专利名称：一种同时提取马尾松针叶总rna和基因组dna的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及马尾松针叶总RNA和基因组DNA同时提取的方法。
背景技术：
马尾松是我国南方重要的用材树种，其常规育种取得了较大进展，但其分子育种一直进展缓慢，开展马尾松分子水平上的基础性技术开发很有必要。高效提取植物总RNA和基因组DNA是进行Northern印迹、3' -RACE,5' -RACE以及高质量cDNA文库构建和Southern杂交、PCR扩增的首要条件。虽然现在已有各种商品化的试剂盒分离植物总RNA和基因组DNA，但试剂盒只是针对总RNA或基因组DNA，分开单独提取，且价格昂贵，对于富含多糖、多酚类次生代谢物等植物也难以满足实验要求。当研究材料少或者珍贵稀有物种材料时，如果能从材料中同时提取总RNA和基因组DNA，不仅简化了实验步骤，节省植物材料，又降低实验成本和缩短时间，具有重要的现实意义。马尾松属于松科松亚属针叶树种，体内含有十分丰富的多糖多酚类次生代谢物， 严重影响到总RNA和基因组DNA的提取效果。目前虽有对松树总RNA和基因组DNA分别进行提取的方法研究的一些报道，但针对总RNA和基因组DNA同时提取的方法相关研究尚未见报道。因此，建立一种马尾松针叶总RNA和基因组DNA同时提取的方法具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种可以同时提取马尾松针叶总RNA 和基因组DNA的方法。本发明提供的同时提取马尾松针叶总RNA和基因组DNA的方法，包括以下几个步骤1、总RNA的提取用液氮研磨马尾松室内组培苗，之后转移到预热的5ml CTAB缓冲液中；该缓冲液含有2% (w/v) CTAB,2% (w/v)PVPUOOmM Tris-HCl (ρΗ8· 0)、25mM EDTA、2M NaCl、0. 5g/L亚精胺，使用前加入2% (ν/ν) 巯基乙醇；水浴加热，用氯仿异戊醇04 1)抽提两次， LiCl 4°C沉淀过夜，上清转移到新管(记溶液1)；沉淀用500 μ 1 SDS缓冲液溶解，500 μ 1 氯仿异戊醇04 1[ν/ν])抽提一次，乙醇沉淀，干燥后加水溶解。浓度及纯度检测。SDS 缓冲液含有 1. OM NaCl.O. 5% (w/v) SDSUOmM Tris-HCl (ρΗ8· 0)、ImM EDTA(ρΗ8. 0)；2、基因组DNA的提取用5ml异丙醇沉淀第1步中的溶液1，离心后向沉淀中加入500 μ 1 SDS缓冲液溶解，500μ1氯仿异戊醇04 1)抽提一次，乙醇沉淀，最后用70% (ν/ν)酒精洗涤2次， 干燥后加水溶解。浓度及纯度检测。本发明采用了不同于其他植物总RNA和基因组DNA提取的方法，即将总RNA提取和基因组DNA提取结合起来同时进行。避免了分开单独进行的繁琐，提高材料利用的效率。RNA提取中，加了 LiCl需要4°C过夜，沉淀时间短，将影响到RNA的产率。抽提方法也不同于其他植物抽提方法，仅采用氯仿异戊醇04 1)抽提，省去了对环境污染严重的酚。DNA 提取中，用RNA沉淀后留下的上清液提取基因组DNA。LiCl沉淀时间长，DNA中混有的RNA 量少，纯度高，相反，LiCl沉淀时间短，DNA中混有较多的RNA，降低其纯度。另外，DNA抽提仅用氯仿异戊醇04 1)抽提一次即可，避免抽提过程中DNA大量损失。因此采用此发明的同时提取总RNA和基因组DNA的技术有如下优点节省材料、缩短提取时间、降低实验成本、提取的效果好、RNA和DNA纯度高。
图1提取的马尾松针叶总RNA。图2提取的马尾松针叶基因组DNA。图3、图4是总RNA用于RT-PCR扩增。图5基因组DNA用于SSR扩增。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例1、总 RNA 提取(1)取5ml CTAB提取缓冲液于IOml离心管中，65°C预热5-10min，水浴前加2%的 β-巯基乙醇；(2)研钵用液氮预冷，取大约0. 5g马尾松幼苗，充分研磨后，用勺子将材料送进离心管。涡旋30s，65°C水浴15min (每隔5min颠倒一次)；(3)室温 12000rpm 离心 IOmin ；(4)取上清于新离心管中，加入5ml氯仿异戊醇Q4 1)，涡旋，充分混勻；(5)室温 12000rpm 离心 IOmin ；(6)重复上述两步骤，然后加入1/4体积IOM LiCl，混勻后，4°C过夜，第二天于 4°C，12000rpm 离心 20min ；(7)上清转移到新的IOmL离心管内，用于DNA的提取(记溶液1)；向沉淀中加入 500 μ 1 SDS缓冲液溶解，然后转入1. 5ml离心管内；(8)加入500μ 1氯仿异戊醇04 1)，涡旋，充分混勻，4°C，12000rpm离心 lOmin，取上清；(9)加入Iml无水乙醇，置于_70°C，沉淀30min ；(10)41，12000卬111离心151^11，倒掉上清，室温干燥101^11，加入40-6(^1 DEPC 水溶解RNA。浓度及纯度检测，-20°C保存备用(图1)。图中1、2泳道是以室内组培苗为材料提取的马尾松针叶总RNA的电泳结果；3、4泳道是以室外当年生针叶为材料提取的马尾松针叶总RNA的电泳结果。图1结果表明，本方法既适合马尾松室内组培苗、也适合室外当年生的马尾松针叶为材料，提取总RNA，且RNA条带清晰，纯度好。2、基因组DNA提取(11)将上述步骤(7)得到的溶液1中加入5ml异丙醇，混勻，冰上放置10min，4°C，12000rpm离心lOmin，倒掉上清；(12)加入500 μ 1 SDS缓冲液溶解沉淀，然后转入1. 5ml离心管内；(13)加入500 μ 1氯仿异戊醇04 1)，涡旋，充分混勻，4°C，12000rpm离心 lOmin，取上清；(14)加入 Iml 无水乙醇，置于-70°C，30min ；(15)4°C，12000rpm离心15min，倒掉上清，用预冷的70%酒精洗涤2_3次，室温干燥lOmin，加入适量无菌水1)溶解DNA。浓度及纯度检测，_20°C保存备用(图2)。 图中1、2泳道是以室内组培苗为材料提取的马尾松针叶基因组DNA的电泳结果；3、4泳道是以室外当年生针叶为材料提取的马尾松基因组DNA的电泳结果。图2结果表明，本方法既适合马尾松室内组培苗、也适合室外当年生的针叶为材料，提取基因组DNA，且DNA条带清晰，质量较好。3、总 RNA 用于 RT-PCR 扩增第一步cDNA第一条链合成(1)将下列试剂短暂涡旋，离心后，放置冰上，PCR管置于冰上(2)向PCR管中依次加入总RNA4 μ 1Oligo (dT)18 引物Ιμ 5， -ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ-3，DEPC 7jC7 μ 1混勻后，放入65°C水浴加热5min，取出后立即置于冰上冷却。(3)然后向管内依次加入5倍第一条链缓冲液4 μ 1RNase 抑制剂(20u/ μ L)1 μ 1dNTP (IOmM)2μ 1M-MLV 反转录酶 QOOu/ μ L)1 μ 1(4)短暂涡旋、离心后，放入PCR仪中，42°C 60min，然后70°C 5min。反映结束后， 得到的产物即为cDNA第一条链(图3)。图中M泳道是Marker的电泳结果；1、2泳道是以室内组培苗为材料提取的马尾松针叶总RNA，反转录合成的cDNA第一条链的电泳结果；3、 4泳道是以室外当年生针叶为材料提取的马尾松针叶总RNA，反转录合成的cDNA第一条链的电泳结果。图3结果表明，本方法提取的马尾松室内组培苗、室外当年生的马尾松针叶总 RNA,均适合作为反转录的模板，合成cDNA第一条链。cDNA大小范围在0. 75-41Λ，表明RNA 质量好，反转录效率高。第二步RT_PCR扩增(5)向PCR管内依次加入下列试剂
5第一条链CDNA2μ1
10倍PCR反应缓冲液5μ1
dNTP (IOmM)Ιμ
MgCl2 (25mM)3μ1
正向引物11.5μ1 5，-GAC AGAGAAGGTC ATTG -3 ‘
反向引物11.5μ1 5，-CGTCTC AGC AATC ΑΤ-3 ‘
DNA聚合酶0.5μ1
ddH2035.5μ1短暂涡旋、离心后，放入PCR仪中，PCR反应程序如下
94 "C 3min预变性 9VC Imin 变性、 50V Imin退火^劝个循环 72 0C 2min延伸」
72°C延伸lOmin，最后4°C保存。(6)取5 μ 1 RT-PCR产物，进行0. 8% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测(图4)。图中M 泳道是Marker的电泳结果；1、2泳道是以室内组培苗为材料提取的马尾松针叶总RNA，反转录合成的cDNA第一条链为模板，进行RT-PCR的电泳结果；3、4泳道是以室外当年生针叶为材料提取的马尾松针叶总RNA，反转录合成的cDNA第一条链为模板，进行RT-PCR的电泳结果。图4结果表明，本方法提取的马尾松室内组培苗、室外当年生的马尾松针叶总RNA，都适合作为反转录模板，合成cDNA第一条链，进行RT-PCR研究。RT-PCR目的条带清晰，效果好。4、基因组DNA用于SSR扩增首先将提取的DNA取出1 μ 1，稀释50倍，然后取1 μ 1作为PCR模板。向PCR管内依次加入下列试剂DNA模板Ιμ
10倍PCR反应缓冲液Ιμ
MgCl2 (25mM)Ιμ
DNA聚合酶0.1 μ
dNTP (2.5mM)0.8μ1
正向引物20.25μ1 5，-AGC ACTGGGAATGGAGAA-3，
反向引物20.25μ1 5，-C AGGGAGAATGAAGAGCC-3，
ddH205.6μ1短暂涡旋、离心后，放入PCR仪中，PCR反应程序
94 "C4min预变性93 "C45s变性、梯度降温扩增50 "C45s退火^ 14个循环72 "C45s延伸)92 "C30s变性、一般性扩增PCR45 "C1.5min退火.35个循环72 "CImin延伸 J72 "C3 Omin延伸 取1 μ IPCR产物，进行8 % (w/v)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(图5)。图中M泳道是Marker的电泳结果；1、2泳道是以室内组培苗为材料提取的马尾松基因组DNA为模板， 进行SSR扩增的电泳结果；3、4泳道是以室外当年生针叶为材料提取的马尾松基因组DNA 为模板，进行SSR扩增的电泳结果。图5结果表明，本方法提取的马尾松室内组培苗、室外当年生马尾松基因组DNA，均可用于SSR扩增，电泳条带清晰，效果较好。
权利要求
1.同时提取马尾松针叶总RNA和基因组DNA的方法，其特征在于包括以下步骤(1)总RNA提取液氮研磨马尾松针叶，之后转移到预热的5mlCTAB缓冲液中，该CTAB 缓冲液含有 ^iCTAB、2%PVP、IOOmM Tris-HCl (pH8. 0)、25mM EDTA、2M NaCl、0. 5g/L 亚精胺， 使用前加入-巯基乙醇，水浴加热，用的氯仿/异戊醇抽提两次，LiCl沉淀，上清液转移到新管，记为溶液1备用；沉淀用500 μ 1 SDS缓冲液溶解，500 μ 1氯仿/异戊醇抽提一次，乙醇沉淀，干燥后加水溶解，得总RNA ；所述SDS缓冲液含有1. OM NaCUO. 5% SDSUOmM Tris-HCl (ρΗ8· 0) UmM EDTA(ρΗ8. 0)；所述氯仿与异戊醇的体积比为24 1 ；(2)基因组DNA提取用5ml异丙醇沉淀第(1)步中的溶液1，之后加入500μ 1 SDS缓冲液溶解沉淀，500 μ 1氯仿/异戊醇抽提一次，乙醇沉淀，最后用70%酒精洗涤2次，干燥后加水溶解，得基因组DNA。
全文摘要
以马尾松针叶为材料建立了同时提取总RNA和基因组DNA的方法。采用CTAB-LiCl沉淀方法提取总RNA，LiCl4℃过夜，沉淀用于提取总RNA，上清液用于提取基因组DNA。总RNA纯度好，A260/A280比值在1.8-2.2之间，总RNA产率高，在150-240μgRNA/g鲜重之间；基因组DNA质量好，A260/A280比值在1.8-2.0之间。总RNA可用于cDNA合成、RT-PCR扩增，基因组DNA可用于SSR扩增等研究。
文档编号C12N15/10GK102363778SQ201110344210
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者何卫龙, 夏诗宽, 季孔庶, 王晓锋 申请人:南京林业大学