聋病易感基因GJB2 235delC、299delAT突变检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了聋病易感基因GJB2?235delC、299delAT突变检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和一系列标准品；所述扩增试剂包括：PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增GJB2：235delC、299delAT；所述一系列标准品包括：235delC分型标准品、299delAT分型标准品。本发明以上述2个聋病易感基因位点为检测对象，通过上述耳聋易感基因位点的扩增和荧光定量检测，与基因分型标准品的对比，即可筛选出含有上述位点突变的个体，同时确定基因型。对聋病易感基因的检测，尤其是对新生儿耳聋基因的筛查具有重要意义。
【专利说明】聋病易感基因GJB2235delC、299delAT突变检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及聋病易感基因GJB2235delC、299delAT突变检测试剂盒，属于生物检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]世界范围内对听力语言残疾者进行的致病因素研究表明，约60-80%患者的病因与遗传因素有关，其中发达国家的临床研究数据表明，遗传性耳聋在耳聋患者中约占80%。因此近十几年来，遗传性耳聋的发病机制及其分子流行病学的研究成为了聋病研究最重要的内容之一。随着人类基因组计划完成，聋病基因的定位和克隆取得了巨大的进步，聋病的分子遗传学研究和分子流行病学的数据使研究者们逐步认识到聋病易感基因突变在维护听力健康和发现听力异常中的重要性。
[0003]在目前已经定位和克隆的耳聋相关基因中，GJB2是最常见的易感基因，在先天性重度耳聋患者中约占30-50%。目前，在该基因已经发现了 100多种突变类型，在中国常见的突变形式为235delC，其在所有致病性突变中约占74.14%，约22.2%的中国耳聋患者与该突变有关。另外GJB2299_300delAT的突变等位基因频率约为3%。
[0004]目前常用的基因检测方法有:直接测序(direct sequencing, DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段长度多态性分析(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturing highperformance liquid chromotography,DHPLC)、基因芯片。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。对于染色体突变的基因分型，一般的荧光定量试剂盒往往需要对同一个标本进行多管检测，才能获得2个以上的分型信息。
[0005]本发明以上述2个聋病易感基因位点为检测对象，通过上述耳聋易感基因位点的扩增和荧光定量检测，与基因分型标准品的对比，即可筛选出含有上述位点突变的个体，同时确定基因型。对聋病易感基因的检测，尤其是对新生儿耳聋基因的筛查具有重要意义；首次利用四通道/四色染料-荧光定量PCR检测的方法实现了 2位点分型检测的目标，并含有内对照以监控检测过程。闭管检测防止了开盖检测操作而产生的污染，为临床诊断和相关领域科研提供可靠方法。
【发明内容】
[0006]本发明目的是提供一种可在I个小时内同时检测聋病易感基因GJB2 235delC、299delAT突变，区分基因型并含有内对照以监控检测过程。
[0007]为了实现上述目的，采取的技术方案:一种聋病易感基因GJB2 235delC、299delAT突变检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和一系列标准品；
[0008]所述扩增试剂包括:PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增GJB2:235delC、299delAT的引物混合物，对上述位点进行特异性检测的探针混合物，对人基因组DNA进行检测的通用探针混合物，内对照及对内对照进行检测的引物探针混合物；
[0009]所述一系列标准品包括:235delC分型标准品(10ng/uL的235delC杂合型突变DNA标本I管)、299delAT分型标准品(10ng/uL的299delAT杂合型突变DNA标本I管)。
[0010]所述用于对GJB2:235delC、299delAT突变进行特异性检测的探针，对人基因组DNA进行检测的通用探针，对内对照进行检测的探针被分为四组，分别采用四种不同的发光基团对各组探针的5’端进行标记，3’端的淬灭基团可以为相同或不同的荧光染料。
[0011]所述探针所分为的四组为:用于对GJB2:299delAT突变进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；用于对235delC突变进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；对人基因组DNA进行检测的通用探针采用同一组发光-淬灭基团；用于对内对照进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团。
[0012]所述5’端不同的发光基团所使用的荧光染料可以为:ALEXAFluor350、FAM、TET、HEX/JOE/VIC、Cy3,TAMRA,RO X、/TexasRed,Cy5 ;3’端相同或不同的淬灭基团所使用的荧光染料可以为:BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL。
[0013]使用所述的试剂盒进行PCR复合扩增反应的条件:PCR扩增体系的pH值为
8.0-9.0，镁离子浓度为1.5-3.5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300μΜ，Taq酶的用量为
0.1-0.4U/μ L，引物探针混合物中的引物、探针的终浓度为0.2-0.4 μ M0
[0014]使用所述试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在一个复合扩增反应体系中同时扩增GJB2:235delC、299delAT，人基因组DNA目标序列，内对照目标序列。
[0015]用于GJB2:235delC、299delAT 检测的引物为:
[0016]SEQ N0.1:5’ -ACGTGTGCTACGATCACTACTTCC-3’ ；
[0017]SEQ N0.2:5’ -CTCCTCGATGTCCTTAAATTCACTC-3’ ；
[0018]用于GJB2:299delAT突变检测的探针为:
[0019]SEQ N0.5:5’ -CCTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCGTC T CS'；
[0020]用于GJB2:235delC突变检测的探针为:
[0021 ] SEQ N0.6:5 ’ -ACATCCGGCTATGGGCCT G C-3，
[0022]用于对人基因组DNA进行检测的通用探针为:
[0023]SEQ N0.7:5，-ACGCCAGCGCTCCTAGTGGC-3，；
[0024]其中LNA核苷以黑体字表示。
[0025]3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述的内对照为一段人工合成的序列装载到PMD18-T的质粒载体上得到，这段人工合成的序列(SEQ N0.4)经过NCBI网站Blast没有找到高相关的同源区。扩增序列及对内对照进行检测的引物探针为:
[0026]SEQ N0.8:CACCAGCATCTCCCTTCATGTTGACTACCGTAGGCTGCCACCATTTCAGAAGAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAGTTGCATGAAGGTAATATACTCGATCCGTAATTCCACTATTGAAATGGGTACATGACTGATACAGACCATC
[0027]SEQ N0.9:5’ -CACCAGCATCTCCCTTCATGT-3’
[0028]SEQ N0.10:5’ -GATGGTCTGTATCAGTCATGTACCCA-3’
[0029]SEQ N0.11:5，-GAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAG-3’
[0030]所述各位点的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用荧光定量PCR进行实时检测，通过与标准品的同步扩增和分析，得出所测标本的分型信息或突变比例信息。
[0031]其中所检测的人基因组DNA为:使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA ;所述的来源样本为:来源于人类的:滤纸片血斑/ 口腔拭子样本、FTA卡血斑/ 口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液/痕、组织、羊水。
[0032]使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行，扩增程序:94-980C l-5min ；45 个循环的 94-98°C 5-10s, 55-65°C 30_50s。
[0033]使用的带荧光标记并经LNA核苷单体掺入修饰的引物，提高了探针的Tm值，缩短了探针长度，增强了探针对点突变的识别力，从而增加了探针的灵敏度和特异性，防止假阳性和假阴性的出现。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1是本发明的试剂盒对GJB2:235delC分型标准品(IOng DNA背景下235杂合突变型DNA)不同稀释梯度情况下的检测图谱；
[0035]图2是本发明的试剂盒对GJB2:299delAT分型标准品(IOng DNA背景下299杂合突变型DNA)不同稀释梯度情况下的检测图谱；
[0036]图3是根据图1、图2数据作出的标准曲线图；
[0037]图4是本发明的试剂盒对正常个体血斑来源DNA (0.5ng/20uL体系)的检测图谱；
[0038]图5是本发明的试剂盒对GJB2:235delC突变的个体血斑来源DNA (0.5ng/20uL体系)的检测图谱；
[0039]图6是本发明的试剂盒对GJB2:299delAT突变个体血斑来源DNA (lng/20uL体系)的检测图谱。
【具体实施方式】
[0040]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
[0041]实施例1本发明的试剂盒检测突变及正常个体的DNA样本
[0042]用于GJB2:235delC突变检测的探针5’端采用FAM荧光染料标记，用于GJB2:299delAT突变检测的探针5’端采用HEX荧光染料标记，用于人线粒体DNA检测的探针5’端采用Cy5荧光染料标记，用于内对照检测的探针5’端采用ROX荧光染料标记。
[0043]1、待测样本1000份，都已经使用“DNA提取-PCR扩增-测序”的技术方法对各位点进行过测序检测。其中，GJB2:235delC突变样本I份，GJB2:299delAT突变样本4份。
[0044]2、检材的基因组DNA提取
[0045]Chelex提取法:剪下I-3mm血斑(标本来自于XX医院检验科)置于1.5mL离心管中，加入SdH2OlmL,振荡离心，弃上清液，重复步骤两次，弃上清液，将5% Chelex-1OO震荡悬浮后快速用剪掉的枪头吸取200 μ L加入离心管中，振荡数秒，。于56°C水浴保温30min后，振荡数秒。95°C沸水浴lOmin，轻微振荡数秒。2000rpm离心5min，上清中为提取的DNA。
[0046]3、扩增和扩增产物的检测分析
[0047](I) PCR 扩增体系:
【权利要求】
1.聋病易感基因GJB2235delC、299delAT突变检测试剂盒，其特征在于包括扩增试剂和一系列标准品；所述扩增试剂包括:PCR缓冲液、1%(:12和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增GJB2:235delC、299delAT引物混合物，对上述位点进行特异性检测的探针混合物，对人基因组DNA进行检测的通用探针混合物，内对照及对内对照进行检测的引物探针混合物；所述一系列标准品包括:235delC分型标准品、299delAT分型标准品。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于: 用于GJB2:235delC、299delAT检测的引物为:
SEQ N0.1:5’ -ACGTGTGCTACGATCACTACTTCC-3’ ；
SEQ N0.2:5’ -CTCCTCGATGTCCTTAAATTCACTC-3’ ； 用于GJB2:299delAT突变检测的探针为:
SEQ N0.5:5’ -CCTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCGTC 71C-3’ ； 用于GJB2:235delC突变检测的探针为:
SEQ N0.6:5’ -ACATCCGGCTATGGGCCT C?C_3’ 用于对人基因组DNA进行检测的通用探针为:
SEQ N0.7:5’ -ACGCCAGCGCTCCTAGTGGC-3’ ； 其中LNA核苷以黑体字表示。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述的内对照为一段人工合成的序列装载到PMD18-T的质粒载体上得到，这段人工合成的序列(SEQ N0.4)经过NCBI网站Blast没有找到高相关的同源区。扩增序列及对内对照进行检测的引物探针为:
SEQ N0.8:CACCAGCATCTCCCTTCATGTTGACTACCGTAGGCTGCCACCATTTCAGAAGAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAGTTGCATGAAGGTAATATACTCGATCCGTAATTCCACTATTGAAATGGGTACATGACTGATACAGACCATC
SEQ N0.9:5’ -CACCAGCATCTCCCTTCATGT-3’
SEQ N0.10:5’ -GATGGTCTGTATCAGTCATGTACCCA-3’
SEQ N0.11:5’ -GAACGATGACCCCTTGCTAGCAGTGGAAGAG-3’
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述的用于GJB2:235delC、299delAT突变检测的探针，对人基因组DNA进行检测的通用探针，内对照探针，每条探针的5’端和3’端均进行荧光染料标记，5’端为发光基团和3’端为淬灭基团。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述用于对GJB2:235delC、299delAT突变进行特异性检测的探针，对人基因组DNA进行检测的通用探针被分为四组，分别采用四种不同的发光基团对各组探针的5’端进行标记，3’端的淬灭基团可以为相同或不同的荧光染料。
6.根据权利4要求所述的试剂盒，其特征在于:探针所分为的四组为:用于对GJB2:299delAT突变进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；用于对235delC突变进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团；对人基因组DNA进行检测的通用探针采用同一组发光-淬灭基团；用于对内对照进行特异性检测的探针采用同一组发光-淬灭基团。
7.根据权利4要求所述的试剂盒，其特征在于:5’端不同的发光基团所使用的荧光染料可以为:ALEXAFluor350、FAM、TET、HEX/JOE/VIC、Cy3, TAMRA, ROX、/Texas Red、Cy5 ;3’端相同或不同的淬灭基团所使用的荧光染料可以为:BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL。
8.根据权利I要求所述的试剂盒，其特征在于:包括一系列标准品:235delC分型标准品(10ng/uL的235delC杂合型突变DNA标本I管)、299delAT分型标准品(10ng/uL的299delAT杂合型突变DNA标本I管)。
9.权利要求1所述试剂盒应用于聋病易感基因的检测，其特征在于通过荧光定量PCR特异性检测聋病易感基因GJB2:235delC、299delAT ;用于299delAT检测的引物探针为:SEQ N0.USEQ N0.2,SEQ N0.5 ;用于 GJB2:235delC 突变检测的引物探针为:SEQ N0.3,SEQN0.4、SEQ N0.6 ;用于对人基因组DNA检测的引物探针为:SEQ N0.3、SEQ N0.4、SEQ N0.7 ；用于对内对照检测的引物探针为:SEQ N0.9,SEQ N0.10,SEQ N0.11。所述各位点的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用荧光定量PCR进行实时检测，通过与标准品的同步扩增和分析，得 出所测标本的分型信息或突变比例信息。
【文档编号】C12Q1/68GK103451300SQ201310410783
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】步迅, 夏子芳, 刘艳艳, 张全芳 申请人:步迅, 夏子芳