香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段、编码蛋白及制备方法
【专利摘要】本发明公开一种香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段、编码蛋白及制备方法，Latcripin-16基因片段，具有如SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列；编码蛋白具有如SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。Latcripin-16基因片段的制备方法按如下步骤进行：提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；PCR扩增目标基因：以所得到的cDNA为模板、以具有EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；回收纯化DNA片段。
【专利说明】香薛C91-3菌株的Lateripin-16基因片段、编码蛋白及制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种从香菇C91-3菌株中提取的La基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有核糖核酸内切酶L-PSP结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。
【背景技术】[0002]真菌富含多种生物活性分子，包括核糖体失活蛋白、抗真菌蛋白、凝集素、泛素样蛋白、多糖和激酶。其中的抗肿瘤成分以不良反应少、疗效显著等优点在肿瘤治疗方面具有独到之处。香菇菌C91-3属真菌，为担子菌亚门担子菌纲侧耳科，该菌种已于2013年保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.7354。香菇菌C91-3含有健脾益气，扶正祛邪，增强机体免疫力，防治癌症等功效。[Zhao C，Sun H，Tong X，etal.An Antitumor lectin from edible Mushroom Agrocybe aegerita[J].Biochem J,2003,374:321-327]。香菇菌C91-3发酵液中含有多种蛋白成分，通过动物体内实验证实有些蛋白成分具有较好的抗肿瘤作用[黄敏，宁安红，张卓然等.香菇C91-3菌丝发酵液小鼠体内抗肿瘤作用的研究[J].中国微生态学杂志，1996，8 (3):38-160]。体外实验也证实，其发酵液中的一些蛋白组分具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力[戴兵，黄敏，宁安红.香菇C91-3菌丝发酵液蛋白抑制小鼠宫颈癌细胞株U14生长及诱导凋亡的实验研究.浙江医学，2004，26 (9) ；656 -658]。但是，迄今为止还没有关于从香菇C91-3菌中提取可诱导肿瘤细胞凋亡和调节细胞周期的基因片段、编码蛋白及制备方法等相关报道。
【发明内容】
[0003]本发明是为了解决现有技术所存在的上述问题，提供一种从香菇C91-3菌株中提取的Latcripin-16基因片段、编码蛋白及制备方法，所编码的蛋白具有核糖核酸内切酶L-PSP结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。
[0004]本发明的技术解决方案是一种香菇C91-3菌株的基因片段，其特征在于如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0005]一种上述香菇C91-3菌株的Latcripin-16基因片段编码蛋白，其特征在于如SEQID NO: 2所示的氨基酸序列。
[0006]—种上述香燕C91-3菌株的基因片段的制备方法,其特征在于依次按如下步骤进行:
a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA；
b.将菌丝体总RNA反转录合成cDNA；
c.PCR扩增目标基因:
以所得到的cDNA为模板、以具有EcoR I和Xho I两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下:上游引物EcoR 1:
5’- GCGAATTCACCAACAATGCATCCGGTG _3’
下游引物Xho 1:
5’- GCTCGAGATTACAAGAGCGCTCAGTA _3’
d.回收纯化DNA片段:
将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化231bp Marker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。
[0007]所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min,样品融化后继续研磨至裂解液透明状,室温静置5min后，12000r/min离心5min,将上清转移至新的离心管中，然后加入1/5体积氯仿,温和振荡后，4 C，12000r/min离心，15min ;吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静止15min,再次4 C, 12000r/min离心，IOmin,弃上清,然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。
[0008]所述c步骤的PCR反应体系50 μL: cDNA模板?μL，上游引物0.5μ1，下游引物0.δμΙ,?ΝΤΡ Mixture(各2.5 mM)4 μL,5XPrimeSTAR BuffeKMg2+ plus) 10 μL,PrimeSTARHS DNA PolymeraseC2.5 υ/μ1)0.5 μL、灭菌蒸馏水 33.5μ1 ;反应条件:98°C变性 10s，56。。复性 10s，72。。延伸 lmin, 30 个循环；72°C延伸 5min ;4°C冷却 IOmin0
[0009]本发明是从香菇C91-3菌丝体转录组中，克隆出一段特异性基因片段，命名为
基因片段，该基因片段所编码的蛋白具有核糖核酸内切酶L-PSP结构域，具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等功能。可将该基因片段进行基因重组，并于PET-32a原核表达体系中进行高效的表达，将表达产物通过亲和层析进行分离和提纯，获得该基因编码的蛋白质，该蛋白可用于研究细胞凋亡中的机制及其在细胞信号通路中的作用，也可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是本发明实施例PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图。
[0011]图2是本发明实施例pET_32a (+)重组基因片段的表达质粒测序结果图。
[0012]图3是本发明实施例重组表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。
[0013]图4是本发明实施例诱导表达蛋白的Western-blot电泳图。
[0014]图5是本发明实施例纯化后的目标蛋白SDS-PAGE电泳图。
[0015]图6是本发明实施例纯化后的目标蛋白对A549细胞的生长抑制率示意图。
[0016]香菇C91-3菌株保藏日期:2013年3月15日；
分类命名?.考货 iLentinula edodes)；
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号 保藏号:CGMCC N0.7354。
【具体实施方式】[0017]a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA:
取用培养基培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨,加入Iml的Trizol后室温静置30min,样品融化后继续研磨至裂解液透明状,室温静置5min后，12000r/min离心5min,将上清转移至新的离心管中，然后加入0.2ml氯仿,温和振荡后，4°C, 12000rpm离心，15min ;吸取上层水相溶液0.5ml并转移至另一干净的1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静止15min,再次4°C, 12000rpm离心，IOmin,弃上清，然后加入75%乙醇Iml洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA ；
紫外分光光度计验证纯度，0D260/280比值在1.8^2.0之间。
[0018]进行1.0%琼脂糖凝胶电泳验证，表明RNA提取纯度较高。
[0019]b.将菌丝体总RNA反转录合成⑶NA ;
使用TaKaRa 3' -Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒反转录合成cDNA，本试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。
[0020]反应体系:香菇菌丝体总RNA (II μ1、3’ RACE Adaptor (5 μΜ) I μL、dNTP Mixture (10 mM each) I M-1 > RNase Free dH20 4.5 M-1 ；
反应条件 :70°C，10 min立即冰上放置2分钟；
然后加入下列组分:5X M-MLV Buffer 2 μL、RNase Inhibitor (40 U/μΙ) 0.25 μL、Reverse Transcriptase M-MLV (无RNase) (200 U/ M-1) 0.25 Μ.1,体系总体积达到 10 M-10
[0021]反应条件:42°C，60min 70°C，15 min 得到反转录产物(cDNA)。
[0022]c.PCR扩增目标基因:
以所得到的cDNA为模板、以具有EcoR I和Xho I两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下:
上游引物EcoR I:
5’- GCGAATTCACCAACAATGCATCCGGTG _3’
下游引物Xho I:
5’- GCTCGAGATTACAAGAGCGCTCAGTA _3’
引物委托宝生物(大连)公司合成。
[0023]PCR反应体系50 μL: cDNA模板IμL，上游引物0.5μ1，下游引物0.5μ1，dNTPMixture (各 2.5 mM) 4 μ1、5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus) 10 μL、PrimeSTAR HS DNAPolymerase (2.5 U/μΙ) 0.5 Ml、灭菌蒸懼水 33.5μ1 ;反应条件:98°C变性 10s, 56°C 复性10s，72。。延伸 lmin, 30 个循环；72°C延伸 5min ;4°C冷却 IOmin0
[0024]PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳如图1所示，图1中M: DL2, 000 DNA Marker ；1:Latcripin-16目的克隆片段产物，证明成功获得了该基因片段。
[0025]d.回收纯化DNA片段:
将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化231bp Marker附近的明显条带，切胶回收DNA片段，名命为Latcripin-16基因片段。
[0026]实验:
1.Latcripin-16基因片段序列测定:
测序由大连宝生物公司测定，香菇C91-3基因片段核苷酸序列如SEQ IDN0.1.Latcripin-16的基因片段序列长为231bp的cDNA，其含有77个密码子可读框(ORF)。经使用NCBI数据库核苷酸相似性检索表明，无任何相似性的基因片段序列，证明此基因为一新型基因片段。
[0027]2.基因片段的克隆表达 2.1载体构建
2.1.1将质粒pET_32a (+)，使用EcoR I /Xho I进行酶切；
反应体系(371:过夜): pET32a (+) (100 ng/μL) 10 μL IOXK Buffer5 μL
EcoR I (10 U/μΙ)I μL
Xho I (10 U/μΙ)I μL
dH20 Up to50 μL
2.1.2载体回收
使用 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0 切胶回收约 5.9kbp的DNA片段。
[0028]2.1.3 将pET_32a ( +)载体与本发明实施例的Latcripin-16基因片段进行重组
使用In-Fusion? HD Cloning Kit,分别将本发明实施例的基因片段与酶切后回收载体连接，反应体系及条件如下:
基因片段(100 ng/M-1)2 M-1
酶切后回收载体(50 ng/μL)I μL
5 X In-Fusion HD Enzyme Premix2 M-1
dH20Up to 10 μL
50 °C 15 min
取上述In-Fusion产物2.5 μL热转化至万.co7i Rosetta-gami (DE3)中，涂布于含四种抗生素(羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素)的LB平板上，37 V过夜培养。
[0029]同时，选取平板上生长的单克隆阳性菌落接种于含四种抗生素(羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素)的LB液体培养基于37 V培养14小时，采用宝生物公司PlasmidMiniprep Kit V3.1抽提质粒进行测序鉴定，结果如图2所示，且与SEQ ID N0.1相同。
[0030]2.2Latcripin-16蛋白的诱导表达及鉴定 2.2.1 Latcripin-16蛋白的自诱导表达
挑取2.1.3的单克隆阳性菌落，接种于10 ml含四种抗生素(羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素)的LB液体培养基中，于37 V下，180 rpm 振荡培养5小时，再接种于IOml含四种抗生素(羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素)的自诱导培养基中，于37 V下，180 rpm振荡培养3、4、6小时。取菌液进行反复冻融破碎(4次)，低温(4°C )离心5000rpm, 5min,取上清，加入50 μ I PBS。将上清按蛋白样品处理方法处理后，做12%SDS_PAGE电泳图如图 3 所不，图 3 中 M:Premixed Protein Marker (low),KB:空载体pET32a 在疋Rosetta-gami中诱导表达产物，3h:Rosetta-gami中诱导表达3小时后表达重组蛋白，4h:Rosetta-gami中诱导表达 4小时后表达重组蛋白，6h:Rosetta-gami中诱导表达6小时后表达重组蛋白。表明:重组蛋白表达成功。
[0031]2.2.2 目标蛋白 Western-blotting 鉴定分析
将SDS-PAGE电泳分离样品后，将PAGE胶用湿转膜的方式转印到NC膜上，经5%脱脂牛奶室温封闭液封闭 100 分钟后，第一抗 Mouse Ant1-His Tag Monoclonal Antibody, 4°C孵育过夜。再加入第二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L)室温孵育60分钟，显色试剂盒显色如图4所不，表明:表达蛋白即为目的蛋白。
[0032]2.3 Latcripin-16蛋白的纯化及活性鉴定
2.3.1.Latcripin-16 蛋白的纯化
将上述条件诱导的菌体低温5000rpm, 10 min~20 min离心,每50~100 mg菌体(湿重)加入广2 ml细菌裂解液。10000Xg，4°C离心15~20分钟，分离上清和沉淀，并收集沉淀(包涵体)。将沉淀重悬于Binding Buffer中。10，000Xg离心20分钟，收集上清。将上清负载上柱，利用HIS标签的亲和层析进行蛋白的纯化，使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。得到单一的目的蛋白，12%SDS-PAGE电泳验证如图5所示。图5中，M: PageRulerPrestained Protein Ladder ；1:纯化后的单一目的蛋白条带。表明:重组蛋白纯化效果良好。
[0033]采用现有方法纯化浓缩的目标蛋白进行测序，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。此新型特异蛋白序列(Latcripin-16蛋白，简称Lp_16),经NCBI数据库氨基酸相似性检索和Pfam数据库检索分析 ,结果表明Latcripin-16蛋白具有核糖核酸内切酶L-PSP结构域，该结构域具有诱导肿瘤细胞凋亡、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等多种生物学功能。
[0034]核糖核酸内切酶L-PSP，又称为鼠肝脏高氯酸可溶性蛋白，它具有抑制蛋白质合成的作用。它在蛋白质合成过程中作用于mRNA，并引起多核糖体崩解，导致蛋白合成起始阶段的阻滞。研究者发现在不同的组织器官内(肝脏、肾脏、脑和肺脏等)，L-PSP都与细胞增殖的抑制关系密切。[Kanouchi H, Miyamoto M, Oka T, et al.Perchloric acid-solubleprotein is expressed in enterocytes and goblet cells in the intestine andupregulated by dietary lipid.Biochim Biophys Acta, 2006, 1760 (9): 1380 - 85]。在大鼠的肾脏肿瘤模型中，核糖核酸内切酶L-PSP表达下调，而正常肾脏细胞L-PSP蛋白是相对高表达的。这提示，肿瘤细胞的增殖与L-PSP活性降低密切相关，指出L-PSP可能与诱导肿瘤细胞的凋亡相关。[Ryo Morishita, Akihito Kawagoshi, Tatsuya Sawasaki,et al.Ribonuclease Activity of Rat Liver Perchloric Acid-soluble Protein, aPotent Inhibitor of Protein Synthesis.The Journal of Biological Chemistry,1999，274 (9): 20688 - 92]。另外，研究者发现，人核糖核酸内切酶L-PSP的同源蛋白具有显著的促进巨曬细胞分化的作用，从而发挥着一定的免疫调节作用。[SchmiedeknechtG, Kerkhoff C， Orso E, et al.1solation and characterization of a 14.5_kDatrichloroacetic-acid-soluble translational inhibitor protein from humanmonocytes that is upregulated upon cellular differentiation.Eur J Biochem,1996，242( 2): 339 - 51]。
[0035]2.3.2.Latcripin-16蛋白的除盐和复性
将纯化后的Latcripin-16蛋白进行梯度透析,将Latcripin-16蛋白装入MW16000的透析袋中，两端用透析袋夹夹紧。将透析袋放入0.5L~2L的透析复性液中，冰浴，搅拌透析，24~72 h，每6~8 h换液一次复性，逐步降低尿素浓度直至O。将透析袋中的溶液离心10000rpm，4°C离心，2(T30min上清即为复性的重组蛋白。
[0036] 2.3.3 Latcripin-16 蛋白的活性鉴定(MTT 法)
将纯化浓缩的目的蛋白进行微量BCA蛋白定量后，用MTT法检测细胞存活和生长情况。将目的蛋白作用的终浓度分别调整为18.75 μg/ml ,37.5 μg/ml,75 μg/mlU50 μ g/ml，以PBS作为空白对照。评价其对肿瘤细胞的细胞毒作用。选用人肺癌A549细胞进行MTT实验。用0.25~1%胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10 XioVml。每孔加入100 μL，边缘孔用无菌PBS填充，5%C02，37 °C孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)加入上述18.75 μ g/ml >37.5 μ g/ml、75 μ g/ml>150 μ g/ml浓度梯度的药物每孔100 μL，每个浓度设4个复孔，5%C02，37 °C孵育24小时，48小时，并倒置显微镜下观察。每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%ΜΤΤ)，继续培养4 h。终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150 μL 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min。在酶联免疫检测仪570 nm处测量各孔的吸光值，参考波长630 nm，按照下面公式计算抑瘤率(细胞生长抑制率):1R (inhibited rate) =(对照组平均OD值一实验组平均OD值)/对照组平均OD值。目标蛋白在蛋白浓度为18.75 μ g/ml ,37.5 μ g/ml、75 μ g/ml,150 μ g/ml时，24h、48h的抑瘤率如图6所示，说明本发明基因片段表达的Latcripin-16蛋白对人肺癌A549 细胞有显著地抑制作用。
【权利要求】
1.一种香菇C91-3菌株的L3icri/7i/?-76基因片段，其特征在于如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.一种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的基因片段编码蛋白，其特征在于如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3.—种如权利要求1所述香菇C91-3菌株的基因片段的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行: a.提取香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA； b.将菌丝体总RNA反转录合成cDNA； c.PCR扩增目标基因: 以所得到的cDNA为模板、以具有EcoR I和Xho I两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR反应；所述PCR反应引物序列如下: 上游引物EcoR I:
5’- GCGAATTCACCAACAATGCATCCGGTG _3’ 下游引物Xho I:
5’- GCTCGAGAT TACAAGAGCGCTCAGTA _3’ d.回收纯化DNA片段: 将所得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，纯化231bp Marker附近的明显条带，切胶回收DNA片段。
4.根据权利要求3所述香菇C91-3菌株的基因片段的制备方法，其特征在于所述a步骤是取培养18天的香菇C91-3菌株的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，加入Trizol后室温静置30min,样品融化后继续研磨至裂解液透明状,室温静置5min后，12000r/min离心5min,将上清转移至新的离心管中，然后加入1/5体积氯仿,温和振荡后，4 C，12000rpm离心，15min ;吸取上层水相溶液并转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置15min，再次4 C，12000rpm离心，IOmin,弃上清，然后加入75%乙醇洗涤并干燥，最后用DEPC处理水溶解，得到香菇C91-3菌株的菌丝体总RNA。
5.根据权利要求4所述香菇C91-3菌株的基因片段的制备方法，其特征在于所述c步骤的PCR反应体系50 μL: cDNA模板?μL，上游引物0.5μ1，下游引物0.5μ1，dNTP Mixture 4 M-1>5XPrimeSTAR Buffer 10 M-1> PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5υ/μ1)0.5 μL、灭菌蒸馏水33.5μ1 ;反应条件:98°C变性10s，56。。复性10s，72。。延伸lmin，30个循环；72°C延伸5min ;4°C冷却IOmin0
【文档编号】C12N15/10GK103898128SQ201310410779
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】黄敏, 张伟, 钟民涛, 伦永志, 刘奔, 李星云, 王晓丽, 曹婧, 宁安红 申请人:大连医科大学