一种发光细菌冻干制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种发光细菌冻干制剂的制备方法，具体地，包括步骤：a.提供一含发光细菌和保护剂的液态混合物；b.将所述的混合物降温至第一温度区间T1并在第一温度区间维持一段时间P1；c.将所述降温后的混合物从第一温度区间T1升温至第二温度区间T2，并在第二温度区间维持一段时间P2；d.将所述的升温后的混合物升温从第二温度区间上升至第三温度区间T3,并维持一段时间P3；和e.将所述的休眠混合物进行干燥，从而形成发光细菌的冻干制剂。本发明方法制备的发光细菌冻干制剂稳定性高，复苏后的活性有效时间长。
【专利说明】一种发光细菌冻干制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物制剂领域，具体地，涉及发光细菌尤其是青海弧菌（Vibrio qinghaiensis)的冻干制剂领域。
【背景技术】
[0002] 利用发光细菌对于毒物的敏感性，进行测试和评价环境或食品的综合急性毒性已 成为越来越常用的监测方法。
[0003] 在利用发光细菌测试毒物毒性的技术测试和评价环境或食品的综合急性毒性过 程中，通常使用发光细菌培养液或发光细菌冷冻干燥试剂。
[0004] 发光细菌的培养液与冷冻干燥试剂相比，培养液使用复杂，需要先将发光细菌进 行固体斜面培养基培养，培养过程往往需要反复操作多次，发光细菌培养液稳定性和一致 性差，对培养时间和环境以及专业人员要求高。
[0005] 目前，发光细菌冻干制剂相比培养液而言，虽然具有携带方便、操作简单的优点， 但由于复苏后的冻干细菌有效性保持时间较短，仅1小时左右，并不能满足长时间的测试 需求。
[0006] 因此，本领域迫切需要开发一种稳定性高且能在复苏后长时间有效的冻干制剂。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种发光细菌冻干制剂及其制备方法，以及一种包括本发明发光细 菌冻干制剂的试剂盒。
[0008] 本发明的第一方面，提供了发光细菌冻干制剂的制备方法，包括步骤：
[0009] a.提供一含发光细菌和保护剂的液态混合物；
[0010] b.将所述的混合物降温至第一温度区间Tl并在第一温度区间维持一段时间 P1，从而形成降温后的混合物，其中所述的第一温度区间Tl为-100?-60°c，更佳地 为-90?-70°C ;P1为0. 2?10小时，较佳地，为0. 5?8小时，更佳地，为1?4小时；
[0011] C.将所述降温后的混合物从第一温度区间Tl升温至第二温度区间T2,并 在第二温度区间维持一段时间P2,从而形成升温后混合物，所述的第二温度区间T2 为-55?-30°C，更佳地为-40?-35°C ;P2为0. 2?24小时，更佳地，为0. 5?10小时；
[0012] d.将所述的升温后的混合物升温从第二温度区间上升至第三温度区间T3,并维 持一段时间P3,从而形成休眠混合物，所述的第三温度区间T3为-5?0°C，且P3为1?72 小时，更佳地，维持5?24小时；和
[0013] e.将所述的休眠混合物进行干燥，从而形成发光细菌的冻干制剂。
[0014] 在另一优选例中，在步骤b中，所述的降温是将0?40°C液态混合物降至第一温度 区间T1。
[0015] 在另一优选例中，在步骤b中，所述的降温速率为1_5°C /min。
[0016] 在另一优选例中，在步骤b中，所述的降温时间为0. 25 - 2小时。
[0017] 在另一优选例中，步骤d中还包括步骤：将所述升温后的混合物分阶段升温至所 述的第三温度区间T3。
[0018] 在另一优选例中，所述的分阶段包括分为一阶段、两阶段或三阶段。
[0019] 在另一优选例中，包括将所述的混合物升温至一个或多个亚温度区间S，所述的亚 温度区间选自下组：-25±2°C、-20±2°C、-15±2°C、-10±2°C。
[0020] 在另一优选例中，在各亚温度区间的维持时间Ps为5?60min，更佳地，为10? 30min〇
[0021] 在另一优选例中，所述的分阶段为两阶段，每阶段升温速率为rc /min，每阶段维 持时间为15分钟。
[0022] 在另一优选例中，所述升温的速率为2-10°C /min。
[0023] 较佳地，所述升温的速率为3-8°C /min。
[0024] 在另一优选例中，所述方法还具有选自下组的一个或多个特征：
[0025] ?从第一温度区间Tl升温至第二温度区间T2的升温速率为1-6°C /min ;
[0026] ?从第一温度区间Tl升温至第二温度区间T2的升温时间为5-30分钟；
[0027] ?从第二温度区间T2升温至第三温度区间T3的升温速率为1_6°C /min ;
[0028] ?从第二温度区间T2升温至第三温度区间T3的升温时间为5-30分钟；
[0029] 在另一优选例中，所述的发光细菌是选自以下属的发光细菌：弧菌属（Vibrio)、 发光杆菌属（Photobacterium)、光杆菌属（Photorhabdus)。
[0030] 在另一优选例中,所述的发光细菌是青海弧菌或其衍生菌。
[0031] 在另一优选例中，所述的发光细菌是来自发光杆菌属的明亮发光杆菌。
[0032] 在另一优选例中，所述的发光细菌是来自弧菌属的费氏弧菌（Vibrio fischeri)。
[0033] 在另一优选例中，步骤a中所述的保护剂包括奶粉、海藻糖
[0034] 步骤e中，所述的干燥为真空干燥。
[0035] 本发明的第二方面，提供了一种发光细菌的冻干制剂，所述的冻干制剂经复苏后， 发光细菌的存活半衰期T 1/2 > 4小时。
[0036] 在另一优选例中，Τ1/2为5_10小时。
[0037] 在另一优选例中，Τ1/2彡5小时，Τ1/2彡6小时，Τ 1/2彡7小时，Τ1/2彡8小时，Τ1/2彡10 小时，
[0038] 本发明的第三方面，提供了一种发光细菌的冻干制剂，所述的冻干制剂中发光细 菌的发光计数值在40万光子数以上。
[0039] 在另一优选例中，所述的发光计数值为按ISO标准ISOl 1348-3-2007所述方法，于 冻干制剂复苏后15分钟时测定值（Ikl5或Ic15)。
[0040] 在另一优选例中，发光计数值> 50万光子数、> 60万光子数、或> 70万光子数。
[0041] 在另一优选例中，所述的冻干制剂是由本发明第一方面中任一所述的方法制备。
[0042] 本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括容器以及位于所述容 器中的权利要求7或8所述的冻干制剂。
[0043] 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括使用说明书和任选的一种或多种选自下组 的任选试剂：
[0044] (a)复苏液或复苏试剂；
[0045] (b)检测试剂；
[0046] 在另一优选例中，所述的复苏液包括0. 85%氯化钠溶液
[0047] 在另一优选例中，所述的冻干制剂和任选试剂是独立包装的。
[0048] 本发明的第五方面，提供了一种检测方法，所述的方法包括步骤：
[0049] i)将本发明第二或第三方面所述的发光细菌的冻干制剂复苏，形成复苏后的发光 细菌的菌液；
[0050] ii)将所述的发光细菌的菌液与待测物进行接触，从而通过测定发光细菌的发光 强度来定性或定量检测待测物中的毒物。
[0051] 在另一优选例中，所述的待测物包括水样。
[0052] 在另一优选例中，所述的毒物包括重金属、农药、有机化合物等。
[0053] 在另一优选例中，所述的复苏步骤包括将所述冻干制剂与复苏液混合，从而并形 成复苏后的发光细菌的菌液，并在室温（10?40°C )下放置一段时间（如0. 5?2小时）。
[0054] 在另一优选例中，所述方法还包括步骤：测定复苏后的发光细菌的初始发光强度。
[0055] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0056] 图1显示了实施例1中，制备青海弧菌冻干制剂的温度曲线。
[0057] 图2是本发明试剂做空白对照液测试数据的结果图。可以发现本发明试剂的发光 抑制率一直平稳保持到90分钟后，没有明显的下降趋势。
[0058] 图3是使用本发明试剂做参比毒物氯化锌样品测试数据的结果图。可以发现本发 明试剂的发光抑制率一直平稳保持到22小时后，没有明显的下降趋势。
[0059] 图4使用H试剂做的空白对照液测试数据的结果图。可以发现H试剂的发光抑制 率在60分钟后有急剧下降的趋势。
【具体实施方式】
[0060] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，将低温冻存的发光细菌菌液 进行分阶段升温处理，可以极其显著地提高相应制剂中发光细菌的数量，并可显著提高复 苏后发光细菌的活性和半衰期（有效性维持时间长）。在此基础上，完成了本发明。
[0061] 发光细菌
[0062] 可用于本发明的发光细菌没有特别限制，可以为任何能够应用于环境或样本毒物 检测的发光细菌。
[0063] 常用的发光细菌可见朱文杰、郑天凌、李伟民等编著的《发光细菌与环境毒物检 测》ISBN978-7-5019-6625-7/X · 034。
[0064] 典型的发光细菌包括选自以下属的发光细菌：弧菌属（Vibrio)、发光杆菌属 (Photobacterium)、光杆菌属（Photorhabdus)等。代表性的发光细菌包括（但并不限 于）：费氏弧菌（Vibrio fischeri)、青海弧菌（Vibrio qinghaiensis)、明亮发光杆菌 (Photobacterium phosphoreum)。
[0065] 在另一优选例中，所述的发光细菌包括青海弧菌、费氏弧菌、明亮发光杆菌。
[0066] 发光细菌冻干制剂及其制备
[0067] 本发明提供的发光细菌冻干制剂精密度cv值小于10%，且复苏后保持有效的时间 至少为8小时，更佳地为10?24小时。
[0068] 本发明提供的发光细菌冻干制剂经复苏后，发光细菌的半数有效浓度EC5tl的检测 时间T1/2彡4小时。较佳地，T1/2为5-8小时；更佳地T1/2彡5小时，T 1/2彡6小时，T1/2彡7 小时，Τ1/2彡8小时。
[0069] 为了制备本发明的发光细菌冻干制剂，须严格控制制备过程中的温度和时间。本 发明的制备方法可以减少冻干过程中对于发光细菌损伤，有效提高保持发光细菌的活性和 稳定性，具体方法如下：
[0070] a.提供一含发光细菌和保护剂的液态混合物；
[0071] b.将所述的混合物降温至第一温度区间Tl并在第一温度区间维持一段时 间P1，从而形成降温后的混合物，其中所述的第一温度区间为-100?-60°c，更佳地 为-90?-70°C ;P1为0. 2?10小时，较佳地，为0. 5?8小时，更佳地，为1?4小时；
[0072] c.将所述降温后的混合物从第一温度区间Tl升温至第二温度区间T2,并 在第二温度区间维持一段时间P2,从而形成升温后混合物，所述的第二温度区间T2 为-55?-30°C，更佳地为-40?-35°C ;P2为0. 2?24小时，更佳地，为0. 5?10小时；
[0073] d.将所述的升温后的混合物升温从第二温度区间上升至第三温度区间T3,并维 持一段时间P3,从而形成休眠混合物，所述的第三温度区间T3为-5?0°C，且P3为1?72 小时，更佳地，维持5?24小时；和
[0074] e.将所述的休眠混合物进行干燥，从而形成发光细菌的冻干制剂。
[0075] 其中，保护剂包括奶粉、海藻糖等。
[0076] 包括将所述的混合物升温至一个或多个亚温度区间S，所述的亚温度区间选自下 组：-25±2°C、-20±2°C、-15±2°C、-10±2°C。
[0077] 在另一优选例中，在各亚温度区间的维持时间Ps为5?60min，更佳地，为10? 30min本发明所述的发光细菌冻干制剂制备方法可以通过人工温控或通过含自动温度控制 程序的冷冻干燥装置完成。
[0078] 在另一优选例中，所述的含自动温度控制程序的冷冻干燥装置为程控超低温冷冻 干燥机。
[0079] 在另一优选例中，所述的冷冻干燥装置设有预冻温度，为-100?_60°C。
[0080] 试剂盒及使用方法
[0081] 本发明所述的试剂盒包括本发明的发光细菌冻干制剂、溶媒以及密封容器，其中， 所述的冻干制剂和溶媒分别独立包装在密封容器中。
[0082] 可用于本发明的溶媒没有特殊限制，可以为任何能够使发光细菌冻干制剂在室温 (10-40°C )下复苏且对发光细菌和被测样本性质无影响的媒质。典型的溶媒包括0. 5%? 5%氯化钠溶液。
[0083] 在使用本发明的试剂盒时，可以将被测样品与17%氯化钠溶液混合形成被测物混 合液，并将本发明提供的发光细菌冻干制剂与溶媒混合形成发光菌混合液，后将被测物混 合液与发光菌混合液按19 :1的比例再混合成测试液；对照组制备步骤同上，区别是被测物 混合液由蒸馏水与17%氯化钠溶液混合而成；将对照液和测试液依次放入专用测光仪，得 到被测试的测试液和对照液读数，根据读数计算（计算方法可参考标准：IS011348-3-2007) 得到相对发光强度的变化率，根据相对发光强度的变化得到毒物毒性对于发光细菌发光的 抑制率，从而依次依据来判定毒物毒性的大小(发光细菌法)。
[0084] 本发明的有益效果
[0085] 1.本发明方法制备的发光细菌冻干制剂稳定性高：本发明的发光细菌冻干制剂 精密度cv值小于10%，而传统方法制备的发光细菌冻干制剂的精密度cv值在20%以上，二 者对比有明显的差异。
[0086] 2.本发明方法制备的发光细菌冻干制剂在复苏后的有效时间长：本发明的发光 细菌冻干制剂有效时间至少为8小时，而传统方法制备的发光细菌冻干制剂的有效时间为 1小时左右，因此，本发明的冻干制剂基本可以满足连续一天的测试要求，而不需要反复配 制测试制剂。
[0087] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量 份数。
[0088] 实施例1青海弧菌冻干制剂的制备：
[0089] 请简述制备方法：
[0090] 1. 1将分离青海弧菌菌液与保护剂混合形成菌液混合物；
[0091] 1. 2将混合物置入预冻至-86°c的冷冻干燥装置，并维持1小时；
[0092] 1. 3将降温后的混合物升温至_40°C，并维持2小时，形成一次升温后的混合物；
[0093] 1. 4将一次升温后的混合物再次升温至_20°C，并维持15min，重复该步骤，升温 至-KTC ;
[0094] 1. 5将1. 4得到的混合物升温至0°C，并维持8小时；
[0095] 1. 6将1. 5得到的混合物通过真空干燥，制得青海弧菌冻干制剂。
[0096] 实施例2青海弧菌冻干制剂2的制备
[0097] 制备方法同实施例1，详见表1 :
[0098] 实施例3青海弧菌冻干制剂3的制备
[0099] 制备方法同实施例1，详见表1 :
[0100] 表 1
[0101]
【权利要求】
1. 一种发光细菌冻干制剂的制备方法，其特征在于，包括步骤： a. 提供一含发光细菌和保护剂的液态混合物； b. 将所述的混合物降温至第一温度区间T1并在第一温度区间维持一段时间P1，从而 形成降温后的混合物，其中所述的第一温度区间T1为-100?-60°C;P1为0. 2?10小时； c. 将所述降温后的混合物从第一温度区间T1升温至第二温度区间T2,并在第二温度 区间维持一段时间P2,从而形成升温后混合物，所述的第二温度区间T2为-55?-30°C;P2 为0. 2?24小时； d. 将所述的升温后的混合物升温从第二温度区间上升至第三温度区间T3,并维持一 段时间P3,从而形成休眠混合物，所述的第三温度区间T3为-5?0°C，且P3为1?72小 时；和 e. 将所述的休眠混合物进行干燥，从而形成发光细菌的冻干制剂。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中还包括步骤：将所述升温后的混合 物分阶段升温至所述的第三温度区间T3。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的分阶段包括分为一阶段、两阶段或三 阶段。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述升温的速率为2-10°C /min，更佳地，所 述升温的速率为3-8°C /min。
5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的发光细菌是选自以下属的发光细菌： 弧菌属（Vibrio)、发光杆菌属（Photobacterium)、光杆菌属（Photorhabdus)。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的保护剂包括奶粉、海藻糖； 和/或 步骤e中，所述的干燥为真空干燥。
7. -种发光细菌的冻干制剂，其特征在于，所述的冻干制剂经复苏后，发光细菌的存活 半衰期T1/2彡4小时。
8. -种发光细菌的冻干制剂，其特征在于，所述的冻干制剂中发光细菌的发光计数值 在40万光子数以上。
9. 如权利要求7或8所述的冻干制剂，其特征在于，所述的冻干制剂是由权利要求1? 6中任一所述的方法制备。
10. -种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括容器以及位于所述容器中的权利要求 7或8所述的冻干制剂。
11. 一种检测方法，其特征在于，所述的方法包括步骤： i) 将权利要求7或8所述的发光细菌的冻干制剂复苏，形成复苏后的发光细菌的菌 液； ii) 将所述的发光细菌的菌液与待测物进行接触，从而通过测定发光细菌的发光强度 来定性或定量检测待测物中的毒物。
【文档编号】C12Q1/02GK104419644SQ201310411157
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】曾立波, 陈连康, 张玉荣, 丁国荣, 王菁 申请人:上海市刑事科学技术研究院, 上海安力康科学仪器有限公司