专利名称：组合使用Cry1Ca 和Cry1Ab 蛋白用于昆虫抗性管理的制作方法
组合使用CryICa和CryIAb蛋白用于昆虫抗性管理
背景技术：
人类种植谷物用于粮食和能源应用。人类还种植许多其它的作物，包括大豆和棉花。昆虫吃掉并毁坏植物从而破坏了人类的努力。人们每年要花费数十亿美元用于控制害虫，并且它们还会造成另外数十亿美元的损失。合成的有机化学杀虫剂为用于控制害虫的主要工具，但是在一些区域，生物杀虫剂，例如来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis) (BT)的杀虫蛋白，发挥着重要的作用。通过转化Bt杀虫蛋白基因产生昆虫抗性植物的能力给现代农业带来了革命，并提高了杀虫蛋白及其基因的重要性和价值。已经有数种Bt蛋白用于产生抗昆虫的转基因植物，它们现在已经被成功地注册 并商业化。这些包括谷物/玉米(corn)中的CrylAb, CrylAc, CrylFa和Cry3Bb,棉花中的CrylAc和Cry2Ab,和马铃薯中的Cry3A。表达这些蛋白的商业产品表达单一的蛋白，但是在如下情况下例外，即期望2种蛋白的组合杀虫谱(例如在玉米中组合CrylAb和Cry3Bb以分别提供对鳞翅目害虫和食根昆虫的抗性)，或者蛋白的独立作用使它们可用作在易感昆虫群体中延迟抗性产生的工具(例如在棉花中组合CrylAc和Cry2Ab以提供对烟草青虫(tobacco budworm)的抗性管理)。也就是说，昆虫抗性转基因植物的一些品质虽然使这种技术被快速而广泛地采用，但是也带来了担忧，即害虫群体可能对这些植物所产生的杀虫蛋白产生抗性。已经提出了多种策略用于防止(preserve)基于Bt的昆虫抗性性状的效用，包括以高剂量使用蛋白质并与避难所组合，不同毒素交替使用或者共使用(McGaughey等.(1998)，“B.t. Resistance Management,，，Nature Biotechnol. 16:144-146)。被选择用于昆虫抗性管理(IRM)混杂的蛋白质需要独立地发挥其杀虫效果，从而对一种蛋白质产生的抗性不会赋予对第二种蛋白质的抗性(即对于蛋白质无交叉抗性)。如果例如选择对“蛋白A”有抗性的害虫群体对“蛋白B”敏感，则人们可以得出结论，蛋白A和蛋白B无交叉抗性并且它们的组合可有效延迟对单一蛋白A的抗性。当没有抗性昆虫群体时，可以基于假定与作用机制和交叉抗性潜力相关的其它特征进行评估。已经有提议使用受体介导的结合来鉴定可能不会显示交叉抗性的杀虫蛋白(van Mellaert等1999)。在这种方法中固有的缺少交叉抗性的关键预测子(predictor)是杀虫蛋白在敏感昆虫物种中不会竞争受体。在两种B. t. Cry毒素竞争相同受体的情况下，如果昆虫中的受体发生突变使得毒素之一不再与该受体结合从而对该昆虫不再具有杀虫性，则也可能的情况是昆虫对第二种毒素(其竞争性结合相同的受体)也有抗性。然而，如果两种毒素结合两种不同的受体，这可以指示昆虫不会同时对这两种毒素具有抗性。CrylAb是目前用于转基因玉米中保护植物免于各种昆虫害虫的杀虫蛋白。CrylAb提供保护的关键谷物害虫是欧洲玉米螟。在官方B. t.命名委员会的网站上列出了其它的Cry毒素(Crickmore等；lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。参见所附的附录 A。当前有接近60个主要的“Cry”毒素组(Cryl_Cry59)，还有额外的Cyt毒素和VIP毒素等。各数字组中的很多还有大写字母的亚群，并且大写字母亚群又有小写字母的子亚群。(例如，Cryl具有A-L，而 CrylA 具有 a_i)。
发明内容
本发明部分地涉及一项令人惊讶的发现，即CrylCa对蔗螟，包括对CrylAb有抗性的蔗螟群体非常有活性。本领域的技术人员会意识到此发现的益处，可产生CrylCa和CrylAb (包括其杀虫部分)的植物可用于延迟或防止对这些杀虫蛋白单独的任何一个产生抗性。例如，crylFa基因也可与这两个基础配对基因/蛋白混杂。本发明还涉及一项发现，即CrylCa和CrylAb彼此不会竞争结合来自秋粘虫(Spodoptera frugiperda;FAff)的肠受体。附图
简述
图I-CrylAb核心毒素、CrylCa核心毒素和1251-标记的CrylCa核心毒素蛋白对 秋粘虫BBMV’ s的竞争结合。图2-CrylCa核心毒素、CryIAb核心毒素和1251-标记的CrylAb核心毒素蛋白对秋粘虫BBMV’ s的竞争结合。序列简述SEQ ID NO: I-CrylCa 核心 /CrylAb 原毒素嵌合蛋白 1164aa(DIG_152)SEQ ID NO: 2-CrylCa 核心毒素SEQ ID NO:3-CrylAb 核心毒素发明详述本发明部分地涉及令人惊讶的发现，即CrylCa对于针对CrylAb有抗性的蔗螟(SCB;Diatraea saccharalis)群体非常有活性。因此，本发明部分地涉及令人惊讶的发现，即CrylCa可用于与CrylAb组合或“混杂”，从而阻止SCB对这些杀虫蛋白的任何单独一个产生抗性。换言之，本发明部分地涉及令人惊讶的发现，即选择对CrylAb有抗性的蔗螟群体对CrylCa无抗性；对CrylAb毒素有抗性的鹿螟对CrylCa易感(即无交叉抗性)。因此，本发明包括使用CrylCa毒素控制对CrylAb有抗性的鹿螟群体。本领域的技术人员会意识到本公开的益处,表达CrylCa和CrylAb (包括其杀虫部分)的植物可用于延迟或防止对这些杀虫蛋白的任何单独一个产生抗性。本发明包括使用CryICa保护甘蔗和其它重要经济植物物种免于由蔗螟或者由已经对CrylAb产生抗性的蔗螟群体导致的损害和收得率损失(yield loss)。蔗螟也可为谷物/玉米的害虫。在一些中美洲和南美洲国家(如巴西和阿根廷)更是如此。因此，例如谷物/玉米也可以根据本发明得到保护。因此，本发明教导了一种昆虫抗性管理(IRM)混杂，用以防止或减缓(mitigate)鹿螟对CrylAb和/或CrylCa产生抗性。此外，使用放射性标记的CrylCa和秋粘虫(Spodoptera frugipera) (FAff)昆虫组织的受体结合研究显示，CrylAb不会竞争CrylCa结合的高亲和性结合位点。这些结果表明，CrylAb和CrylCa的组合可以用作有效的手段，为产生CrylAb和CrylCa蛋白的植物(例如玉米和甘蔗)减缓昆虫群体(如FAW和SCB)对CrylAb和/或CrylCa产生抗性。尽管毒素叠加研究证明，CrylCa蛋白与来自秋粘虫(S. frugiperda)的BBMV’ s的两个蛋白结合，其中一个40kDa,另一个44 kDa,而CrylAb蛋白与150 kDa的单一蛋白结合(Aranda等，1996)，这与非竞争性结合研究无关。因此，本发明还包括CrylCa和CrylAb的组合，作为IRM混杂以延缓秋粘虫和/或蔗螟对其中任一蛋白产生抗性，或者延缓已对CrylAb产生抗性的蔗螟群体产生抗性。本发明提供了一种用于控制鳞翅类害虫的组合物，包含表达含有CrylCa核心毒素的蛋白和含有CrylAb核心毒素的蛋白的细胞；经转化以表达含有CrylCa核心毒素的蛋白和含有CrylAb核心毒素的蛋白的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞(本多核苷酸优选在遗传构建体中，在非苏云金芽孢杆菌启动子的控制之下(与之可操作连接/包含)；本多核苷酸可包含用于增强在植物中表达的密码子选择)；
一种控制鳞翅类害虫的方法，其包括使所述害虫或所述害虫的环境与有效量的可 产生含有CrylAb核心毒素的蛋白的组合物和表达含有CrylC核心毒素的蛋白的细胞相接触；一种植物(例如玉米植物或大豆或棉花或甘蔗)，其包含编码含有CrylCa核心毒素的蛋白的DNA和编码含有CrylAb核心毒素的蛋白的DNA，和所述植物的种子；一种植物(例如玉米植物或大豆或棉花或甘蔗)，其中编码含有CrylCa核心毒素的蛋白的DNA和编码含有CrylAb核心毒素的蛋白的DNA被渐渗入所述玉米植物，和所述植物的种子。我们证明，例如，CrylCa(来自重组突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株MR1206/DC639的蛋白；质粒pMYC2547)在人工饮食生物测试法中可以非常有效地控制经选择对CrylAb有抗性的鹿螟(SCB;Diatraea saccharalis)群体。这表明，CrylCa可用于控制已对CrylAb产生抗性的SCB群体，或减缓SCB群体中CrylAb抗性的产生。部分地根据本文描述的数据，共表达CrylCa和CrylAb能够产生高剂量的IRM混杂，用于控制SCB。可以向该组合添加其它蛋白以增加抗虫谱。例如，在谷物/玉米中，添加CrylFa可以产生对于欧洲玉米螟(ECB)Ostrinia nubilalis (Hiibner)的IRM混杂，而添加另外一种MOA用于控制SCB。关于CrylC作为植物中的潜在生物杀虫剂的综述见(Avisar等2009)。AvisarD, Eilenberg H，Keller M, Reznik N，Segal M, Sneh B，Zilberstein A (2009)The Bacillusthuringiensis delta—endotoxin CrylC as a potential bioinsecticide in plants.Plant Science 176:315-3240昆虫受体。如实施例中所述，使用放射性标记的CrylCa核心毒素蛋白的竞争受体结合实验显示，CrylAb核心毒素蛋白不竞争FAW昆虫组织中存在的结合CrylCa的高亲和性结合位点。这些结果表明，CrylAb和CrylCa蛋白的组合是减缓FAW群体对CrylAb产生抗性(和同样地，对CrylCa产生抗性)的有效手段，并且可在表达这两种蛋白质的谷物/玉米植物中增加对这种害虫的抗性水平。这些数据还提示，CrylCa可以有效控制已对CrylAb产生抗性的SCB群体。一种应用选择是在已经由于产生了抗性而使CrylAb不能有效控制SCB的地域使用这些Cry蛋白。另一种应用选择是CrylCa与CrylAb组合使用，从而减缓SCB对CrylAb产生抗性。
本发明所述的毒素的组合可用于控制鳞翅类害虫。成年鳞翅类，即蝶和蛾，主要以花蜜为食。幼虫，即毛虫，几乎全部以植物为食，并且许多是严重的害虫。毛虫在叶子上面或内部或者植物根或茎上进食，剥夺植物营养，并且常常会破坏植物的物理支撑结构。此外，毛虫还以果实、织物、储存的谷粒和面粉为食，使这些产品毁坏而不能出售或者严重降低其价值。如本文所使用的，鳞翅类害虫是指害虫的各个生命阶段，包括幼虫阶段。本发明的嵌合毒素包括B. t.毒素的完整核心N-端毒素部分，并且在毒素部分末端之后的某点，蛋白质具有向异源原毒素(protoxin)序列的转变。B. t.毒素的N端毒素部分在本文称作“核心”毒素。向异源原毒素区段的转变可以发生在毒素/原毒素连接点附近，或者可选择地，天然原毒素的一部分(延伸越过毒素部分)可以被保留，而向异源原毒素的转变发生在其下游。作为实例，本发明的一种嵌合毒素具有CrylAb的完整核心毒素部分(氨基酸1-601)和异源原毒素(氨基酸602至C端)。在一个优选实施方案中,包含原毒素的嵌合毒素的部分源自CrylAb蛋白毒素。作为第二个实例，本发明的第二种嵌合毒素，如SEQ ID N0:1(DIG-152)中公开的，具有CrylCa的完整核心毒素部分(氨基酸1_619)和异源原毒素(氨基酸620至C端)。在一个优选实施方案中，包含原毒素的嵌合毒素的部分源自CrylAb蛋白毒素。本领域的技术人员会意识到，B. t.毒素，甚至在某种类型的毒素如CryICa中，可以在一定程度上改变长度以及从毒素部分向原毒素部分转变的确切位置。通常，crylCa毒素长度为大约1150-大约1200个氨基酸。从毒素部分向原毒素部分的转变通常发生在全长毒素的大约50%-大约60%。本发明的嵌合毒素包括该核心N端毒素部分的完整区域(expanse)。因此,嵌合毒素包括全长crylCa或CrylAb B. t.毒素的至少大约50%。这通常为至少大约590个氨基酸。关于原毒素部分，CrylA(b)原毒素部分的完整区域从毒素部分的末端延伸到该分子的C端。这一部分的最后大约100-150个氨基酸是最关键的，应包含在本发明的嵌合毒素中。 基因和毒素根据本发明，有用的基因和毒素不仅包括公开的全长序列，还包括保留了本文特别例示的毒素的特征杀虫活性的这些序列的片段、变体、突变体和融合蛋白。如本文所使用的，术语基因的“变体”或“变异”是指编码相同毒素或者编码具有杀虫活性的等价毒素的核苷酸序列。如本文所使用的，术语“等价毒素”是指对靶害虫具有与所要求保护的毒素相同或基本上相同的生物活性的毒素。如本文所使用的，边界表示大约95% (CrylAb和ICa的)、78% (CrylA和CrylC的)和 45%(Cryl 的)序列同一性，参见 “Revision of the Nomenclature for theBacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins, , N. Crickmore, D. R. Zeigler, J.Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum,和 D. H. Dean. Microbiology andMolecular Biology Reviews (1998) Vol 62:807-813。这些截断值(cut offs)也可仅应用于核心毒素(对于CrylAb和CrylCa毒素)。所附的附录A中列出的GENBANK编号也可用于获得本文公开或提及的任何基因和蛋白的序列。本领域的技术人员应当显而易见，编码活性毒素的基因可以通过多种手段鉴定和获得。本文例示的特定基因或基因部分可以从在培养物保藏中心保藏的分离物获得，如上所述。这些基因或其部分或变体也可以通过例如使用基因合成仪合成构建。基因的变异可以使用用于制备点突变的标准技术容易地构建。另外，这些基因的片段可使用商业上可获得的外切核酸酶或内切核酸酶根据标准的程序进行制备。例如，可以使用酶如Bal31或定点诱变从这些基因的末端系统地切除核苷酸。另外，编码活性片段的基因可使用多种限制酶获得。可以使用蛋白酶直接获得这些毒素的活性片段。保留例示的毒素的杀虫活性的片段和等价物也在本发明的范围内。另外，由于遗传密码的冗余性，多种不同的DNA序列可编码本文公开的氨基酸序列。本领域的技术人员完全可以生成这些编码相同的或者基本上相同的毒素的可替换的DNA序列。这些变体DNA序列也在本发明的范围内。如本文所使用的，“基本上相同的”序列是指具有不会实质上影响杀虫活性的氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列。保留了杀虫活性的片段也包含在这个定义内。 另一种用于鉴定根据本发明有用的编码毒素的基因和基因部分的方法是通过使用寡核苷酸探针。这些探针是可检测的核苷酸序列。这些序列可以通过用合适的标记加以检测或者可制成固有地发荧光，如国际申请No. W093/16094中所述。如本领域众所熟知的，如果探针分子与核酸样品通过在两分子之间形成强键而杂交，则有理由假定，探针和样品具有相当的同源性。优选地，杂交通过本领域众所周知的技术在严格条件下进行，如例如在Keller, G. H. , M. M. Manak(1987)DNA Probes, Stockton Press, New York, N. Y, pp. 169-170中所述。盐浓度和温度组合的一些实例如下(按照严格性增强的顺序)2X SSPE或SSC在室温；1X SSPE 或 SSC 在 42°C ；0. IX SSPE 或 SSC 在 42°C ；0. IX SSPE 或 SSC 在 65°C。探针的检测提供了一种用已知的方式确定杂交是否发生的方法。这种探针分析提供了用于鉴定本发明毒素编码基因的快速方法。根据本发明用作探针的核苷酸区段可以用DNA合成仪和标准的步骤合成。这些核苷酸序列也可以用作PCR引物以扩增本发明的基因。本文特别例示了本发明的某些毒素。因为这些毒素仅仅是本发明毒素的实例，因此应当显而易见，本发明包括具有与例示毒素相同或相似杀虫活性的变体或等价毒素(和编码等价毒素的核苷酸序列)。等价毒素与例示毒素具有氨基酸同源性。该氨基酸同源性通常为大于75%，优选大于90%，最优选大于95%。氨基酸同源性在毒素的关键区域最高，所述关键区域决定其生物活性或者涉及最终负责生物活性的三维构型的确定。在此方面，某些氨基酸取代是可以接受的，并且如果这些取代位于对于活性非关键的区域内或者是不影响分子三维构型的保守氨基酸取代的话，其是可以预期的。例如，氨基酸可以在下面的分类中被替换非极性、极性不带电荷、碱性和酸性。只要取代不会实质改变化合物的生物活性，一个类型的氨基酸被相同类型的另一种氨基酸代替的保守取代就属于本发明的范围。表I提供了属于每种类型的氨基酸的实例的列表。
氨基酸类型氨基酸实例
非极性Ala，Val, Leu, He, Pro, Met, Phe，Trp
极性不带电荷Gly，Ser，Thr，Cys, Tyr，Asn, Gln
酸性Asp，Glu
权利要求
1.ー种转基因植物，包括编码CrylC杀虫蛋白的DNA和编码CrylAb杀虫蛋白的DNA。
2.权利要求I的植物的种子。
3.权利要求I的转基因植物，其中编码CrylCa杀虫蛋白的DNA和编码CrylAb杀虫蛋白的DNA被渐渗到所述植物中。
4.权利要求3的植物的种子。
5.ー块植物田，包括非-Bt避难所(refuge plant)植物和多个权利要求I的转基因植物，其中所述避难所植物占所述田地中全部作物植物的少于40%。
6.权利要求5的植物田，其中所述避难所植物占所述田地中全部作物植物的少于30%。
7.权利要求5的植物田，其中所述避难所植物占所述田地中全部作物植物的少于20%。
8.权利要求5的植物田，其中所述避难所植物占所述田地中全部作物植物的少于10%。
9.权利要求5的植物田，其中所述避难所植物占所述田地中全部作物植物的少于5%。
10.权利要求5的植物田，其中所述避难所植物成块状或条状种植。
11.一种种子混合物，包括来自非Bt避难所植物的避难所种子和多个权利要求7的种子，其中所述避难所种子占混合物中全部种子的少于40%。
12.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占混合物中全部种子的少于30%。
13.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占混合物中全部种子的少于20%。
14.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占混合物中全部种子的少于10%。
15.权利要求11的种子混合物，其中所述避难所种子占混合物中全部种子的少于5%。
16.—种管理昆虫对Cry毒素产生抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生权利要求5的植物田。
17.权利要求I的植物，所述植物进ー步包含编码含有CrylFa核心毒素的蛋白质的DNA。
18.ー块植物田，包括非-Bt避难所植物和多个权利要求17的玉米植物，其中所述避难所植物占所述田地中全部作物植物的少于大约20%。
19.ー块植物田，包括多个权利要求17的植物，其中所述田地包含少于大约10%的避难所植物。
20.—种管理昆虫对Cry毒素产生抗性的方法，所述方法包括种植种子以产生权利要求19的植物田。
21.一种控制鳞翅类害虫的组合物，包含表达有效量的含CrylAb核心毒素的蛋白质和含CrylC核心毒素的蛋白质的细胞。
22.权利要求21的组合物，包含经转化以表达含CrylAb核心毒素的蛋白质和含CrylC核心毒素的蛋白质的宿主，其中所述宿主是微生物或植物细胞。
23.—种控制鳞翅类害虫的方法，包括向所述害虫或所述害虫的环境提供有效量的权利要求21的组合物。
24.权利要求5或18的田地，其中所述植物占地超过10英亩。
25.权利要求1、3和17中任ー项的植物，其中所述植物选自玉米、大豆、甘蔗和棉花。
26.权利要求1、3和17中任ー项的植物，其中所述植物是玉米植物。
27.权利要求1、3、17、25和26中任ー项的植物的植物细胞，其中所述植物细胞包含编码所述CrylC杀虫蛋白的所述DNA和编码所述CrylAb杀虫蛋白的所述DNA,其中所述CrylC杀虫蛋白与SEQ ID NO: 2是至少99%同一的，而所述CrylD杀虫蛋白与SEQ ID NO: 3是至少99%同一的。
28.权利要求1、3、17、25和26中任ー项的植物，其中所述CrylC杀虫蛋白包含SEQ IDNO: 2，而所述CrylAb杀虫蛋白包含SEQ ID NO: 3。
全文摘要
本发明包括用于控制鳞翅类昆虫的方法和植物，所述植物包含Cry1Ca杀虫蛋白和Cry1Ab杀虫蛋白的组合，以延迟或防止昆虫产生抗性。
文档编号C12N15/82GK102803495SQ201080063909
公开日2012年11月28日 申请日期2010年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者T.米德, K.纳瓦, N.P.斯托尔, J.J.希茨, A.T.伍斯利, S.L.伯顿 申请人:陶氏益农公司