冲洗，然后用70％乙醇消毒60秒，无菌水冲洗3次，最后再在超净工作台中再用3％次氯酸钠清洗8分钟，无菌水冲洗3次，即可用于接种。山杨组织培养采用WP培养基作为基本培养基，再根据不同时期的具体需要添加适宜的激素。不同时期采用的培养基类型如下①、分化培养基WP+6-BA0.8mg/L+NAA0.01mg/L②、继代培养基WP+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L③、生根培养基WP+IBA1mg/L上述各种培养基配置时除添加以上成分外，还要添加蔗糖2.5％，琼脂粉1％，PH值调整为6.5，分装后在121℃、1.1Kg/cm2的压力下灭菌20分钟。将外植物消毒后，接种到适宜培养基中，接种过程中要严格进行无菌操作，以免培养材料被污染，接种后将接种体置于培养室培养，培养温度控制在25℃±1，每天用2000勒克司照光10小时，接种体3-4周继代一次，连续培养2-3代，就可以形成多丛分化苗。当分化苗苗茎长到1.5-2cm、直径约1mm时，由茎基部剪断接入生根培养基，1周左右即可看到幼根。经过3-4周培养，小苗已具有了发达、健壮的根系，苗茎已木质化，此时即可进行移栽。将生长键壮的试管苗除去棉塞进行3天的炼苗，使试管苗由完全异养逐渐适应自养环境。移栽前在培养瓶中到入少许清水，将培养基浸软，以减少试管苗根系损伤。用镊子将小苗从培养瓶中夹出，洗去根上粘着的培养基，将根系小心展开，栽入营养钵中，浇透水，移入温室培养。试管苗移植初期对环境条件要求严格，环境湿度控制在90％，光照强度控制到5000勒克司，以能保证移栽成活率。权利要求1.一种山杨的组织培养和快速繁殖培养基，其特征在于培养基的组成成分a、该培养基的组成成分是KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、Ca(NO3)2、K2SO4、CaCl2·2H2O、KH2PO4、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、KI、NaMoO4·2H2O、EDTA-Fe、烟酸、肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺、盐酸吡哆醇、琼脂、蔗糖，本发明的特征是在原来WP培养基基础上增加了6-BA、NAA及IBA，提高了KH2PO4的含量，同时降低了K2SO4和CaCl2·2H2O的含量。b、配置培养基配方为各个时期所用培养基配方具体包括以下三种类型分化培养基WP+6-BA0.5-0.8mg/L+NAA0.01-0.05mg/L继代培养基WP+6-BA0.5-1mg/L+NAA0.05-0.2mg/L生根培养基WP+IBA0.8-1mg/L2.按照权利要求1所述的山杨的组织培养和快速繁殖培养基，其特征在于生根苗移植培养环境的湿度要保持在90-100％或过饱和状态，光照强度在500-8000勒克司。全文摘要一种山杨的组织培养和快速繁殖培养基属生物工程
技术领域：
。本发明解决了利用山杨器官、组织进行组织培养和快速繁殖的技术关键。该培养基的特征是一种改良的WP培养基,该培养基通过增加6－BA、NAA、IBA及提高KH文档编号A01H4/00GK1299586SQ9912265公开日2001年6月20日申请日期1999年12月16日优先权日1999年12月16日发明者祖元刚,阎秀峰,范继红,孔瑾,石福臣,张宝友,吴宇,于景华申请人:东北林业大学,祖元刚,阎秀峰,范继红,孔瑾,石福臣,张宝友,吴宇,于景华