聋病易感基因线粒体12SrDNA 1555A＞G、1494C＞T突变比例检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了聋病易感基因线粒体12SrDNA1555A>G、1494C>T突变比例检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和一系列标准品；所述扩增试剂包括：PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增线粒体12SrDNA：1494C>T、1555A>G的引物混合物；所述一系列标准品包括：1494C>T、1555A>G突变比例标准品。本发明以上述2个聋病易感基因位点为检测对象，通过上述耳聋易感基因位点的扩增和荧光定量检测，与突变比例标准品的对比，即可筛选出含有上述位点突变的个体，同时确定各种突变的比例。对聋病易感基因的检测，尤其是对新生儿耳聋基因的筛查具有重要意义。
【专利说明】聋病易感基因线粒体12SrDNA 1555A > GJ494C > T突变
比例检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及聋病易感基因线粒体12SrDNA1555A>G、1494C>T突变比例检测试剂盒，属于生物检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]世界范围内对听力语言残疾者进行的致病因素研究表明，约60-80%患者的病因与遗传因素有关，其中发达国家的临床研究数据表明，遗传性耳聋在耳聋患者中约占80%。因此近十几年来，遗传性耳聋的发病机制及其分子流行病学的研究成为了聋病研究最重要的内容之一。随着人类基因组计划完成，聋病基因的定位和克隆取得了巨大的进步，聋病的分子遗传学研究和分子流行病学的数据使研究者们逐步认识到聋病易感基因突变在维护听力健康和发现听力异常中的重要性。
[0003]药物的耳毒性是导致语前听力损失的一个重要因素，部分与线粒体12S rRNA基因1555A>G突变有关，该突变可以增加耳蜗对氨基糖甙类药物的敏感性。在美国，耳毒性药物相关的听力损失患者中，10%的具有12S rRNA基因1555A>G突变，美国语前听力损失患者中，1555A>G突变患者的发病率约为1/20000-1/40000。在西班牙，12S rRNA基因1555A>G突变与15-20%的家族性非综合征型听力损失有关，许多年老的家族成员即使没有使用氨基糖甙类药物也可发生因此突变导致的听力下降。而在中国，药物性耳聋的发病率超出了原有的想象，在一系列的文章报道中，发现在门诊发现的耳聋患者中，约5%的患者是由于12S rRNA基因1555A>G突变导致的，而在聋哑学校这样一个特殊群体，则高达12 %的患者是由于12S rRNA基因1555A>G突变接触氨基糖甙类药物而致聋。同时在中国群体中还发现了 12S rRNA基因1494C>T突变与药物性耳聋的关系，目前至少已经发现了三个大的家系是由于1494C>T突变导致的。1555A>G突变和1494CXT突变者在出生时往往听力正常，很难通过听力筛查而被提前发现和预测，却存在因耳毒性药物的使用而发生听力损失的隐患。由于线粒体的异质性特征，不同的个体表现出的线粒体突变的比例不同。大量研究表明，1555A>G和1494CXT突变线粒体所占有的比例高低与病情存在一定的相关性，通常突变线粒体所占比例高的个体表现出重度耳聋，而占比低的则表现出轻度耳聋或正常。但是即使突变占比很低，仍存在药物致聋的危险。因此，一方面需要能够分辨出突变比例的试剂盒来为线粒体聋病相关突变提供更方便的研究手段，另一方面要求这些试剂能够对低突变比例标本有很好的检出能力。
[0004]目前常用的基因检测方法有:直接测序(direct sequencing，DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段长度多态性分析(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturing highperformance liquid chromotography,DHPLC)、基因芯片。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。对于染色体突变的基因分型，一般的荧光定量试剂盒往往需要对同一个标本进行多管检测，才能获得2个以上的分型信息。对于线粒体DNA的突变比例检测，质谱法能检出5%左右的突变，而测序和基因芯片对于突变线粒体的选择能力只能达到20%左右，难以分辨出更低突变比例的标本。
[0005]本发明以上述线粒体12SrDNA1555A>G、1494C>T位点为检测对象，通过上述耳聋易感基因位点的扩增和荧光定量检测，与突变比例标准品的对比，即可筛选出含有上述位点突变的个体，同时确定各种突变的比例。对聋病易感基因的检测，尤其是对新生儿耳聋基因的筛查具有重要意义；首次利用荧光定量PCR检测的方法实现了 1494C>T、1555A>G的突变比例检测的目标，大大节约了人力物力和时间。高灵敏度高特异性同时检测，提供染色体相关突变的分型信息，对于线粒体1555A>G和1494C>T突变的选择能力达到了 0.1%。闭管检测防止了开盖检测操作而产生的污染，为临床诊断和相关领域科研提供可靠方法。
【发明内容】
[0006]本发明目的是提供一种可在I个小时内同时检测聋病易感基因线粒体12SrDNA1555A>G、1494C>T突变，同时报告各种突变的比例的荧光检测试剂盒。
[0007]为了实现上述目的，采取的技术方案:一种聋病易感基因线粒体12SrDNA1555A>G、1494C>T突变比例检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和一系列标准品；
[0008]所述扩增试剂包括:PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增线粒体12SrDNA:1494C>TU555A>G突变的引物混合物，对上述位点进行特异性检测的探针混合物，对人线粒体DNA进行检测的通用探针混合物，内对照及对内对照进行检测的引物探针混合物；
[0009]所述一系列标准品包括:1494C>T突变比例标准品、1555A>G突变比例标准品。标准品的制备方法(以1555A> G突变比例标准品的制备为例):筛选得到1555A>G突变的标本DNA，通过测序、质谱等方法确认其1555G的DNA占全部线粒体DNA的比例为100%，稀释定量至5ng/uL，作为100%突变的标准品①；取正常人标本提取DNA，通过测序、质谱等方法确认其1555位点不存在突变，稀释定量至5ng/uL ;取标准品①和5ng/uL正常人标本提取DNA等比例混合，得到50%突变的标准品②；取标准品②与5ng/uL正常人标本提取DNA按I: 4的比例混合，得到10 %突变的标准品③；取标准品③与5ng/uL正常人标本提取DNA按1: 9的比例混合,得到I %突变的标准品④；取标准品④与5ngAL正常人标本提取DNA按1: 9的比例混合，得到0.1 %突变的标准品⑤。每次取各标准品2uL加入到20uL PCR反应体系中。
[0010]所述用于对线粒体12SrDNA: 1494C>T、1555A>G突变进行特异性检测的探针，对人线粒体DNA进行检测的通用探针，对内对照进行检测的探针被分为四组，分别采用四种不同的发光基团对各组探针的5’端进行标记，3’端的淬灭基团可以为相同或不同的荧光染料。
[0011]所述探针所分为的四组为:用于对内对照进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；线粒体12SrDNA:1494C>T突变进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；1555A>G突变进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；对人线粒体DNA进行检测的通用探针采用同一组发光-淬灭基团。
[0012]所述5’端不同的发光基团所使用的荧光染料可以为:ALEXA Fluor350、FAM、TET、HEX/JOE/VIC、Cy3、TAMRA, ROX, /Texas Red、Cy5 ;3’端相同或不同的淬灭基团所使用的荧光染料可以为:BHQ1、BHQ2、TAMRA, DABCYL?
[0013]使用所述的试剂盒进行PCR复合扩增反应的条件:PCR扩增体系的pH值为
8.0-9.0，镁离子浓度为1.5-3.5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300 iiM，Taq酶的用量为
0.1-0.4U/ii L，引物探针混合物中的引物、探针的终浓度为0.2-0.4 u M0
[0014]使用所述试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在一个复合扩增反应体系中同时扩增12SrDNA: 1494C>T、1555A>G，人线粒体DNA目标序列，内对照目标序列。
[0015]用于GJB2:235delC、299delAT，SLC26A4:2168A>G、IVS7_2A>G，线粒体 12SrDNA:1494C>T、1555A>G检测，人线粒体DNA序列检测的引物为:
[0016]SEQ N0.1:5’ -GTAAGTTGGGTGCTTTGTGTTAAG-3’
[0017]SEQ N0.2:5，-GCCCTGAAGCGCGTACA-3，；
[0018]用于线粒体12SrDNA1555A>G突变检测的探针为:
[0019]SEQ N0.3:5’ -AGTACACTTACCATGTTACGACTTGcCTCCTC-3’
[0020]用于线粒体12SrDNA1494C>T突变检测的探针为:
[0021]SEQ N0.4:5’ -GTGAAGTATACTTGAGGAGaGTGACGGGAC-3’ ；
[0022]用于对人线粒体DNA进行检测的通用探针为:
[0023]SEQ N0.5:5’ -TGCGTAGGGGTTTTAGTTAAATGTCCT-3’
[0024]其中LNA核苷以黑体字表示。
[0025]内对照为一段人工合成的序列装载到PMD18-T的质粒载体上得到，这段人工合成的序列(SEQ N0.6)经过NCBI网站Blast没有找到高相关的同源区。扩增序列及对内对照进行检测的引物探针为:
[0026]SEQ N0.6:CACCAGCATCTCCCTTCATGTTGACTACCGTAGGCTGCCACCATTTCAGAAGAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAGTTGCATGAAGGTAATATACTCGATCCGTAATTCCACTATTGAAATGGGTACATGACTGATACAGACCATC
[0027]SEQ N0.7:5’ -CACCAGCATCTCCCTTCATGT-3’
[0028]SEQ N0.8:5’ -GATGGTCTGTATCAGTCATGTACCCA-3’
[0029]SEQ N0.9:5’ -GAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAG-3’
[0030]所述各位点的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用荧光定量PCR进行实时检测，通过与标准品的同步扩增和分析，得出所测标本的分型信息或突变比例信息。
[0031]其中所检测的人基因组DNA为:使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA ;所述的来源样本为:来源于人类的:滤纸片血斑/ 口腔拭子样本、FTA卡血斑/ 口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液/痕、组织、羊水。
[0032]使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行，扩增程序:94-980C l-5min ；45 个循环的 94-98°C 5-10s, 55-65°C 30_50s。
[0033]使用的带荧光标记并经LNA核苷单体掺入修饰的引物，提高了探针的Tm值，缩短了探针长度，增强了探针对点突变的识别力，从而增加了探针的灵敏度和特异性，防止假阳性和假阴性的出现。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1是本发明的试剂盒对IOngDNA背景下12S rRNA1555A>G突变比例标准品的检测图谱；
[0035]图2是本发明的试剂盒对IOng DNA背景下12S rRNA1494C>T突变比例标准品的检测图谱；
[0036]图3是根据图1、图2数据作出的标准曲线图；
[0037]图4是本发明的试剂盒对正常个体血斑来源DNA(10ng/20uL体系)的检测图谱；
[0038]图5是本发明的试剂盒对12S rRNA1555A>G突变的个体血斑来源DNA(10ng/20uL体系)的检测图谱；
[0039]图6是本发明的试剂盒对12S rRNA1494C>T突变个体血斑来源DNA (2.5ng/20uL体系)的检测图谱。 【具体实施方式】
[0040]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
[0041]实施例1本发明的试剂盒检测突变及正常个体的DNA样本
[0042]用于12S rRNA1494C>T突变检测的探针5’端采用FAM荧光染料标记，用于1555A>G突变检测的探针5’端采用HEX荧光染料标记，用于人线粒体DNA检测的探针5’端采用Cy5荧光染料标记，用于内对照检测的探针5’端采用ROX荧光染料标记。
[0043]1、待测样本1000份，都已经使用“DNA提取-PCR扩增-测序”的技术方法对各位点进行过测序检测。其中，12S rRNA1555A>G突变样本10份，14940T突变样本I份。
[0044]2、检材的基因组DNA提取
[0045]Chelex提取法:剪下I-3mm血斑(标本来自于XX医院检验科)置于1.5mL尚心管中，加入SdH2OlmL,振荡离心，弃上清液，重复步骤两次，弃上清液，将5% Chelex-1OO震荡悬浮后快速用剪掉的枪头吸取200 加入离心管中，振荡数秒，。于56°C水浴保温30min后,振荡数秒。95°C沸水浴IOmin,轻微振荡数秒。2000rpm离心5min,上清中为提取的 DNA。
[0046]3、扩增和扩增产物的检测分析
[0047](I) PCR 扩增体系:
[0048]
【权利要求】
1.聋病易感基因线粒体12SrDNA1555A>G、1494C>T突变比例检测试剂盒，其特征在于包括扩增试剂和一系列标准品；所述扩增试剂包括:PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增线粒体12SrDNA: 1494C>T、1555A>G的引物混合物，对上述位点进行特异性检测的探针混合物，对人线粒体DNA进行检测的通用探针混合物，内对照及对内对照进行检测的引物探针混合物；所述一系列标准品包括:1494C>T突变比例标准品、1555A>G突变比例标准品。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于: 用于线粒体12SrDNA:1494C>T、1555A>G检测，人线粒体DNA序列检测的引物为:
SEQ N0.1:5’ -GTAAGTTGGGTGCTTTGTGTTAAG-3’
SEQ N0.2:5’ -GCCCTGAAGCGCGTACA-3’ ； 用于线粒体12SrDNA1555A>G突变检测的探针为:
SEQ N0.3:5’ -AGTACACTTACCATGTTACGACTTGCCTCCTC-3’ 用于线粒体12SrDNA1494C>T突变检测的探针为:
SEQ N0.4:5’ -GTGAAGTATACTTGAGGAGaGTGACGGGAC-3’ ； 用于对人线粒体DNA进行检测的通用探针为:
SEQ N0.5:5’ -TGCGTAGGGGTTTTAGTTAAATGTCCT-3’ 其中LNA核苷以黑体字表示。`
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述的内对照为一段人工合成的序列装载到PMD18-T的质粒载体上得到，这段人工合成的序列(SEQ N0.6)经过NCBI网站Blast没有找到高相关的同源区。扩增序列及对内对照进行检测的引物探针为:
SEQ N0.6:CACCAGCATCTCCCTTCATGTTGACTACCGTAGGCTGCCACCATTTCAGAAGAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAGTTGCATGAAGGTAATATACTCGATCCGTAATTCCACTATTGAAATGGGTACATGACTGATACAGACCATC
SEQ N0.7:5’ -CACCAGCATCTCCCTTCATGT-3’
SEQ N0.8:5’ -GATGGTCTGTATCAGTCATGTACCCA-3’
SEQ N0.9:5’ -GAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAG-3，
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述的用于线粒体12SrDNA:1494C>T、1555A>G突变检测的探针，对人线粒体DNA进行检测的通用探针，内对照探针，每条探针的5’端和3’端均进行荧光染料标记，5’端为发光基团和3’端为淬灭基团。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述用于对线粒体12SrDNA:1494C>T、1555A>G突变进行特异性检测的探针，对人线粒体DNA进行检测的通用探针，内对照探针分为四组，分别采用四种不同的发光基团对各组探针的5’端进行标记，3’端的淬灭基团可以为相同或不同的荧光染料。
6.根据权利4要求所述的试剂盒，其特征在于:探针所分为的四组为:用于对内对照进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；线粒体12SrDNA:1494C>T突变进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；1555A>G突变进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；对人线粒体DNA进行检测的通用探针采用同一组发光-淬灭基团。
7.根据权利4要求所述的试剂盒，其特征在于:5’端不同的发光基团所使用的荧光染料可以为:ALEXA Fluor350、FAM、TET、HEX/J0E/VIC、Cy3、TAMRA、R0X、/Texas Red、Cy5;3，端相同或不同的淬灭基团所使用的荧光染料可以为:BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL。
8.根据权利I要求所述的试剂盒，其特征在于:包括一系列标准品:1494C>T突变比例标准品、1555A>G突变比例标准品。
9.根据权利I或7要求所述的试剂盒，其特征在于:1494C>T突变比例标准品为:7管10ng/uL的人DNA标本，各管的1494CXT突变比例为100 % ,50 % ,20 % UO % ,5 % U % >0.5%，其制备方法为将10ng/uL100% 1494C>T突变的DNA标本按一定比例掺入10ng/uL未含有1494C>T突变的DNA标本中。
10.根据权利I或7要求所述的试剂盒，其特征在于:1555A>G突变比例标准品为:7管10ng/uL的人DNA标本，各管的1555A>G突变比例为100% ,50 % ,20% UO % ,5% U % >0.5%，其制备方法为将10ng/uL100% 1555A>G突变的DNA标本按一定比例掺入10ng/uL未含有1555A>G突变的DNA标本中。
11.权利要求1所述试剂盒应用于聋病易感基因的检测，其特征在于通过荧光定量PCR特异性检测聋病易感基因线粒体12SrDNA:1494C>TU555A>G ;用于12S rRNA1555A>G突变检测的引物探针为:SEQ N0.1、SEQ N0.2、SEQ N0.3 ;用于12S rRNA1494C>T突变检测的引物探针为:SEQ N0.USEQ N0.2,SEQ N0.4 ;用于对人线粒体DNA检测的引物探针为=SEQ N0.1、SEQ N0.2,SEQ N0.5 ;用于对内对照检测的引物探针为:SEQ N0.5,SEQ N0.6,SEQ N0.6。所述各位点的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用荧光定量PCR进行实时检测，通过与标准品的同步扩增和分 析，得出所测标本的突变比例信息。
【文档编号】C12Q1/68GK103451302SQ201310410840
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】步迅, 夏子芳, 张全芳, 刘艳艳 申请人:步迅, 夏子芳