具有改善蔗糖利用的重组细菌的制作方法
【专利摘要】本发明提供了具有改善的利用蔗糖的能力的重组细菌。这些重组细菌具有编码利用蔗糖的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列在yihP基因或其同源物与yihO基因或其同源物之间被整合到它们的基因组中。另外，还提供了利用所述重组细菌来生产诸如甘油和甘油衍生产物的产物的方法。
【专利说明】具有改善蔗糖利用的重组细菌
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物学和分子生物学领域。更具体地，提供了具有改善的利用蔗糖的能力的重组细菌。
【背景技术】
[0002]许多在商业上有用的微生物可利用葡萄糖作为其主要碳水化合物来源。然而，所开发的用于产生商业上所需的产物的微生物利用葡萄糖的缺点是葡萄糖的高费用。使用蔗糖和含有蔗糖和其他糖类的混合原料作为微生物生产系统的碳水化物来源将会是在商业上可取的，因为这些材料可容易以较低成本获得。
[0003]当生产微生物可利用混合原料中存在的任何蔗糖时，其可更高效地运行。因而，当生产微生物不具有高效利用蔗糖作为主要碳源的能力时，其不能如此有效地工作。例如，细菌细胞通常显示出偏好的糖利用，以葡萄糖为最优选的。在含有糖混合物的人造培养基中，葡萄糖通常先于其他糖类被完全代谢。此外，许多细菌缺少利用蔗糖的能力。例如，不到50%的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株具有利用鹿糖的能力。因而，当生产微生物不能利用蔗糖作为碳水化合物来源时，希望对该微生物进行工程改造而使得其可利用蔗糖。
[0004]已通过整合利用蔗糖的基因来工程改造而可利用蔗糖的重组细菌已有报道。例如，Livshits等人(美国专利6，960，455)描述了利用大肠杆菌菌株来生产氨基酸，所述菌株含有编码利用蔗糖的代谢途径的基因。此外，Olson等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.74:1031-1040，2007)描述了携带负责蔗糖降解的基因的大肠杆菌菌株，其可利用蔗糖作为碳源来生产L-酪氨酸或L-苯丙氨酸。此外，Eliot等人(美国专利申请公布2011/0136190)描述了能够从蔗糖生产甘油和甘油衍生产物的重组细菌。然而，仍然存在对具有改善的利用蔗糖能力的细菌菌株的需求。此外，还存在着对具有改善的利用蔗糖作为碳源生产甘油和甘油衍生产物的能力的`细菌菌株的需要。
【发明内容】
[0005]一个实施例提供了重组细菌，所述重组细菌在其基因组中包含:
[0006](a) 一种或多种编码具有蔗糖转运蛋白活性的多肽或多肽复合物的核苷酸序列；
[0007](b)编码具有果糖激酶活性的多肽的核苷酸序列；和
[0008](C)编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列；
[0009]其中:
[0010](i) (a)、(b)和(C)各自可操作地连接至相同的或不同的启动子；
[0011](ii) (a)、(b)和(c)在yihP基因或其同源物与yihO基因或其同源物之间被整合到基因组中；并且
[0012](iii)所述细菌以比包含整合在基因组中不同位置处的(a)、(b)和(C)的细菌更高的速率代谢蔗糖。
[0013]另一个实施例提供了由蔗糖制备甘油、1，3_丙二醇和/或3-羟基丙酸的方法，所述方法包括:
[0014]a)在蔗糖存在下培养本文所公开的重组细菌；以及
[0015]b)回收产生的甘油、1，3_丙二醇和/或3-羟基丙酸。
[0016]【专利附图】
【附图说明】和序列说明
[0017]通过下面的【具体实施方式】、附图和随附的序列描述可以更全面地理解本发明，这些详细描述、附图和序列描述形成了本专利申请的一部分。
[0018]图1是显示蔗糖基因簇在其处被整合的染色体位置的图。染色体基因以带条纹的箭头显不。所述鹿糖基因以开放的箭头显不。箭头的方向表不基因表达的方向。
[0019]下列序列符合37C.F.R.1.8211.825 ( “对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求一序列规则”)，并且符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)和EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5 (a bis)，以及行政指令的208节和附录C)。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37C.F.R.§ 1.822所示的规则。
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【权利要求】
1.重组细菌，所述重组细菌在其基因组中包含: (a)一种或多种编码具有蔗糖转运蛋白活性的多肽或多肽复合物的核苷酸序列； (b)编码具有果糖激酶活性的多肽的核苷酸序列；和 (C)编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列； 其中: (i)(a)、(b)和(C)各自可操作地连接至相同的或不同的启动子； (ii)(a)、(b)和(c)在yihP基因或其同源物与yihO基因或其同源物之间被整合到基因组中；并且 (iii)所述细菌以比包含整合在基因组中不同位置处的(a)、(b)和(c)的细菌更高的速率代谢蔗糖。
2.根据权利要求1所述的重组细菌，其中所述具有蔗糖水解酶活性的多肽归类为EC3.2.1.26 或 EC2.4.1.7。
3.根据权利要求1所述的重组细菌，其中所述具有果糖激酶活性的多肽归类为EC2.7.1.4、EC2.7.1.3 或 EC2.7.1.1。
4.根据权利要求1所述的重组细菌，其中所述细菌选自下列属:埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏 菌属(Klebsiella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和气杆菌属(Aerobacter)。
5.根据权利要求4所述的重组细菌,其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichiacoli)。
6.根据权利要求1所述的重组细菌，其中所述细菌产生I，3-丙二醇、甘油和/或3-羟基丙酸。
7.由蔗糖制备甘油、I，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸的方法，包括: a)在蔗糖存在下培养权利要求6的重组细菌；以及 b)回收产生的甘油、1，3_丙二醇和/或3-羟基丙酸。
【文档编号】C12P7/52GK103732735SQ201280039101
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年6月25日 优先权日:2011年8月16日
【发明者】Q.陈, Q.程, J.P.赖, K.鲁伊布林格-贾斯 申请人:纳幕尔杜邦公司