专利名称：中华按蚊抗药性as-pcr检测试剂盒及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种中华按蚊抗药性AS-PCR检测试剂盒及其专用引物。
背景技术：
中华按蚊(Anopheles sinensis)分布于我国除青海和新疆以外的所有省市，是我国平原水网和水稻种植地区的优势蚊种，家野两栖，白天多栖息在村庄四周的作物植棵和芦苇丛、灌木丛中，部分栖息在牛房畜舍，偏嗜畜血(以牛、马、猪等大牲畜为主)，兼吸人血，以成蚊越冬。中华按蚊是我国疟疾的重要传播媒介，尤其在北纬34°以北的地区，它是主要的或唯一的传播媒介。目前，疟疾尚无有效疫苗可用，控制疟疾媒介的种群数量是防治疟疾的重要手段。化学防治因其易操作，能够迅速、有效地控制害虫种群，在媒介昆虫防制规划中占有重要地位。过去几十年来，针对中华按蚊的生活习性，用拟除虫菊酯类杀虫剂， 采用滞留喷洒和浸泡蚊帐等灭蚊防疟措施，取得了显著效果。然而，化学防治在充分发挥其优势的同时，也带来了负面效果，导致了中华按蚊抗药性的产生。九十年代以来，国内各地报道的中华按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性越来越明显。1993年重庆中华按蚊对溴氰菊酯和DDT达到初级抗性，1998年在云南采集的10个中华按蚊种群有5个对DDT产生抗性，1999年浙江温州、宁波等地的中华按蚊种群达到高抗种群(R/S = 15-20)，2009年，江苏部分地区的中华按蚊对溴氰菊酯产生了高度抗性。害虫对杀虫剂产生抗性以后，化学防治的效果就会随着抗药性的升高而下降，害虫的防治也会受到严重的影响。为了应对害虫种群的抗性，为了克服抗性达到预期的防治效果，杀虫剂的使用量，包括单位面积的施药量和施药次数，就不得不持续增加，这无异于在持续增加杀虫剂对媒介昆虫抗性的选择压力，而且这种抗药性还可向远距离扩散，间接地还可能造成某些媒介疾病的发生与流行。从这些年对害虫抗药性的监测来看，抗药性增长的速度远大于新农药、新剂型研发的速度。因此，如何加强媒介昆虫的抗药性治理、延缓抗药性的产生和发展、延长现有杀虫剂的使用寿命是害虫治理中的重要内容。昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性主要是击倒抗性(knockdown resistance, kdr), kdr基因在中华按蚊对拟除虫菊酯的抗性中具有重要作用。拟除虫菊酯的作用靶标主要是昆虫电压依赖性神经细胞膜上的钠离子通道，离子通道上的作用靶点对杀虫剂降低了敏感性而产生击倒抗性，因此击倒抗性不同于代谢抗性，不能被酯酶或多功能氧化酶的抑制剂所降低。通过比较敏感、抗性中华按蚊的部分钠通道序列，发现钠通道基因的L1014F(亮氨酸到苯丙氨酸)即TTG — TTT的突变及L1014C(亮氨酸到半胱氨酸)即 TTG-TGT的突变和击倒抗性相关。这是我国关于中华按蚊击倒抗性及其基因突变的首次报道。kdr基因可以作为昆虫对拟除虫菊酯产生抗性的一个分子标记，通过监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态。谭伟龙等0011)用特异性等位基因PCR方法，对采江苏、安徽的11个中华按蚊种群进行致死中浓度(LC50)和kdr基因频率的测定，并且发现LC5tl为代表的高效氯氰菊酯抗性与中华按蚊kdr等位基因频率之间存在正相关关系。研究说明Kdr基因可以作为中华按蚊对拟除虫菊酯产生抗性的一个分子标记，通过监测kdr等位基因或基因型频率，了解抗性基因在种群遗传结构中的状态，可以预测抗性的发生和发展。目前我国还没有成型的针对中华按蚊的kdr抗性分子检测方法和试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的引物。本发明提供的引物由引物组A、引物组B和引物组C组成所述引物组A包括引物2和引物3，所述引物2和引物3的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列3 ；所述引物组B包括引物2和引物4，所述引物2和引物4的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列4 ；所述引物组C包括引物2和引物5，所述引物2和引物5的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列5。所述引物组A还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1 ；所述引物组B还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1 ；所述引物组C还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1。所述引物组A由引物1-3组成；所述引物组B由引物1、2和4组成；所述引物组C由引物1、2和5组成；所述引物组A、所述引物组B和所述引物组C均为独立包装；所述突变位点为L1014F或L1014C。本发明的第二个目的是提供一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的PCR试齐IJ。本发明提供的PCR试剂，由试剂A、试剂B和试剂C组成；所述试剂A由所述引物组A和PCR缓冲液组成；所述试剂B由所述引物组B和PCR缓冲液组成；所述试剂C由所述引物组C和PCR缓冲液组成；所述引物1在其对应的所述试剂中的终浓度均为1. 33ng/yl ；所述引物2在其对应的所述试剂中的终浓度为eng/μ 1 ；所述引物3-5在其对应的所述试剂中的终浓度均为6. 67ng/yl ；所述突变位点为L1014F或L1014C。本发明的第三个目的是提供一种制备检测中华按蚊中kdr基因突变位点的试剂的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)分别将所述的引物中的所述引物组A、所述引物组B和所述引物组C进行独立包装，得到独立包装引物组A、独立包装引物组B和独立包装引物组C ；2)再将步骤1)得到的独立包装引物组A、步骤1)得到的独立包装引物组B和步骤1)得到的独立包装引物组C进行包装，得到试剂；
所述突变位点为L1014F或L1014C。由所述的方法制备的试剂也是本发明保护的范围。本发明第四个目的是提供一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的试剂盒。本发明提供的试剂盒，为如下1)或2)1)所示的试剂盒由试剂盒A、试剂盒B和试剂盒C组成；所述试剂盒A为含有所述PCR试剂中的试剂A的试剂盒；所述试剂盒B为含有所述PCR试剂中的试剂B的试剂盒；所述试剂盒C为含有所述PCR试剂中的试剂C的试剂盒；2)所示的试剂盒为含有所述的试剂的试剂盒；所述突变位点为L1014F或L1014C。所述引物或所述试剂或所述试剂盒在检测中华按蚊中kdr基因突变位点、检测中华按蚊抗药性或制备检测中华按蚊抗药性产品中的应用也是本发明保护的范围；所述突变位点具体为L1014F或L1014C，所述抗药性为抗菊酯类药物；所述菊酯类药物具体为溴氰菊
酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。本发明第五个目的是提供一种检测或辅助检测中华按蚊中kdr基因的突变位点的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤用所述引物或所述试剂或所述试剂盒中的所述引物组A、引物组B和引物组C分别对待测中华按蚊进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测各组引物扩增得到的产物，若所述引物组B扩增得到169bp产物，且所述引物C未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014F ；若所述引物组C扩增得到169bp产物，且所述引物B未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因的突变位点为或候选为L1014C ；若所述引物组A扩增得到169bp产物，且所述引物组B和所述引物组C均未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因不含或候选不含有所述突变位点。本发明第六个目的是提供一种检测或辅助检测中华按蚊中kdr基因的基因型的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤用所述引物或所述试剂或所述试剂盒中的所述引物组A引物组、引物组B引物组和引物组C引物组分别对待测中华按蚊进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测各组引物扩增得到的产物，若所述引物组B扩增得到169bp产物，且所述引物A和所述引物C均未扩增得到 169bp产物，则所述kdr基因为含有或候选含有突变位点L1014F的纯合型基因；若所述引物组C扩增得到169bp产物，且所述引物A和所述引物B未扩增得到 169bp产物，则所述kdr基因为含有或候选含有突变位点L1014C的纯合型基因；若所述引物组B和所述引物组C均扩增得到169bp产物，且所述引物A未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因为含有或候选含有突变位点L1014F和L1014C的杂合型基因；
若所述引物组A扩增得到169bp产物，且所述引物组B和所述引物组C均未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因为不含或候选不含有突变位点L1014F和L1014C的纯合
型基因；所述PCR扩增中，以待测中华按蚊的基因组DNA为模板；所述PCR扩增的退火温度为55°C -60°C，退火温度具体为55°C ；所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。本发明的技术原理在中华按蚊Kdr基因突变的基础上，以突变位点的碱基为3' 末端，设计三条特异性内引物O种突变型和1种非突变型)，分别只能与2种突变的靶DNA 及非突变的靶DNA结合。同时，在突变碱基上下游处设计两条非特异性外引物，利用Taq酶缺乏3' -5'外切酶活性的特点，在以突变型引物扩增正常DNA模板时，延伸反应会因磷酸酯键难于形成而不能进行，也就得不到特异长度的条带，从而表明模板DNA无此突变。反之，表明有突变产生。将突变型和非突变型引物分别用于同一 DNA模板的扩增，判断有无特定位点基因的特定突变。本发明的实验证明，本发明提供的了一种快捷、简便、灵敏的中华按蚊kdr突变等位基因检测试剂盒，用来掌握中华按蚊与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关的kdr等位基因的状况。本发明的kdr突变等位基因检测试剂盒针对中华按蚊kdr等位基因的基因型，分别设计了 3组特异性引物，可以快速侦别中华按蚊的kdr基因型。采用本发明的kdr突变等位基因检测试剂盒，只需提取单只中华按蚊的DNA，因此对待测中华按蚊的数量没有特殊的要求，另外还无需中华按蚊的饲养场所和设施，也不需要投入长时间的人力物力来观察。被检样本能够准确、有效、直接地检测出点突变，能够鉴定个体基因型。判断kdr相关的基因型为研究德国小镰对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性奠定基础。
图1为AS-PCR设计原理2为中华按蚊的基因组1014位点kdr等位基因的检测结果图3为各种基因型频率与生物抗性表型的相关性
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、检测中华按蚊钠通道基因点突变方法的建立一AS-PCR法1、AS-PCR检测原理及引物设计AS-PCR的原理是根据蚊虫钠通道基因突变特点，以突变位点的碱基为引物的 3'末端，设计两条特异性引物(突变型和非突变型)，分别与突变的等位基因DNA序列及非突变的等位基因DNA序列结合。同时，在突变位点上下游分别设计两条非特异性外引物，利用Taq酶缺乏3' -5'外切酶活性的特点，在以突变型引物扩增正常DNA模板时，PCR反应会因磷酸酯键难于形成而不能进行延伸，也就得不到特异长度的条带，从而表明模板DNA 序列无此突变。反之，表明有突变产生。将突变型和非突变型引物分别用于同一样品等位基因序列的扩增，判断有无特定位点基因突变的等位基因序列。
根据中华按蚊钠通道基因II S4- II S6部分序列(kdr敏感基因cDNA序列，其部分核苷酸序列为序列10 (L1014在此序列的核苷酸序列为四3-四5位TTG)，其氨基酸序列为序列11 (L1014在此序列的氨基酸序列为第107位)，在GENBANK的登录号为JN002364，及抗性基因⑶NA序列(L1014F、L1014C)，设计一对非特异性外引物OTl和⑶2 (扩增对照条带)。L1014F的1014位点为3，末端，分别设计三条特异性内引物Cgd3、Cgd4和Cgd5 (扩增特异条带)。其中，Cgd3用于扩增非突变等位基因，Cgd4用于扩增突变F等位基因(TTT) 的第1014的氨基酸由亮氨酸突变为苯丙氨酸，Cgd5用于扩增突变C等位基因(TGT)的第 1014的氨基酸由亮氨酸突变为半胱氨酸，具体引物序列如下表1 :表1为AS-PCR引物序列表
引物名称序列(5’—3')
CDl (上游)TGATCGTGTTTCGCGTGCTG (序列 1，引物 1)
CD2 (下游)GTCTCGTTATCCGCCGTTGG (序列 2，弓丨物 2)
Cgd3 (上游) CCCGGTGGTAATTGGAAACTTG (序列 3，引物 3) Cgd4 (上游) TGCGGTGGTAATTGGAAACTTT (序列 4，弓丨物 4) _Cgd5 (上游)_TGCGGTGGTAATTGGAAACTGT (序列 5，引物 5)合成上述AS-PCR引物，PAGE纯化。2、AS-PCR 反应分别提取野外捕获的编号为1-6的中华按蚊的基因组DNA，备用，得到编号为1_6 的待测样本的DNA，分别将6种样品进行如下检测AS-PCR设计为平行三管法三个平行的PCR反应体系用于鉴定同一个体基因型， 一个反应体系(A管)引物为CDl、CD2、Cgd3，另一反应体系(B管)引物为CDl、CD2、Cgd4， 第三反应体系(C管)引物为⑶1、⑶2、Cgd5。若A管扩增出两条特异条带而B、C管只有一条带，则个体基因型为敏感纯合子(SQ ；若B管扩增出两条特异条带而A、C管只有一条带，则个体基因型为抗性纯合子(RR-F/F)，若C管扩增出两条特异条带而A、B管只有一条带，则个体基因型为抗性纯合子(RR-C/C)；若任意两管均扩增出两条特异条带而第三管只有一条带，则个体基因型为抗性杂合子(RR-F/C，RS-F, RS-C)；若三管同时扩增出两条特异条带，则试验污染。其原理如图1所示。A 管反应总体积 30 μ 1，包括 iTaq DNA Polymerase (TaKaRa, D7205) (0. 08U/ μ 1)0. 5 μ 1，10XPCR Buffer (TaKaRa) 3. 0 μ 1,4XdNTP (0. 17mM)2. 0μ 1，模板 DNA 1· 0μ 1， CDl (1. 33ng/ μ 1)0. 2 μ 1, CD2 (6ng/ μ 1)0. 9 μ 1, Cgd3 (6. 67ng/y 1) 1. 0 μ 1, ddH20 20. 5μ 1 ；B 管反应总体积 30 μ 1，包括 iTaq DNA Polymerase (TaKaRa, D7205) (0. 08U/ μ 1)0. 5 μ 1,10XPCR Buffer 3· 0 μ 1，4 X dNTP (0· 17mM) 2· 0 μ 1，模板 DNA 1. 0μ 1, CDl (1. 33ng/y 1)0. 2 μ 1, CD2 (6ng/ μ 1)0. 9 μ 1, Cgd4(6. 67ng/ μ 1) 1. 0 μ 1, ddH20 20. 5μ 1 ；C 管反应总体积 30 μ 1，包括 iTaq DNA Polymerase (TaKaRa, D7205) (0. 08U/ μ 1)0. 5 μ 1,10XPCR Buffer 3· 0 μ 1，4 X dNTP (0. 17mM) 2· 0 μ 1，模板 DNA 1. 0μ 1, CDl (1. 33ng/y 1)0. 2 μ 1, CD2 (6ng/ μ 1)0. 9 μ 1, Cgd5 (6. 67ng/ μ 1) 1. 0 μ 1, ddH2020. 5μ 1 ；反应条件为94 °C，8min ；94 "C，Imin, 55 "C，2min, 72 "C，2min, 40cycles ；72 °C， IOmin0若B扩增得到169bp产物，且A和C均未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因的突变位点为L1014F，所述kdr基因的基因型为RR ；RR表示纯合型突变的kdr基因。若C扩增得到169bp产物，且A和B均未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因的突变位点为L1014C，所述kdr基因的基因型为RR ；RR表示纯合型突变的kdr基因。若B和A均扩增得到169bp产物，且C未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因的突变位点为L1014F，所述kdr基因的基因型为RS ；RS表示杂合型突变的kdr基因。若C和A均扩增得到169bp产物，且B未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因的突变位点为L1014C，所述kdr基因的基因型为RS ；若A扩增得到169bp产物，且B和C均未扩增得到169bp产物，则所述kdr基因不存在突变位点，所述kdr基因的基因型为SS ；SS表示纯合型未突变的kdr基因。结果如图2所示，其中，1-6分别编号为1-6的中华按蚊，且每个编号的3条泳道从左到右均为A、B和C管，Marker为DNA Marker。263bp为非特异性外引物的扩增带(由 CDl和CD2扩增得到对照PCR产物，测序为序列6)，169bp为特异性内引物的扩增带(分别由CD2和Cgd3、Cgd4或Cgd5扩增得到)。编号为1的中华按蚊仅A管中有长度为169bp的片段1 (经过测序，为序列7，其中第20-22位核苷酸为TTG)，说明这一样本不存在kdr突变基因，为kdr敏感纯合子SS，存在纯合型未突变的kdr基因；编号为2的中华按蚊仅B管中有长度为169bp的片段(经过测序，为序列8，自5’ 末端第20-22位核苷酸为TTT)，说明这一样本为kdr突变基因的纯合子；说明存在纯合型突变的kdr基因，kdr基因的突变位点为L1014F。编号为3的中华按蚊仅C管中有长度为169bp的片段(经过测序，为序列9，自5’ 末端第20-22位核苷酸为TGT)，说明这一样本为kdr突变基因的纯合子；说明存在纯合型突变的kdr基因，kdr基因的突变位点为L1014C。编号为4的中华按蚊在B管和C管中同时出现长度为169bp的片段(经过测序， B管为序列8、C管为序列9)，说明这一样本为说明这一样本为F型突变和C型突变同时存在于一个个体的抗性杂合子.编号为5的中华按蚊在A管和C管同时出现长度为169bp的片段(经过测序，A管为序列7、C管为序列9)，说明这一样本为kdr突变基因的杂合子；说明这些为杂合型突变的kdr基因，kdr基因的基因型为RS，kdr基因的突变位点为L1014C。编号为6的中华按蚊在A管和B管中出现长度为169bp的片段(经过测序，B管为序列8、A管为序列7)，说明这一样本为kdr突变基因的杂合子；说明这些为杂合型突变的kdr基因，kdr基因的基因型为RS，kdr基因的突变位点为L1014F。如果有出现3管同时出现两个条带的现象，为非正常状况，可能存在其它新的突变或判为误差。所有样本已通过基因测序证明实验结果无误。实施例2、抗性试验
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中华按岐实验室敏感品系((susc印tible(k)mosquito) strain，记载在Song， F. L. , Χ. Μ. Cao, Τ. Y. Zhao, Y. D. Dong and B. L. Lu. 2007. Pyrethroid resistance and distribution of kdr allele in Culex pipiens pallens in north China. Int J Pest Manag 53 :25-34.，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得) 来自军事医学科学院微生物流行病研究所昆虫饲养室，隔离养殖十年以上，从未接触过任何杀虫剂。中华按蚊自然种群包括中华按蚊幼虫抗性组，采自江苏省的徐州、淮阴、常熟、南京、苏州等5个地区；现场采集的幼虫数量较多时，直接进行幼虫生测，数量不够的带回实验室繁殖，利用第一代幼虫进行生物测试。1、用于幼虫致死中浓度测试的按蚊成蚊5个自然种群中华按蚊品系及编号分别是江苏徐州品系(XZ)，江苏淮阴品系 (HY)，江苏南京品系(NJ)，江苏苏州品系(SZ)和江苏常熟品系(CS)(表2)。这5个自然种群中华按蚊采自2009年7月至9月和2010年7月至9月。中华按蚊成蚊自现场采集后带回实验室昆虫饲养室饲养，蚊虫养殖均在相对稳定温度( 士 1°C )、相对湿度80 士 5%、光照12h/d的条件下饲养。将实验室敏感品系及5个地方采集自然种群尖音库蚊的幼虫做毒力测定。采用浸渍法，将杀虫剂原药(溴氰菊酯(95%，江苏扬农化工股份有限公司)；Es-生物丙烯菊酯 (93%，法国罗素-优克福公司)；氯菊酯(92%，南京军区军事医学研究所)；高效氯氰菊酯 (97%，天津农药股份有限公司)用丙酮配制成5-7个浓度，容器中加199ml过夜清水，放入 25头4龄初期幼虫，加Iml不同梯度浓度的药液。Iml丙酮作对照，重复3次，24h观察结果，以幼虫不能逃避机械刺激为死亡。本研究使用高效氯氰菊酯对5个自然种群的中华按蚊及实验室敏感品系的致死中浓度(LC50)进行了测定(表3)。以敏感品系为参照，野外种群LC50除以敏感种群LC50 即为抗药性指数(R/S)。表2为幼虫相关抗性组中华按蚊种群现场采样点的分布
权利要求
1.一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的引物，由引物组A、引物组B和引物组C组成所述引物组A包括引物2和引物3，所述引物2和引物3的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列3 ；所述引物组B包括引物2和引物4，所述引物2和引物4的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列4 ；所述引物组C包括引物2和引物5，所述引物2和引物5的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列5。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于所述引物组A还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1 ； 所述引物组B还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1 ； 所述引物组C还包括引物1，所述引物1的核苷酸序列为序列表中序列1。
3.根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于 所述引物组A由引物1、2和3组成；所述引物组B由引物1、2和4组成； 所述引物组C由引物1、2和5组成； 所述引物组A、所述引物组B和所述引物组C均为独立包装； 所述突变位点为L1014F或L1014C。
4.一种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的PCR试剂，由试剂A、试剂B和试剂C组成；所述试剂A由所述引物组A和PCR缓冲液组成； 所述试剂B由所述引物组B和PCR缓冲液组成； 所述试剂C由所述引物组C和PCR缓冲液组成； 所述引物1在其对应的所述试剂中的终浓度均为1. 33ng/yl ； 所述引物2在其对应的所述试剂中的终浓度为eng/μ 1 ； 所述引物3-5在其对应的所述试剂中的终浓度均为6. 67ng/yl ； 所述突变位点为L1014F或L1014C。
5.一种制备检测中华按蚊中kdr基因突变位点的试剂的方法，包括如下步骤1)分别将权利要求1-3中任一所述的引物中的所述引物组A、所述引物组B和所述引物组C进行独立包装，得到独立包装引物组A、独立包装引物组B和独立包装引物组C ；2)再将步骤1)得到的独立包装引物组A、步骤1)得到的独立包装引物组B和步骤1) 得到的独立包装引物组C进行包装，得到试剂；所述突变位点为L1014F或L1014C。
6.由权利要求5所述的方法制备的试剂。
7.—种检测中华按蚊中kdr基因突变位点的试剂盒，为如下1)或2) 1)所示的试剂盒由试剂盒A、试剂盒B和试剂盒C组成；所述试剂盒A为含有权利要求4所述PCR试剂中的试剂A的试剂盒； 所述试剂盒B为含有权利要求4所述PCR试剂中的试剂B的试剂盒； 所述试剂盒C为含有权利要求4所述PCR试剂中的试剂C的试剂盒；2)所示的试剂盒为含有权利要求6所述的试剂的试剂盒； 所述突变位点为L1014F或L1014C。
8.权利要求1-3中任一所述引物或权利要求4或6所述试剂或权利要求7所述试剂盒在检测中华按蚊中kdr基因突变位点、检测中华按蚊抗药性或制备检测中华按蚊抗药性产品中的应用；所述突变位点具体为L1014F或L1014C，所述抗药性为抗菊酯类药物；所述菊酯类药物具体为溴氰菊酯、氯菊酯或高效氯氰菊酯。
9.一种检测或辅助检测中华按蚊中kdr基因的突变位点的方法，包括如下步骤 用权利要求1-3中任一所述引物或权利要求4或6所述试剂或权利要求7所述试剂盒中的所述引物组A、引物组B和引物组C分别对待测中华按蚊进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测各组引物扩增得到的产物，若所述引物组B扩增得到169bp产物，且所述引物C未扩增得到169bp产物，则所述 kdr基因的突变位点为或候选为L1014F ；若所述引物组C扩增得到169bp产物，且所述引物B未扩增得到169bp产物，则所述 kdr基因的突变位点为或候选为L1014C ；若所述引物组A扩增得到169bp产物，且所述引物组B和所述引物组C均未扩增得到 169bp产物，则所述kdr基因不含或候选不含有所述突变位点。
10.一种检测或辅助检测中华按蚊中kdr基因的基因型的方法，包括如下步骤用权利要求1-3中任一所述引物或权利要求4或6所述试剂或权利要求7所述试剂盒中的所述引物组A、引物组B和引物组C分别对待测中华按蚊进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测各组引物扩增得到的产物，若所述引物组B扩增得到169bp产物，且所述引物A和所述引物C均未扩增得到169bp 产物，则所述kdr基因为含有或候选含有突变位点L1014F的纯合型基因；若所述引物组C扩增得到169bp产物，且所述引物A和所述引物B未扩增得到169bp 产物，则所述kdr基因为含有或候选含有突变位点L1014C的纯合型基因；若所述引物组B和所述引物组C均扩增得到169bp产物，且所述引物A未扩增得到 169bp产物，则所述kdr基因为含有或候选含有突变位点L1014F和L1014C的杂合型基因； 若所述引物组A扩增得到169bp产物，且所述引物组B和所述引物组C均未扩增得到 169bp产物，则所述kdr基因为不含或候选不含有突变位点L1014F和L1014C的纯合型基因；所述PCR扩增中，以待测中华按蚊的基因组DNA为模板； 所述PCR扩增的退火温度为55°C -60°C，退火温度具体为55°C ； 所述检测PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。
全文摘要
本发明公开了一种中华按蚊抗药性AS-PCR检测试剂盒及其专用引物。本发明提供的检测中华按蚊中kdr基因突变位点的引物，由引物组A、引物组B和引物组C组成所述引物组A包括引物2和引物3，所述引物2和引物3的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列3；所述引物组B包括引物2和引物4，所述引物2和引物4的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列4；所述引物组C包括引物2和引物5，所述引物2和引物5的核苷酸序列分别为序列表中序列2和序列表中序列5。本发明的实验证明，本发明提供的了一种快捷、简便、灵敏的中华按蚊kdr突变等位基因检测试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102373280SQ201110343929
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者刘美德, 张映梅, 李春晓, 汪中明, 董言德, 谭伟龙, 赵彤言, 邢丹, 郭晓霞 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所