一种重组发光细菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株重组发光细菌及其应用。本发明公开的一种重组菌，该菌是将mer基因中的R基因和o/p位点组成的调控识别元件插入载体上缺乏启动元件的发光基因上游，并导入受体菌中得到。利用本发明公开的汞特异响应的重组发光细菌作为测试菌种，可以通过发光强度的大小判定水体中可生物利用性的汞浓度范围。与传统的物理化学检测方法相比，本发明提供的方法成本低、操作简单、结果可靠性高、易于实现自动在线化、不需要特殊的高精度的分析仪器和检测设备，可应用于环境水质监测领域，对于汞污染物质的预警监测具有非常重要的经济和社会意义。
【专利说明】一种重组发光细菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组发光细菌及其应用；特别涉及一种重组发光细菌及其在检测 汞含量中的应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 金属冶炼、科学测量仪器制造和化石燃料燃烧等都会产生汞的污染。与其他重金 属相似，汞污染具有持久性，在微剂量暴露的情况下，通过生物累积和生物扩大，使得含汞 的污染物对任何生态系统都会造成很大的影响。其中，对污染贡献最大的为可生物利用组 分的汞。
[0003] 目前，我国标准化测汞的方法主要是光谱法，例如原子吸收光谱法等，而在线化的 监测方法则是以阳极溶出伏安法为主的电化学方法。这些物理化学的检测方法虽然能够实 现水体中汞含量的高精度和高灵敏度检测，但难以用来评价汞对生物体造成的实际影响。 GB/T15441-1995和IS011348-2007中的发光细菌检测方法虽然也能用于汞的生物毒性评 价，但天然发光细菌所给出的是急性综合毒性结果，除了汞之外还有许多的污染物能引起 天然发光细菌的发光表达变化。而且，天然发光细菌所要求的3%氯化钠可能会改变实际水 体中重金属的生物可利用性，影响测试的准确性。重组发光细菌检测技术是基于天然发光 细菌工作机理上发展起来的技术，该技术通过将发光基因和重金属响应基因导入大肠杆菌 等受体细胞中得到重组发光细菌，能够实现对水体中重金属暴露风险的快速灵敏检测，并 且有望实现自动在线化，在水环境的重金属的监测预警领域有很好的应用前景。
[0004] mer基因是一类特异针对汞的拮抗基因，其基因簇组成一般为R、T、P、C、A及D基 因，其中R基因编码能特异识别汞，并且调控整个基因表达的merR阻遏蛋白，merR蛋白正常 情况下结合在R和T基因之间的基因表达调控位点--o/p位点，merR蛋白与汞结合时构 象发生改变，使RNA聚合酶能与o/p位点结合，启动整个mer基因的表达（Barkay T，Miller SM, Summers AO. 2003. Bacterial mercury resistance from atoms to ecosystems. Ferns Microbiology Reviews27:355-384.) 〇
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种重组发光细菌及其应用，利用本发明提供的汞特异响应 的重组发光细菌作为测试菌种，可以通过发光强度的大小判定水体中可生物利用性的汞浓 度范围。
[0006] 本发明提供一种重组菌，该菌是将mer基因中的R基因和o/p位点组成的调控识 别元件插入载体上缺乏启动元件的发光基因上游，并导入受体菌中得到。
[0007] 上述重组菌中，所述载体为pU⑶615质粒；
[0008] 所述插入的位点为pU⑶615质粒上的BamHI和EcoRI位点间。
[0009] 上述任一所述的重组菌中，所述调控识别元件为SEQ ID No. 3所示的DNA分子或 SEQ ID No. 3中自5'末端起第10位至第521位核苷酸所示的DNA分子；
[0010] 所述受体菌为大肠杆菌，具体为大肠杆菌E. coli DH5 α。
[0011] 上述任一所述的重组菌中，所述重组菌为保藏编号为CGMCC No. 8917的菌。
[0012] 上述任一所述的重组菌是能特异识别汞的mer重组发光细菌。
[0013] 一种判定样品中可生物利用性的汞浓度范围的试剂盒也属于本发明的保护范围， 该试剂盒包含上述任一所述的重组菌。
[0014] 一种判定样品中可生物利用性的汞浓度范围的方法也属于本发明的保护范围，包 括如下步骤：将汞特异的重组发光细菌的菌液与不同浓度的汞的水溶液混合得反应液；将 反应液置于20°c -27°c反应30min以上，测定其全波长的发光强度值，记作RLU;以不同浓 度的汞的水溶液中汞的浓度为横坐标，RLU为纵坐标，制作标准曲线，在横坐标箭头所示的 方向得到标准曲线的第1、第2、第3和第4个拐点，其中第1和第2个拐点之间的曲线是标 准曲线中的RLU上升期曲线、第2和第3个拐点之间的曲线是标准曲线中的RLU平台期曲 线，第3和第4个拐点之间的曲线是标准曲线中的RLU下降期曲线；按照上述方法分别测定 待测样品溶液的发光强度值，记作RLUs，阳性样品液的发光强度值，记作RLU P、阴性样品液 的发光强度值，记作RLUN、内标液的发光强度值，记作RLR，其中仅将不同浓度的汞的水溶 液分别替换为所述的待测样品溶液、阳性样品液、阴性样品液和内标液；当RLU P/RLUN > 50 时，若RLUN = RLUS < RL4 = RLUP，待测样品溶液中的可生物利用性的汞浓度小于第1个拐 点处的汞浓度，若RLUN < RLUS < RLR = RLUP，待测样品溶液中的可生物利用性的汞浓度大 于第1个拐点处的汞浓度且小于第2个拐点处的汞浓度，若RLU N < RLUS = RL4 = RLUP，待测 样品溶液中的可生物利用性的汞浓度大于第2个拐点处的汞浓度且小于第3个拐点处的汞 浓度，若RLU N < RLUS = RLR < RLUP，待测样品溶液中的可生物利用性的汞浓度大于第3个 拐点处的汞浓度且小于第4个拐点处的汞浓度，若RLU N = RLUS = RLR < RLUP，待测样品溶 液中的可生物利用性的汞浓度大于第4个拐点处的汞浓度或待测样品溶液具有高细胞毒 性；当RLU P/RLUN < 50时，应重新制备汞特异的重组发光细菌的菌液，使得RLUP/RLUN彡50， 再进行上述测定；
[0015] 所述汞特异的重组发光细菌为上述任一所述的重组菌；
[0016] 所述不同浓度的汞的水溶液由NaCl、HgCl2和水组成；
[0017] 所述待测样品溶液为待测样品中加入NaCl的溶液；
[0018] 所述阳性样品液为含有NaCl的HgCl2的水溶液；
[0019] 所述阴性样品液为NaCl水溶液；
[0020] 所述内标液为待测样品中加入NaCl和HgCl2的溶液；
[0021] 所述阳性样品液和内标液中的HgCl2的浓度相同，且为第2和第3个拐点之间的 汞浓度；
[0022] 所述不同浓度的汞的水溶液、待测样品溶液、阳性样品液、阴性样品液和内标液中 NaCl的浓度均相同；
[0023] 所述 RLUS > RLUN 为 RLUS > 2 X RLUN+S (RLUN)，所述 RLUS = RLUN 为 RLUS < 2XRLUN+S(RLUN)，S(RLUN)为所述阴性样品液发光强度的标准差；
[0024] 所述 RLUS = RLU〗为 0· 8RLU〗< RLUS < 1. 2RLU〗，所述 RLUS < RLU〗为 RLUS < 0· 8RLR ; 若RLUS > 1. 2RLR，则说明实验有误，需重新进行测试。
[0025] 所述 RLU〗=RLUP 为 0· 8RLUP < RLU〗< 1. 2RLUP，所述 RLU〗< RLUP 为 RLU〗< 0· 8RLUP ; 若RI^ > 1. 2RLUP，则说明试验有误，需重新进行测试。
[0026] 上述方法中，所述不同浓度的汞的水溶液中HgCl2的终浓度为lnmol/L-lmmol/ L，具体为 1ηΜ、3· 3ηΜ、6· 6ηΜ、10ηΜ、33ηΜ、66ηΜ、100ηΜ、330ηΜ、660ηΜ、1 μΜ、3· 3μΜ、6· 6μΜ、 10 μ Μ、33 μ Μ、66 μ Μ、100 μ Μ、330 μ Μ、660 μ Μ、ImM ;
[0027] 所述反应液中汞特异的重组发光细菌的菌液与不同浓度的汞的水溶液的体积比 为 1:1 ;
[0028] 所述不同浓度的汞的水溶液、待测样品溶液、阳性样品液、阴性样品液和内标液中 NaCl 的浓度为 0· 5g/100ml-lg/100ml，具体为 lg/100ml 或 0· 5g/100ml ;
[0029] 所述反应液的反应温度为27°C，反应时间为30min-90min，具体为30min-60min， 再具体为30min或60min ;
[0030] 所述第1个拐点处的汞浓度为10nM，第2个拐点处的汞浓度为ΙΟΟηΜ，第3个拐点 处的汞浓度为6. 6 μ M，第4个拐点处的汞浓度为33 μ M。
[0031] 上述任一所述的方法中，所述汞特异的重组发光细菌的菌液为非冷冻干燥的上述 任一所述的重组菌的对数生长期的菌液；
[0032] 或，
[0033] 所述汞特异的重组发光细菌的菌液为冷冻干燥的上述任一所述的重组菌复苏得 到的菌液；
[0034] 所述菌液具体是将上述任一所述的重组菌在LB培养基中培养得到；
[0035] 所述菌液可以用LB培养基、lg/100ml的NaCl水溶液、以醋酸盐、丙酮酸盐等作为 碳源，以磷酸盐作为缓冲体系将pH维持在中性的营养液进行稀释。
[0036] 上述任一所述的重组菌在制备判断样品中可生物利用性的汞浓度的产品中的应 用也属于本发明的保护范围。
[0037] 上述试剂盒在制备判断样品中可生物利用性的汞浓度的产品中的应用也属于本 发明的保护范围。
[0038] 重组发光细菌检测方法几乎不存在假阳性问题，而本发明提供的方法，能有效避 免假阴性问题。另外，本发明提供的方法利用重组发光细菌在汞暴露情况下发光的特点，通 过简单的发光检测仪对不同测试样品的发光强度进行测试，比较数值大小即可快速判断水 样中汞的含量。与传统的物理化学检测方法相比，该方法成本低、操作简单、结果可靠性高、 易于实现自动在线化、不需要特殊的高精度的分析仪器和检测设备，可应用于环境水质监 测领域，本发明对于汞污染物质的预警监测具有非常重要的经济和社会意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0039] 图1为重组菌在不同汞浓度暴露下的发光强度标准曲线1。
[0040] 图2为重组菌在不同汞浓度暴露下的发光强度标准曲线2。
[0041] 图3为重组菌暴露于含有10 μ M HgCl2的不同浓度的CdCl2水溶液的发光强度。
【具体实施方式】
[0042] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0043] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0044] pU⑶615质粒在文献"黄新新，何苗，罗虹，施汉昌，蔡强.pU⑶-recA重组发光 菌构建及对遗传毒性污染物响应作用.环境科学.2009年6月，第30卷第6期."中公开 过，公众可从清华大学获得。
[0045] Pseudomonas putida strain SP1 在文献"Zhang ffff，Chen LX, Liu DY. 2012. Characterization of a marine-isolated mercury-resistant Pseudomonas putida strain SPland its potential application in marine mercury reduction. Appl Microbiol Biot93:1305-1314. "中公开过，公众可从清华大学获得。
[0046] 实施例1、mer-萊响应重组发光细菌的构建
[0047] 构建mer重组发光细菌时，将R基因和o/p位点组成的调控识别元件插入缺乏启 动元件的发光基因上游，并导入合适的受体细胞内便能得到能特异识别汞的mer重组发光 细菌。
[0048] 以Pseudomonas putida strain SP1 的基因组DNA为模板，设计上游引物5'_CGCQ GATCCGCATTTCTCCTTTCGA-3' (SEQ ID No. 1，下划线所示序列为BamH I酶切识别位点）和下 游引物5'-CCGGAATTCTTACGCAACGGGAAAT-3'（SEQIDNo.2，下划线所示序列为EcoRI酶 切识别位点）进行PCR扩增，得到基因组DNA中的merRo/p序列，该序列如SEQ ID No. 3所 示，SEQ ID No. 3中自5'末端起第10位至第80位为o/p序列，第81位至第521位为merR 蛋白的编码基因序列，SEQ ID No. 4所不的序列为merR蛋白的氣基酸序列；
[0049] BamHI和EcoRI双酶切SEQIDNo·3所示的DNA分子，得到基因片段；BamHI 和EcoR I双酶切pU⑶615,得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质 粒，将重组质粒测序，结果正确。将重组质粒转化大肠杆菌E.coli DH5a，得到重组发光细 菌 mer-pUCD615。
[0050] 重组发光细菌mer_pUO)615分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli)，该 菌已于2014年3月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)， 保藏号为 CGMCC No. 8917。
[0051] 实施例2、用重组发光细菌mer-pU⑶615检测水样中的汞
[0052] 重组发光细菌mer-pU⑶615能实现对重金属萊的单一特异响应，不受镉、铅等其 他金属污染物的干扰，不存在假阳性问题。在细胞毒性不高的条件下，只要水样中存在可生 物利用的汞，就能使该菌株由不发光变成持续发光，进而通过现代光子检测技术检测发光 强度，利用该菌株判定水体中可生物利用性的汞浓度范围的具体步骤如下：
[0053] -、制备测试用菌液
[0054] 如下（一）或（二）所示的两种方法均可。
[0055] ( -）将重组发光细菌mer-pUCD615接种于LB培养基，置于37°C、180rpm的摇床 中培养至〇D_ = 0. 5505 (对数生长中期均可），用新鲜LB培养基进行10倍稀释，得到测试 用菌液（测试用菌液中细菌浓度不能过低，应满足下述的> 50的要求）。
[0056] (二）将冷冻干燥的重组发光细菌mer-pU⑶615复苏，具体是将保存于_20°C冰箱 的冷冻干燥的重组发光细菌mer-pU⑶615取出，迅速加入lmL的4°C预冷LB培养基，室温放 置5min，得到复苏菌液。取复苏菌液200 μ L，用lg/100ml的NaCl水溶液稀释50倍，得到 10mL测试用菌液（测试用菌液中细菌浓度不能过低，应满足下述的I max > 50的要求）。
[0057] 二、制备测试液
[0058] 汞响应剂量响应曲线测试液：用lg/100ml的NaCl水溶液制备浓度lnmol/L? lmmol/L(具体为 1ηΜ、3· 3ηΜ、6· 6ηΜ、10ηΜ、33ηΜ、66ηΜ、100ηΜ、330ηΜ、660ηΜ、1 μΜ、3· 3μΜ、 6· 6 μ Μ、10 μ Μ、33 μ Μ、66 μ Μ、100 μ Μ、330 μ Μ、660 μ Μ、ImM)的 HgCl2 标准溶液，以 lg/100ml 的NaCl水溶液作为阴性样品液。
[0059] 三、发光强度测试
[0060] 将步骤一中（一）或（二）制备的测试用菌液与步骤二中的各浓度的汞响应剂量 响应曲线测试液按体积比1 :1比例混合，得到反应液。每个浓度设置一个平行样，将反应液 置于27°C (20-27°C均可）反应，美国Molecular Devices公司的SpectraMax M5酶标仪测 试反应0min、30min和60min(30min以上均可，优选在30min-90min)的发光强度值（RLU)。 [0061] 四、标准曲线的制作
[0062] 以汞响应剂量响应曲线测试液中的汞浓度为横坐标，以RLU为纵坐标，将不同汞 浓度暴露时发光强度的变化制成标准曲线，用步骤一中（一）制备的测试用菌液得到的标 准曲线如图1所示，用步骤一中（二）制备的测试用菌液得到的标准曲线如图2所示。按 照上述方法绘制的阴性样品液的曲线与图1和图2中的Omin曲线相似。
[0063] 图1和图2中的30min和60min的标准曲线均可以用于判定水体中可生物利用性 的汞浓度范围。
[0064] 五、汞响应剂量响应曲线数据整理与评价
[0065] (一）待测水样液（待测水样中加入NaCl，使得NaCl的浓度为lg/100ml) RLUS、阳 性样品液（含有lg/l〇〇ml NaCl的1 μ M HgCl2的水溶液）RLUP、阴性样品液（lg/100ml的 NaCl水溶液）RLUN、内标液（待测水样中加入NaCl和HgCl2，使得NaCl的浓度为lg/100ml， HgCl2的浓度为1 μ M) RLU:，方法同步骤三，仅将步骤三中的各浓度的汞响应剂量响应曲线 测试液替换为上述各溶液。
[0066] 阳性样品液和内标液中的HgCl2的浓度可以选择图1中平台期（图1中第2至第 3个拐点之间）的同一浓度。
[0067] (二）首先计算最大光增量Imax = RLUP/RLUN，Imax彡50时，可根据表1判定样品中 的汞浓度范围，若1_〈50,则可能是mer-pUCD615菌液放置时间过久或者测试用菌液稀释 过度，应重新准备测试菌液，使得I max > 50。
[0068] 表1不同测试结果对应的萊浓度范围
[0069]
【权利要求】
1. 一种重组菌，该菌是将mer基因中的R基因和o/p位点组成的调控识别元件插入载 体上缺乏启动元件的发光基因上游，并导入受体菌中得到。
2. 根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述载体为pU⑶615质粒； 所述插入的位点为PU⑶615质粒上的BamH I和EcoR I位点间。
3. 根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述调控识别元件为SEQ ID No. 3 所示的DNA分子或SEQ ID No. 3中自5'末端起第10位至第521位核苷酸所示的DNA分 子； 所述受体菌为大肠杆菌，具体为大肠杆菌E. coli DH5 α。
4. 根据权利要求1-3任一所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为保藏编号为CGMCC No. 8917 的菌。
5. -种判定样品中可生物利用性的汞浓度范围的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1-4 任一所述的重组菌。
6. -种判定样品中可生物利用性的汞浓度范围的方法，包括如下步骤：将汞特异的重 组发光细菌的菌液与不同浓度的汞的水溶液混合得反应液；将反应液置于20°C -27°C反应 30min以上，测定其全波长的发光强度值，记作RLU ;以不同浓度的汞的水溶液中汞的浓度 为横坐标，RLU为纵坐标，制作标准曲线，在横坐标箭头所示的方向得到标准曲线的第1、第 2、第3和第4个拐点，其中第1和第2个拐点之间的曲线是标准曲线中的RLU上升期曲线、 第2和第3个拐点之间的曲线是标准曲线中的RLU平台期曲线，第3和第4个拐点之间的曲 线是标准曲线中的RLU下降期曲线；按照上述方法分别测定待测样品溶液的发光强度值， 记作RLUs，阳性样品液的发光强度值，记作RLU P、阴性样品液的发光强度值，记作RLUN、内标 液的发光强度值，记作RLR，其中仅将不同浓度的汞的水溶液分别替换为所述的待测样品 溶液、阳性样品液、阴性样品液和内标液；当RLU P/RLUN彡50时，若RLUN = RLUS < RLUi = RLUP，待测样品溶液中的可生物利用性的汞浓度小于第1个拐点处的汞浓度，若RLUN < RLUS < RLR = RLUP，待测样品溶液中的可生物利用性的汞浓度大于第1个拐点处的汞浓度且小 于第2个拐点处的汞浓度，若RLU N < RLUS = RLR = RLUP，待测样品溶液中的可生物利用性 的汞浓度大于第2个拐点处的汞浓度且小于第3个拐点处的汞浓度，若RLU N < RLUS = RLUi < RLUP，待测样品溶液中的可生物利用性的汞浓度大于第3个拐点处的汞浓度且小于第4 个拐点处的汞浓度，若RLU N = RLUS = RLR < RLUP，待测样品溶液中的可生物利用性的汞浓 度大于第4个拐点处的汞浓度或待测样品溶液具有高细胞毒性；当RLU P/RLUN < 50时，应重 新制备汞特异的重组发光细菌的菌液，使得RLUP/RLUN > 50,再进行上述测定； 所述汞特异的重组发光细菌为权利要求1-4任一所述的重组菌； 所述不同浓度的汞的水溶液由NaCl、HgCl2和水组成； 所述待测样品溶液为待测样品中加入NaCl的溶液； 所述阳性样品液为含有NaCl的HgCl2的水溶液； 所述阴性样品液为NaCl水溶液； 所述内标液为待测样品中加入NaCl和HgCl2的溶液； 所述阳性样品液和内标液中的HgCl2的浓度相同，且为第2和第3个拐点之间的汞浓 度； 所述不同浓度的汞的水溶液、待测样品溶液、阳性样品液、阴性样品液和内标液中NaCl 的浓度均相同； 所述 RLUS > RLUn 为 RLUS > 2XRLUn+S(RLUn)，所述 RLUs = RLUn 为 RLUs < 2XRLUn+S(RLUn)，S(RLUn)为所述阴性样品液发光强度的标准差； 所述 RLUS = RLU:为 0· 8RLU: < RLUS < L 2RLU:，所述 RLUS < RLU:为 RLUS < 0· 8RLR ; 所述 RLU: = RLUP 为(λ 8RLUP < RLU: < L 2RLUP，所述 RLU: < RLUP 为 RLU: < (λ 8RLUP。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述不同浓度的汞的水溶液中HgCl2的 终浓度为 lnmol/L-lmmol/L,具体为 1ηΜ、3· 3ηΜ、6· 6nM、10nM、33nM、66nM、100nM、330nM、 660nM、1 μ Μ、3. 3 μ Μ、6. 6 μ Μ、10 μ Μ、33 μ Μ、66 μ Μ、100 μ Μ、330 μ Μ、660 μ M、ImM ; 所述反应液中汞特异的重组发光细菌的菌液与不同浓度的汞的水溶液的体积比为 1：1 ； 所述不同浓度的汞的水溶液、待测样品溶液、阳性样品液、阴性样品液和内标液中NaCl 的浓度为 〇· 5g/100ml-lg/100ml，具体为 lg/100ml 或 0· 5g/100ml ; 所述反应液的反应温度为27°C，反应时间为30min-90min，具体为30min-60min，再具 体为 30min 或 60min。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述汞特异的重组发光细菌的菌液 为非冷冻干燥的权利要求1-4任一所述的重组菌的对数生长期的菌液； 或， 所述汞特异的重组发光细菌的菌液为冷冻干燥的权利要求1-4任一所述的重组菌复 苏得到的菌液； 所述菌液具体是将权利要求1-4任一所述的重组菌在LB培养基中培养得到。
9. 权利要求1-4任一所述的重组菌在制备判断样品中可生物利用性的汞浓度的产品 中的应用。
10. 权利要求5所述的试剂盒在制备判断样品中可生物利用性的汞浓度的产品中的应 用。
【文档编号】C12R1/19GK104140943SQ201410338865
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】汪用志, 何苗 申请人:清华大学