一种党参愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明公布了一种党参愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞培养、水杨酸调控悬浮细胞中酶的活性及党参多糖含量等步骤，本发明方法所制备的党参悬浮细胞中含有较高含量的党参多糖。本发明方法利用水杨酸对党参悬浮细胞进行有目的的调控，可以在短期内获得大量的制药原料，并能有效降低生产成本。
【专利说明】一种党参愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及党参悬浮细胞的制备方法，尤其是水杨酸对党参悬浮细胞中多糖含量的调控。
【背景技术】
[0002]党参(Codonopsis pilosula)别名三叶菜、叶子单、臭党参,为桔梗科植物党参、素花党参或川党参的干燥根。其性味甘平、无毒、有补中益气、生津止渴等功效。和人参、丹参等传统中药材比较，党参是现代医学较少人研究的传统草本药物。党参中含量最多的为党参多糖，党参多糖亦是党参中的有效成分之一，近年来的研究表明，党参多糖具有降血糖，降血脂作用，抗溃疡活性等作用，其在调节免疫功能中具有抗病毒、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤等作用，本发明为其今后药用成分的开发利用提供基础。
[0003]水杨酸(SA)是一种广泛存在于植物体内的酚类物质参与植物体内许多生理过程，特别是作为植物系统获得性抗性所需的信号分子引起人们的广泛关注。植物中加入水杨酸可以改变酶的活性，提高植物的抗逆性，抗病性，还可以促进植物体内次生代谢物的合成。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供党参细胞悬浮培养的快速繁殖方法，并通过水杨酸对悬浮细胞调控获得生长良好，多糖含量高的悬浮细胞，可以规模化的为药厂提供多糖的来源。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案:
取党参叶片和芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗I小时，经酒精20s，氯化汞消毒lOmin，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养 基中进行愈伤组织诱导，附加激素0.5mg/LNAA, 3mg/LIBA,蔗糖 30g/L，琼脂 6.5g/L，pH=5.8-6.0，温度 23°C，湿度 40% ~60%，光强度 1000LX ;光期 12h暗期12h ;取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有50 mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为B5+lmg/L IAA+lmg/LKT，摇床转速为120r/min，温度为25°C，黑暗培养，每隔7d继代一次，连续培养4-5代后逐渐形成稳定的细胞系，进行悬浮培养系的诱导。将2mg/L水杨酸溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和多糖的含量。
[0006]所述培养基消毒方式为在121°C下灭菌20min。
[0007]所述的稀土优选是硝酸铈稀土。
[0008]所述的多糖提取方法为精密称取干样品lg，用洁净研钵小心研碎，转入200 mL容量瓶中，加入50 mL甲醇(100%)，于超声波液体振荡器上振荡45 min，温度60°C，过滤分离，收集滤液，最后用100%甲醇细心洗下，合并各次洗液于25 mL棕色容量瓶中作为待检测液。
[0009]所述的多糖测定方法为蒽酮硫酸法，使用葡萄糖配制不同浓度制作标准曲线。取提取出来的提取液1.0mL加蒽酮试剂5mL，在620nm波长下显色测定吸光度，重复3次，求平均值。
[0010]结果计算
多糖含量(W)=CVtZio6WV1
式中:C:从标准曲线查得葡萄糖量(μ g)；
Vt:样品提取液总体积(mL)；
V1:显色时取样量(mL)；
W:样品重(g)。
[0011]所述的酶活性的测定方法采用分光光度法测定
采用本发明制备的党参悬浮细胞，生长速度快，多糖含量高，利于大生产操作，能耗小，污染小，党参悬浮细胞增量为对照的4倍，多糖得率为12.87%。
[0012]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0013]实施例1
取室外党参春天新出幼嫩叶片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗I小时，经酒精20s，氯化汞消毒lOmin，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，附加激素0.5mg/LNAA，3mg/LIBA，蔗糖 30g/L，琼脂 6.5g/L,pH=5.8-6.0，温度 23°C，湿度 40% ~60%，光强度IOOOLX ;光期12 h暗期12h ;取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有50mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为B5+0.2mg/L ΙΑΑ+Ο.5 mg/LKT，摇床转速为120r/min，温度为25°C，黑暗培养.每隔7d继代一次，连续培养4_5代后逐渐形成稳定的细胞系，进行悬浮培养系的诱导。将lmg/L水杨酸溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和多糖的含量。党参悬浮细胞增量为对照的1.5倍，多糖得率为10.24%。
[0014]实施例2
取室外党参春天新出幼嫩叶片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗I小时，经酒精20s，氯化汞消毒lOmin，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，附加激素0.5mg/LNAA，3mg/LIBA，蔗糖 30g/L，琼脂 6.5g/L，ρΗ=5.8~6.0，温度 23 °C，湿度 40%~60%，光强度IOOOIx ;光期12 h暗期12h ;取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40 mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为匕+0.2 mg/L IAA+lmg/LKT，摇床转速为120r/min，温度为25°C，黑暗培养.每隔7d继代一次，连续培养4_5代后逐渐形成稳定的细胞系，进行悬浮培养系的诱导。将2mg/L水杨酸溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和多糖的含量，党参悬浮细胞增量为对照的1.83倍，多糖得率为 10.79%ο
[0015]实施例3
取室外党参春天新出幼嫩叶片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗I小时，经酒精20s，氯化汞消毒lOmin，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，附加激素0.5mg/LNAA，3mg/LIBA，蔗糖 30g/L，琼脂 6.5g/L,pH=5.8-6.0，温度 23°C，湿度 40% ~60%，光强度1000LX ;光期12 h暗期12h ;取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为B5+0.5 mg/L IAA+0.5 mg/LKT，摇床转速为120r/min，温度为25°C，黑暗培养.每隔7d继代一次，连续培养4_5代后逐渐形成稳定的细胞系，进行悬浮培养系的诱导。将2mg/L水杨酸溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和多糖的含量。党参悬浮细胞增量为对照的2.47倍，多糖得率为11.03%。
[0016]实施例4
取室外党参春天新出幼嫩叶片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗I小时，经酒精20s，氯化汞消毒lOmin，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，附加激素0.5mg/LNAA，3mg/LIBA，蔗糖 30g/L，琼脂 6.5g/L，pH=5.8-6.0，温度 23 °C，湿度 40% ~60%，光强度1000LX ;光期12 h暗期12h ;取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为匕+0.5 mg/L IAA+1 mg/LKT，摇床转速为120r/min，温度为25°C，黑暗培养.每隔7d继代一次，连续培养4_5代后逐渐形成稳定的细胞系，进行悬浮培养系的诱导。将2mg/L水杨酸溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和多糖的含量。党参悬浮细胞增量为对照的3.13倍，多糖得率为10.65%。
[0017]实施例5
取室外党参春天新出幼嫩叶片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗I小时，经酒精20s，氯化汞消毒lOmin，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，附加激素0.5mg/LNAA，3mg/LIBA，蔗糖 30g/L，琼脂 6.5g/L，pH=5.8-6.0，温度 23 °C，湿度 40% ~60%，光强度IOOOlx ;光期12 h暗期12h ;取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为匕+1 mg/L IAA+0.5 mg/LKT，摇床转速为120r/min，温度为25°C，黑暗培养.每隔7d继代一次，连续培养4_5代后逐渐形成稳定的细胞系，进行悬浮培养系的诱导。 将2mg/L水杨酸溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和多糖的含量。党参悬浮细胞增量为对照的3.58倍，多糖得率为11.94%ο
[0018]实施例6
取室外党参春天新出幼嫩叶片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗I小时，经酒精20s,氯化汞消毒lOmin，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，附加激素 0.5mg/LNAA，3mg/LIBA，蔗糖 30g/L，琼脂 6.5g/L，pH=5.8-6.0，温度 23 °C，湿度 40% ~60%，光强度1000LX ;光期12 h暗期12h ;取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40 mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为B5+l mg/L IAA+lmg/LKT，摇床转速为120r/min，温度为25°C，黑暗培养.每隔7d继代一次，连续培养4_5代后逐渐形成稳定的细胞系，进行悬浮培养系的诱导。将lmg/L水杨酸溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和多糖的含量。党参悬浮细胞增量为对照的2.98倍，多糖得率为12.13%。
[0019]实施例7
取室外党参春天新出幼嫩叶片，嫩芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗I小时，经酒精20s，氯化汞消毒lOmin，无菌水冲洗5遍，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，附加激素
0.5mg/LNAA，3mg/LIBA，蔗糖 30g/L，琼脂 6.5g/L，ρΗ=5.8-6.0，温度 23 °C，湿度 40% ~60%，光强度IOOOlx ;光期12 h暗期12h ;取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40mLMS液体培养基100 mL三角瓶中，培养基配方为^+1 mg/L IAA+2 mg/LKT，摇床转速为120r/min，温度 为25°C，黑暗培养.每隔7d继代一次，连续培养4_5代后逐渐形成稳定的细胞系，进行悬浮培养系的诱导。将3mg/L水杨酸溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样称重，测定酶的活性和多糖的含量。党参悬浮细胞增量为对照的3.17倍，多糖得率为12.24%ο
【权利要求】
1.一种党参愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞培养、水杨酸调控党参悬浮细胞中多糖的含量，其主要步骤如下: (1)按照植物组织培养常规消毒方法对野外采取的党参外植体材料进行消毒处理，获得无菌的外植体； (2)将步骤(I)获得的无菌党参叶片，芽接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导，诱导出来的愈伤组织继代培养4-5代，获得嫩绿松散的愈伤组织； (3)将步骤(2)获得的嫩绿松散的愈伤组织用镊子夹取接种在附加激素0.2-1 mg/LIAA和0.5-2 mg/L KT的B5培养基中进行震荡悬浮培养，形成稳定的细胞系； (4)将步骤(3)获得的党参悬浮细胞接种入B5+0.5mg/LIAA+2mg/LKT+水杨酸l_3mg/L，收集党参悬浮细胞称重，然后分两份，一份-70°C冰箱保存鲜样测酶的活性，一份60°C烘干保存干样，对党参多糖进行提取，检测。
2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于:步骤(I)中所述无菌的党参外植体叶片和芽按照下述方法得到:取党参叶片和芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗I小时，经酒精消毒处理20s，氯化汞消毒处理10分钟，无菌水冲洗5遍，用吸水纸吸去无菌外植体表面的水分。
3.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于:所述的培养条件为温度23°C，湿度40%~60%，光强度IOOOlx ;光期12 h暗期12h。
4.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于:步骤(2)所述的党参愈伤组织按照按照下述方法得到:将获得的无菌党参叶片和芽切成Icm2小块，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，每瓶接种3块，附加激素0.5mg/LNAA, 3mg/LIBA,鹿糖30g/L,琼脂6.5g/L, pH=8,初代培养30天，连续继代4-5次，继代周期20天，获得嫩绿松散的愈伤组织。
5.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于:步骤(3)所述的党参悬浮细胞按照按照下述方法得到:取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，用镊子夹取接种在附加激素0.2-1 mg/L IAA和0.5-2 mg/L KT的匕培养基中进行震荡悬浮培养，每IOOmL的三角瓶中加入液体培养基50mL，摇床转速为120r/min，温度为25°C，黑暗培养，每隔7d继代一次，连续培养4_5代后逐渐形成稳定的细胞系，完成悬浮培养系的诱导。
6.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于:步骤(4)所述水杨酸对黄芪悬浮细胞的调控按照下述方法实施:将l_3mg/l水杨酸溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，30天后取样测定党参多糖的含量，精密称取干样品lg，用洁净研钵小心研碎，转入200 mL容量瓶中，加入50 mL甲醇(100%)，于超声波液体振荡器上振荡45 min，温度60°C，过滤分离，收集滤液，最后用100%甲醇细心洗下，合并各次洗液于25 mL棕色容量瓶中。
7.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于:步骤(4)中所述的多糖提取采用的是40%甲醇提取。
8.根据权利要求1的制备方法中，其特征在于:步骤(4)中所述的多糖的检测采用的是蒽酮-硫酸法。
【文档编号】C12N5/04GK103461122SQ201310410879
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】苏刘花 申请人:南京泽朗农业发展有限公司