香菇C91-3菌株的Latcripin-13基因片段、编码蛋白及制备方法
【专利摘要】本发明公开一种香菇C91-3菌株的Latcripin-13基因片段、编码蛋白及制备方法，Latcripin-13基因片段，具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；编码蛋白具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。Latcripin-13基因片段的制备方法按如下步骤进行：提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；PCR扩增目标基因：以所得到的cDNA为模板、以具有BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；回收纯化DNA片段。
【专利说明】香薛C91-3菌株的Aaicr/>//7-/.?基因片段、编码蛋白及制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种从香菇C91-3菌株中提取的LaJ基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白属于RCCl蛋白家族并含有PHD结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。
【背景技术】
[0002]真菌富含多种生物活性分子，包括核糖体失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素样蛋白、多糖和激酶。其中的抗肿瘤成分以不良反应少、疗效显著等优点在肿瘤治疗方面具有独到之处。香菇菌C91-3属真菌为担子菌亚门担子菌纲侧耳科，该菌种已于2013年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.7354。香菇菌C91-3含有健脾益气，扶正祛邪，增强机体免疫力，防治癌症等功效。[Zhao C，Sun H，Tong X，etal.An Antitumor lectin from edible Mushroom Agrocybe aegerita[J].Biochem J,
2003,374:321— 327]。香菇菌C91-3发酵液中含有多种蛋白成分，通过动物体内实验证实有些蛋白成分具有较好的抗肿瘤作用[黄敏，宁安红，张卓然等.香菇C91-3菌丝发酵液小鼠体内抗肿瘤作用的研究[J].中国微生态学杂志，1996，8 (3):38-40]。体外实验也证实，其发酵液中的一些蛋白组分具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力[戴兵，黄敏，宁安红.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白抑制小鼠宫颈癌细胞株U14生长及诱导凋亡的实验研究.浙江医学，2004，26 (9) ；656 -658]。但是，迄今为止还没有关于从香菇C91-3菌中提取可诱导肿瘤细胞凋亡的基因片段、编码蛋白及制备方法等相关报道。
【发明内容】
`[0003]本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种从香菇C91-3菌株中提取的基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白属于RCCl蛋白家族并含有PHD结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功倉泛。
[0004]本发明的技术解决方案是一种香菇C91-3菌株的基因片段，其特征在于如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0005]一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-13基因片段编码蛋白，其特征在于如SEQID NO: 2所示的氨基酸序列。
[0006]一种上述香菇C91-3菌株的基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行:
a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；
b.将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；
c.PCR扩增目标基因:
以所得到的cDNA为模板、以具有BamH I和Xho I两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下:
上游引物BamH I:
5’-GGCTGATATCGGATCCGATGGAAACGCGTGGATTT-3’
下游引物Xho I:
5’-GTGGTGGTGCTCGAGGTCTTTCACGCAGCTTGGAC-3’
d.回收纯化DNA片段:
将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化1323bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。
[0007]所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min,样品融化后继续研磨至裂解液透明状,室温静置5min后，12000r/min离心5min,将上清转移至另一离心管中，然后加入1/5体积氯仿,温和振荡后，4°C，12000 r/min离心，15 min ;吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置15 min,再次4°C, 12000 r/min离心，10 min,弃上清,然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。
[0008]所述c步骤的PCR反应体系50 μ?: cDNA模板I μ?，上游引物0.5 μ?，下游引物 0.5 μ?, dNTP Mixture (各 2.5 mM) 4 μ1、5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus) 10 μ?、PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μΙ) 0.5 μ?、灭菌蒸馏水 33.5 μ? ;反应条件:98°C变性 10 s，55°C复性 10 s，72°C延伸 I min, 30 个循环；72°C延伸 5 min ;4°C冷却 10 min。
[0009]本发明是从香菇C91-3菌丝体转录组中，克隆出一段特异性基因片段，命名为
基因片段，该基因片段所编码的蛋白属于RCCl蛋白家族并含有PHD结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。可将该基因片段进行基因重组，并于PET-32a原核表达体系中进行高效表达，将表达产物通过亲和层析进行分离和提纯，获得该基因编码的蛋白质，该蛋白可用于研究细胞凋亡中的机制及其在细胞信号通路中的作用，也可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是本发明实施例PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图。
[0011]图2是本发明实施例所用载体pET_32a (+)双酶切后的电泳图。
[0012]图3是本发明实施例提取的基因片段转化后的单克隆阳性菌落。
[0013]图4是本发明实施例重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。
[0014]图5是本发明实施例诱导表达蛋白的Western-blot电泳图。
[0015]图6是本发明实施例纯化后的目标蛋白SDS-PAGE电泳图。
[0016]图7是本发明实施例纯化后的目标蛋白对A549细胞的生长抑制率不意图。
[0017]香菇C91-3菌株保藏日期:2013年3月15日；
分类命名?.考货 iLentinula edodes)；
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号 保藏号:CGMCC N0.7354。【具体实施方式】
[0018]a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA:
取用培养基培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，，加入Iml的Trizol后室温静置30min,样品融化后继续研磨至裂解液透明状,室温静置5min后，12000r/min离心5min,将上清转移至另一离心管中，然后加入然后加入0.2 ml氯仿,温和振荡后，4°C，12000 r/min离心，15 min ;吸取上层水相溶液0.5 ml并转移至另一干净的1.5 ml离心管,加入等体积异丙醇,颠倒混匀后室温静置15 min,再次4°C, 12000 r/min离心，10 min,弃上清，然后加入75%乙醇I ml洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA ；
紫外分光光度计验证纯度，0D260/280比值在1.8^2.0之间。
[0019]进行1%琼脂糖凝胶电泳验证，表明RNA提取纯度较高。
[0020]b.将菌丝体总RNA反转录合成cDNA ；
使用TaKaRa 3' -Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒反转录合成cDNA，本试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。
[0021]反应体系:香菇菌丝体总RNA (?μδ/μ1) I μ1、3’ RACE Adaptor (5 μΜ) I μ?、dNTP Mixture (10 mM each) I M-1 > RNase Free dH20 4.5 M-1 ；
反应条件:70°C，10 min立即冰上放置2分钟；
然后加入下列组分:5X M-MLV Buffer 2μ1、RNase Inhibitor (40 U/μΙ) 0.25 μ?、Reverse Transcriptase M-MLV (无RNA酶)(200 U/M-l) 0.25 Ml,体系总体积达到 10 M-10
[0022]反应条件:42°C,60 min 70。。，15 min得到反转录反应液(cDNA)。
[0023]c.PCR扩增目标基因:
以所得到的cDNA为模板、以具有BamH I和Xho I两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下:
上游引物BamH I:
5’-GGCTGATATCGGATCCGATGGAAACGCGTGGATTT-3’
下游引物Xho I:
5’-GTGGTGGTGCTCGAGGTCTTTCACGCAGCTTGGAC-3’
引物委托宝生物(大连)公司合成。
[0024]PCR反应体系50 μ?: cDNA模板I μ?，上游引物0.5 μ?，下游引物0.5 μ?，dNTPMixture (各 2.5 mM) 4 μ1、5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus) 10 μ?、PrimeSTAR HS DNAPolymerase (2.5 υ/μ1)0.5 Ml、灭菌蒸懼水 33.5 μ? ;反应条件:98°C变性 10 s,55°C复性10 s，72°C延伸 I min，30 个循环；72°C延伸 5 min ;4°C冷却 10 min。
[0025]PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳如图1所示，图1中M: DL2, 000 DNA Marker ；1:Latcripin-13目的克隆片段产物，证明成功获得了该基因片段。
[0026]d.回收纯化DNA片段:
将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化1323bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段，命名为Latcripin-13基因片段。
[0027]实验:
基因片段序列测定:测序由大连宝生物公司测定，香菇C91-3 Latcripin-13基因片段核苷酸序列如SEQID N0.1。Latcripin-13的基因片段序列长为1323bp的cDNA，其含有441个密码子可读框(ORF)0经使用NCBI数据库核苷酸相似性检索表明，无任何相似性的基因片段序列，证明此基因为一新型基因片段。
[0028]2.Latcripin-Yi基因片段的克隆表达 2.1载体构建
2.1.1将质粒pET-32a (+)，使用BamH I /Xho I进行酶切；
反 取5μ1进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，M: λ -Hind III digest ；1:pET-32a ( +) -plasmid ；2: pET_32a ( +) -BamH I / Xho I ;表明质粒切割完全，可进行
后续实验。
[0029]2.1.2载体回收
使用 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0 切胶回收约 5.9kbp的DNA片段。
[0030]2.1.3将pET-32a ( +)载体与本发明实施例的Latcripin-13基因片段进行重组 使用In-Fusion? HD Cloning Kit,分别将本发明实施例的基因片段与
酶切后回收载体连接，反应体系及条件如下:
基因片段(100 ng/M-1) 2 M-1 酶切后回收载体(50 ng/μ?)?μ?
5xIn_Fusion HD Enzyme Premix 2M-1 dH20Upto ΙΟμΙ
50 °C 15 min
取上述In-Fusion产物2.5 μ?热转化至疋co7i Rosetta-gami (DE3)中，涂布于含四种抗生素(羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素)的LB平板上，37 V过夜培养。培养结果如图3所示，表明重组载体成功转化到宿主菌中，并获得阳性菌落。
[0031]同时，选取平板上生长的单克隆阳性菌落接种于含四种抗生素(羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素)的LB液体培养基于37 V培养14小时，采用宝生物公司PlasmidMiniprep Kit V3.1抽提质粒进行测序鉴定，结果如SEQ ID N0.1。
[0032]2.2Latcripin-13蛋白的诱导表达及鉴定 2.2.1 Latcripin-13蛋白的自诱导表达
挑取2.1.3的单克隆阳性菌落，接种于IOml含四种抗生素(羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素)的LB液体培养基中，于37 °C下，120 r/min振荡培养过夜，再接种于100 ml含四种抗生素(羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素)的自诱导培养基中，于37 V下，120 r/min振荡培养4小时。取菌液进行反复冻融破碎(4次)，低温(4°C )离心5000 r/min, 5 min，取上清，加入50 μ I PBS。将上清按蛋白样品处理方法处理后，做12%SDS_PAGE电泳图如图4所示，表明重组蛋白在阳性菌株中成功表达。
[0033]2.2.2 目标蛋白 Western-blotting 鉴定分析
将SDS-PAGE电泳分离样品后，将PAGE胶用湿转膜的方式转印到NC膜上，经5%脱脂牛奶室温封闭液封闭 120 分钟后，第一抗 Mouse Ant1-His Tag Monoclonal Antibody, 4°C孵育过夜。再加入第二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L)室温孵育60分钟，显色试剂盒显色如图5所示，证明诱导表达的重组蛋白确实为目的蛋白。
[0034]2.3 Latcripin-13蛋白的纯化及活性鉴定 2.3.1.Latcripin-13 蛋白的纯化
将上述条件诱导的菌体低温5000 r/min, 10 min^20 min离心,每50~100 mg菌体(湿重)加入-2 ml细菌裂解液。10000Xg，4°C离心15~20分钟，分离上清和沉淀，并收集沉淀(包涵体)。将沉淀重悬于Binding Buffer中。10，000Xg离心20分钟，收集上清。将上清负载上柱，利用HIS标签的亲和层析进行蛋白的纯化，使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。得到单一的目的蛋白，12%SDS-PAGE电泳验证如图6所示。图6中，1:标准蛋白，2:过柱前蛋白，3:流穿液，4-8分别为体积I ml的洗脱液，结果表明，在2 ml和3 ml洗脱液中成功分离得到目的蛋白。
[0035]采用现有方法对纯化浓缩的目标蛋白进行测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。该新型特异蛋白(Latcripin-13蛋白，简称Lp_13),经NCBI数据库氨基酸相似性检索和Pfam数据库检索分析,结果表明Latcripin-13蛋白具有RCCl和PHD结构域,该结构域具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等多种生物学功能。
[0036]2.3.2.Latcr ipin-13蛋白的除盐和复性
将纯化后的Latcripin-13蛋白进行梯度透析,将Latcripin-13蛋白装入MW16000的透析袋中，两端用透析袋夹夹紧。将透析袋放入0.5 Li L的透析复性液中，冰浴，搅拌透析，24 h"72 h，每6~8 h换液一次复性，逐步降低尿素浓度直至O。将透析袋中的溶液离心10000印111，4°(:离心,20~30 min上清即为复性的重组蛋白。
[0037]2.3.3Latcripin-13 蛋白的活性鉴定(MTT 法)
将纯化浓缩的目的蛋白进行微量BCA蛋白定量后，用MTT法检测细胞存活和生长情况。将目的蛋白分别稀释至浓度 6.25 Pg/ml、12.5 Pg/ml、25 Pg/ml、50 Pg/ml、100 Pg/ml 备用，以PBS作为空白对照。评价其对肿瘤细胞的细胞毒作用。选用人肺癌A549细胞进行MTT实验。用0.25%并含有EDTA的胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5 X 104/ml。每孔加入100 μ?，边缘孔用无菌PBS填充，5%C02，37°C孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)加入上述药物每孔100 μ?，每个浓度设6个复孔，5%C02，37°C孵育24小时，48小时。并倒置显微镜下观察。然后每孔加入20 μ? MTT溶液(5mg/ml，即0.5%ΜΤΤ)，继续培养4 h。终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150 μ? 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min。在酶联免疫检测仪562 nm处测量各孔的吸光值，参考波长630 nm，按照下面公式计算抑瘤率(细胞生长抑制率)=(对照组平均OD值一实验组平均OD值)/对照组平均OD值。目标蛋白在蛋白浓度为6.25 Pg/ml、12.5 Pg/ml、25 Pg/ml、50Pg/ml、100 Pg/ml时，24 h、48 h的抑瘤率如图7所示，说明本发明基因表达的蛋白对人肺癌A549细胞株有明显地抑制作用。
【权利要求】
1.一种香菇C91-3菌株的L3icri/7i/?-7J基因片段，其特征在于如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.一种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的基因片段编码蛋白，其特征在于如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3.—种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行: a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA； b.将菌丝体总RNA反转录合成cDNA； c.PCR扩增目标基因: 以所得到的cDNA为模板、以具有BamH I和Xho I两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下: 上游引物BamH I:
5’-GGCTGATATCGGATCCGATGGAAACGCGTGGATTT-3’ 下游引物Xho I:
5’-GTGGTGGTGCTCGAGGTCTTTCACGCAGCTTGGAC-3’ d.回收纯化DNA片段:. 将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化1323bpMarker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。
4.根据权利要求3所述香菇C91-3菌株的基因片段的制备方法，其特征在于所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min,样品融化后继续研磨至裂解液透明状,室温静置5min后，12000r/min离心5min,将上清转移至另一离心管中，然后加入1/5体积氯仿,温和振荡后，4°C, 12000 r/min离心，15 min ;吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置15 min，再次4°C，12000 r/min离心，10 min，弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。
5.根据权利要求4所述香菇C91-3菌株的基因片段的制备方法，其特征在于所述c步骤的PCR反应体系50 μ?: cDNA模板I μ?，上游引物0.5 μ?，下游引物0.5M-1, dNTP Mixture 4 M-1>5 XPrimeSTAR Buffer 10 M-l>PrimeSTAR HS DNA PolymeraseC2.5υ/μ1)0.5 μ?、灭菌蒸馏水33.5 μ? ;反应条件:98°C变性10 s，55°C复性10 s，72°C延伸Imin, 30 个循环；72°C延伸 5 min ;4°C冷却 10 min。
【文档编号】C12N15/10GK103484476SQ201310410754
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】黄敏, 王佳, 钟民涛, 伦永志, 张伟, 刘奔, 李星云, 王晓丽, 曹婧, 宁安红 申请人:大连医科大学