专利名称：用于生产尸胺的方法和重组微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含提高尸胺生产的去调控(deregulated)形式的DNA分子的重组微生物的用途，以及用于产生所述微生物的重组DNA分子和多肽，所述微生物包含细胞内赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性。本发明也涉及使用重组微生物生产尸胺的方法。
现有技术JP 2002223770公开了通过将赖氨酸脱羧基因和/或赖氨酸-尸胺逆向转运体基因引入产赖氨酸的微生物，从而生产尸胺的方法。
JP 2004222569公开了通过培养具有L-赖氨酸脱羧酶活性和高丝氨酸营养缺陷型的重组棒状杆菌，生产尸胺的方法。WO 2007113127公开了通过培养具有去调控的L-赖氨酸脱羧酶活性的重组棒状杆菌，检测尸胺乙酰基转移酶及其提高尸胺生产的缺失，生产尸胺的方法。WO 2008092720公开了通过发酵表达细胞内表达的脱羧酶的高产量产赖氨酸微生物，生产尸胺的方法。其中这样的微生物可能具有降低的或消除的赖氨酸/尸胺逆向转运体的表达。发明概述在一个方面，本发明提供了微生物，其具有细胞内赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性，或具有细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性，或具有细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性。在另一个方面，本发明提供了如上所述的微生物和通过培养如上所述的所述微生物生产尸胺的方法，其中所述微生物的细胞内赖氨酸脱羧酶活性、或细胞外赖氨酸脱羧酶活性、或细胞内和细胞外脱羧酶活性至少部分是由于表达至少一种多肽，所述多肽是cadA赖氨酸脱羧酶或IdcC赖氨酸脱羧酶的同系物。在另一方面，本发明提供了具有细胞内赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性，或具有细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性，或具有细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性的微生物，其中增强的赖氨酸输入活性是由于增强的赖氨酸通透酶活性或增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性。在另一方面，本发明提供了如上所述的微生物，其中增强的赖氨酸输入活性是由于减少或消除赖氨酸输出多肽的表达，或由于增强的赖氨酸通透酶活性，或由于增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性或其任意组合。在另一方面，本发明提供了如上所述的微生物，其中IysE多肽的活性被降低，或其中赖氨酸通透酶多肽的活性被增强，或其中赖氨酸/尸胺逆向转运体多肽的活性被增强，或具有降低的IysE多肽活性、增强的赖氨酸通透酶多肽活性或增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体多肽活性的任意组合。
在另一方面，本发明提供了微生物，其具有上述特征的任意组合并不具有或具有降低的乙酰尸胺形成活性，或不具有或具有降低的氨丙基尸胺形成活性，或不具有或具有降低的高丝氨酸脱氢酶活性，或不具有或具有降低的赖氨酸降解活性，或其中至少2种这些活性不存在或被降低。在另一个方面，本发明提供了具有上述特征的任意组合的微生物，其中NP_600742蛋白、或亚精胺合酶蛋白、或高丝氨酸脱氢酶蛋白、或赖氨酸羟化酶蛋白的活性，或其中这些蛋白质的任意组合的活性被降低。在另一个方面，本发明提供了微生物，其具有去调控的亚精胺形成或摄取活性、或去调控的腐胺形成或摄取活性或其任意组合。在另一个方面，本发明提供了具有上述特征的微生物，其中所述微生物属于真细菌分支(clade Eubacteria),例如棒状杆菌(Corynebacterium)或埃希氏菌(Escherichia)属，特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或大肠杆菌(Escherichia coli)种。 在另一个方面，本发明提供了尸胺生产系统，其包含具有上述特征的微生物和含有赖氨酸的培养基。在另一个方面，本发明提供了用于生产尸胺的方法，其包括在包含赖氨酸或不含赖氨酸的培养基中发酵任一种上述微生物。在另一个方面，本发明提供了一种方法，其中培养基包含至少0. 25mol/l的尸胺，但不超过0. lmol/1的乙酰尸胺或超过0. lmol/1的氨丙基尸胺，或其中在培养基中的尸胺浓度(mol/1)是乙酰尸胺的百分比(重量/体积)的至少I. 2倍，或是氨丙基尸胺的百分比(重量/体积)的至少I. 2倍。在另一个方面，本发明提供了培养基，其包含至少0.25mol/的尸胺，但包含不超过0. lmol/1的乙酰尸胺或不超过0. lmol/1的氨丙基尸胺，或提供了下述培养基，其中尸胺的浓度(mol/1)是乙酰尸胺的浓度(mol/1)的至少I. 2倍，或是氨丙基尸胺浓度(mol/1)的至少I. 2倍。在另一个方面，本发明提供了任一种上述微生物用于生产尸胺的用途，或在生产尸胺的方法中的用途。在另一个方面，本发明提供了通过任一种上述微生物的发酵产生的发酵液、或具有高浓度的尸胺和低浓度的乙酰尸胺或低浓度的氨丙基尸胺的发酵液，其用于回收尸胺的用途。在另一个方面，本发明提供了微生物，其具有将半纤维素来源的戊糖转化为精细化学品如尸胺或赖氨酸的特征。附图
简述图I是在谷氨酸棒状杆菌中的DAP生物合成途径的示意图，其中包括尸胺乙酰化的步骤。发明详述在以下描述中，大量使用了一些术语。此处提供定义以便于理解本发明。术语尸胺表不I, 5-戍二胺(1，5-diaminopentane) (CAS 号462-94-2)。本发明的方法以重组微生物为特征，其优选地包括如本文描述的载体或基因(例如，野生型和/或突变的基因)，和/或以导致尸胺产生的方式培养。术语“重组”微生物包括与其来源的天然存在的微生物相比，已被遗传改变、修饰或改造(例如，遗传改造)，从而使其展示改变的、修饰的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)的微生物(例如，细菌、酵母细胞、真菌细胞等)。启动子。引导结构基因转录产生mRNA的DNA序列。一般启动子位于基因的5'区，靠近结构基因的起始密码子。如果启动子是诱导型启动子，那么转录率响应诱导剂而增力口。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录率不受诱导剂调控。增强子。一种启动子元件。增强子可增加特定基因转录为mRNA的效率，这与增强子相对转录起始位点的距离或方向无关。克隆载体。一种DNA分子，如质粒、粘粒、噬菌粒或噬菌体，其具有在宿主细胞中自主复制的能力且其被用于转化细胞以操纵基因。克隆载体一般包含一个或少数限制性内切酶识别位点(在这些位点可以可检测的方式插入外源DNA序列而不丢失载体的基本生物学 功能)，以及适用于鉴定和选择用克隆载体转化的细胞的标记物基因。标记物基因一般包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。表达载体。包含编码外源蛋白质的克隆的结构基因的DNA分子，其提供外源蛋白质在重组宿主中的表达。一般，将克隆基因的表达置于特定调控序列(如启动子和增强子序列)的控制之下(即，与其有效连接)。启动子序列可为组成型或诱导型的。重组宿主。重组宿主可为包含克隆载体或表达载体的任意原核或真核细胞。此术语也旨在包括已被遗传改造从而在宿主细胞的染色体或基因组中包含克隆基因的原核或真核细胞。有关合适的宿主的实例，见Sambrook等人，MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)["Sambrook"]。术语“表达”指基因产物在一定水平上的表达(例如，在本申请中定义和描述的途径或反应的基因的生物合成酶)，在此水平上产生的所编码的此蛋白质的酶活性，或此蛋白质涉及的途径或反应允许代谢流通过表达此基因/途径的生物中的此途径或反应。可通过遗传改变用作起始生物的微生物实现表达。在一些实施方案中，可遗传改变(例如，遗传改造)微生物，从而在相对起始微生物或未被改变的可比微生物的生产水平提高的水平上表达基因产物。遗传改变包括，但不限于，改变或修饰与特定基因的表达相关的调控序列或位点(例如，通过添加强启动子、诱导型启动子或多个启动子，或通过去除调控序列使得表达为组成型)，修饰特定基因的染色体位置，改变特定基因的相邻核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子，增加特定基因的拷贝数，修饰参与特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译的蛋白质(例如，调控蛋白，抑制物，增强物，转录激活物等)，或使用本领域的例行操作去调控特定基因的表达的任意其他常规手段(包括但不限于使用反义核酸分子，例如，以阻断阻抑蛋白的表达)。在一些实施方案中，可改变微生物的生理或环境，以在相对起始微生物的基因产物表达水平增加或降低的水平上表达基因产物。例如，可用已知或疑似提高特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译的试剂处理微生物，或在所述试剂的存在下培养微生物，从而增强或提高转录和/或翻译。可选地，可在选择的提高特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译的温度下培养微生物，从而增强或提高转录和/或翻译。
术语“去调控”指改变或修饰微生物中的至少一个基因，其中所述改变或修饰导致相对没有改变和修饰的尸胺生产，在微生物中的尸胺生产的效率增加。在一些实施方案中，改变或修饰的基因编码在生物合成途径中的酶或转运蛋白，使得在微生物中的生物合成酶的水平或活性被改变或修饰，或转运特异性或效率被改变或修饰。在一些实施方案中，改变和修饰编码在生物合成途径中的酶的至少一个基因，使得所述酶的水平或活性相对未改变或野生型基因存在时的水平提高或增加。去调控也包括改变一个或多个基因的编码区以得到反馈抗性的酶或具有更高或更低比活的酶。又例如，去调控还包含编码转录因子(例如激活物、阻抑物)的基因的遗传改变，所述转录因子调控编码 酶或转运蛋白的基因的表达。术语“过表达”指在比起始微生物的遗传改变前存在的水平更高水平上的基因产物的表达，特别是增强基因产物的表达(例如，赖氨酸生物合成酶，或硫酸盐还原途径酶，或半胱氨酸生物合成酶，或在本申请中定义和描述的基因或途径或反应)。在一些实施方案中，可将微生物遗传改变(例如，遗传改造)从而在相对起始微生物的生产水平提高的水平上表达基因产物。遗传改变包括，但不限于，改变或修饰与特定基因的表达相关的调控序列或位点(例如，通过添加强启动子、诱导型启动子或多个启动子，或通过去除调控序列使得表达为组成型)，修饰特定基因的染色体位置，改变特定基因的相邻核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子，增加特定基因的拷贝数，修饰参与特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译的蛋白质(例如，调控蛋白，抑制物，增强物，转录激活物等)，或使用本领域的例行操作去调控特定基因的表达的任意其他常规手段(包括但不限于使用反义核酸分子，例如，以阻断阻抑蛋白的表达)。过表达基因产物的另一种方式是增强基因产物的稳定性，从而增加其寿命。在Eikmanns等人(Gene. (1991) 102,93-8)中可找到在生物(如谷氨酸棒状杆菌)中过表达基因的实例。术语“去调控的”包括在低于或高于操纵微生物前或未经操纵的可比微生物中的表达水平的基因产物(例如，赖氨酸脱羧酶)的表达。在一个实施方案中，微生物可被遗传操纵(例如，遗传改造)为在低于或高于操纵微生物前或未经操纵的可比微生物中的表达水平上表达的基因产物。遗传操纵可包括，但不限于，改变或修饰与特定基因的表达相关的调控序列或位点(例如，通过去除强启动子、诱导型启动子或多个启动子)，修饰特定基因的染色体位置，改变特定基因的相邻核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子，减少特定基因的拷贝数，修饰参与特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译的蛋白质(例如，调控蛋白，抑制物，增强物，转录激活物等)，或本领域例行操作的去调控特定基因的表达的任意其他常规手段(包括但不限于使用反义核酸分子，或敲除或阻断靶蛋白表达的其他方法)。术语“去调控的基因活性”，例如去调控的赖氨酸脱羧酶，也表示基因活性，例如将赖氨酸脱羧酶活性引入以前未观察到相应基因活性，例如赖氨酸脱羧酶活性的微生物中，例如通过将异源基因，例如单个或多个拷贝的赖氨酸脱羧酶基因引入微生物，优选地通过遗传改造的方式。短语“去调控的途径或反应”指生物合成途径或反应，其中编码在生物合成途径或反应中的酶的至少一个基因被改变或修饰，使得至少一种生物合成酶的水平或活性被改变或修饰。词组“去调控的途径”包括生物合成途径，其中多于一种基因已被改变或修饰，因此改变了相应的基因产物/酶的水平和/或活性。有时，在微生物中“去调控”途径(例如，同时去调控在给定的生物合成途径中的多于一种基因)的能力发生在微生物的特定现象中，其中多于一种酶(例如，2种或3种生物合成酶)由彼此相邻出现在被称为“操纵子”的遗传物质的连续片段上的基因编码。在其他情况下，为了去调控途径，必须在一系列相继的改造步骤中去调控若干基因。为了表达根据本发明的去调控的基因，必须将编码酶的DNA序列与表达载体中的控制转录表达的调控序列有效连接，然后引入原核或真核宿主细胞。除了转录调控序列，如启动子和增强子以外，表达载体可包括翻译调控序列和适于选择携带表达载体的细胞的标记物基因。用于在原核宿主中表达的合适的启动子可为可抑制型、组成型或诱导型。合适的启动子是本领域技术人员熟知的并包括能够识别T4，T3，Sp6和T7聚合酶的启动子，入噬菌体的Pr和Pl启动子，大肠杆菌的trp,recA,热休克，lacUV5, tac, lpp-lac pr,phoA, gal,trc和IacZ启动子，枯草芽孢杆菌(B. Subtilis)的a -淀粉酶和o28_特异性启动子，芽孢杆菌噬菌体的启动子，链霉菌(Streptomyces)启动子，入噬菌体的int启动子，pBR322的3 -内酰胺酶基因的bla启动子，和氯霉素乙酰基转移酶基因的CAT启动子，以及棒状杆菌的 PGRO，PSOD, PEFTU, PEFTS 和这些启动子的组合，如在 W02005059144，W02007011939, W02007012078, W02005059093, W02008049782, W02006069711, W02007020295 中描述的。Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277(1987) ;Watson等人，MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE,第
4版,Benjamin Cummins (1987) ;Ausubel等人,见上，和Sambrook等人,见上综述了原核启动子。用于表达大肠杆菌赖氨酸脱羧酶的优选启动子是在W02005059144，W02007011939,ff02007012078,ff02005059093,ff02008049782,ff02006069711,ff02007020295
中描述的谷氨酸棒状杆菌的PsodA，PGRO和PEFTU启动子。在原核宿主中表达蛋白质的方法是本领域技术人员熟知的。见，例如，Williams等人，"Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors andpurificat ion of specific polyclonal antibodies,"在 DNA CLONING 2!EXPRESSIONSYSTEMS,第 2 版，Glover 等人(编)，第 15-58 页中(Oxford University Press 1995)。又见，Ward 等人，"Genetic Manipulation and Expression of Ant ibodies,"在MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS，第 137-185 页中(ffiley-Liss,Inc.1995)；和 Georgiou, " Expression of proteins in Bacteria,"在 PROTEINENGINEERING:PRINCIPLES AND PRACTICE，Cleland等人(编)，第 101-127页中(John Wiley& Sons, Inc. 1996)。提高和降低基因表达和蛋白质产生的其他方法可在W02008049782中找到。可使用多种技术将表达载体引入细菌宿主细胞，包括氯化钙转化、电穿孔，等等。见，例如，Ausubel 等人(编)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第 3 版，第 1-1 至
1-24 页(John Wiley & Sons, Inc.1995)。如本文使用的，基本纯的蛋白质表示期望的纯化蛋白质基本不含污染的细胞成分，这可通过在聚丙烯酰胺十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)后的单一条带证明。术语"基本纯的"还旨在描述在本领域技术人员使用的一种或多种纯度或同质性特征上同质的分子。例如，基本纯的赖氨酸脱羧酶将显示在标准实验偏差内的如下参数的恒定和可重复的特征分子量，色谱迁移，氨基酸组成，氨基酸序列，封闭的或未封闭的N-端，HPLC洗脱谱，生物学活性，和其他类似参数。然而，此术语不旨在排除赖氨酸脱羧酶和其他化合物的人工或合成混合物。此外，此术语不旨在排除从重组宿主分离的赖氨酸脱羧酶融合蛋白。在第一个方面，本发明提供了微生物，其具有细胞内赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性。微生物可为任意原核或真核微生物，特别是细菌，古细菌，酵母和真菌。优选的微生物选自棒状杆菌属，特别关注谷氨酸棒状杆菌，埃希氏菌属，特别关注大肠杆菌，芽孢杆菌属，特别是枯草芽孢杆菌，和链霉菌属。 如上所述，本发明的优选实施方案涉及选自棒状杆菌，如棒状杆菌属细菌的宿主细胞的用途。特别优选谷氨酸棒状杆菌，醋麸酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum),嗜醋酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum),帚石南棒杆|if(Corynebacterium callunae),产 M 棒 If |if(Corynebacterium ammoniagenes),产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes),栖糖蜜棒杆菌(Corynebacteriummelassecola)和Corynebacterium effiziens种。本发明的其他优选实施方案涉及短杆菌，特别是黄色短杆菌(Brevibacterium fIavum),乳糖发酵短杆菌(BrevibacteriumIactofermentum)和 Brevibacterium divarecatum 种的用途。在本发明的其他优选实施方案中，宿主细胞可选自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，醋麸酸棒状杆菌ATCC15806，嗜醋酸棒杆菌ATCC13870，热产氨棒杆菌FERMBP-1539，栖糖蜜棒杆菌 ATCC17965, Corynebacterium effiziens DSM 44547, Corynebacterium effiziensDSM 44549，黄色短杆菌 ATCC14067,乳糖发酵短杆菌 ATCC13869, Brevibacteriumdivarecatum ATCC 14020，谷氨酸棒状杆菌KFCC10065和谷氨酸棒状杆菌ATCC21608，以及来源于其的菌株，通过例如经典诱变和选择或通过定向诱变。谷氨酸棒状杆菌的其他特别优选的菌株可选自ATCC13058，ATCC13059,ATCC13060, ATCC21492, ATCC21513, ATCC21526, ATCC21543, ATCC13287, ATCC21851,ATCC21253, ATCC21514, ATCC21516, ATCC21299, ATCC21300, ATCC39684, ATCC21488,ATCC21649, ATCC21650, ATCC19223, ATCC13869, ATCC21157, ATCC21158, ATCC21159,ATCC21355, ATCC31808, ATCC21674, ATCC21562, ATCC21563, ATCC21564, ATCC21565,ATCC21566, ATCC21567, ATCC21568, ATCC21569, ATCC21570, ATCC21571, ATCC21572,ATCC21573, ATCC21579, ATCC19049, ATCC19050, ATCC19051, ATCC19052, ATCC19053,ATCC19054, ATCC19055, ATCC19056, ATCC19057, ATCC19058, ATCC19059, ATCC19060,ATCC19185, ATCC13286, ATCC21515, ATCC21527, ATCC21544, ATCC21492, NRRL B8183, NRRLW8182, B12NRRLB12416, NRRLB12417, NRRLB12418 和 NRRLB11476。缩写KFCC代表韩国联邦菌种保藏中心(Korean Federation of CultureCollection), ATCC代表美国模式菌株培养物保藏中心(American-Type Strain CultureCollection)和缩写DSM代表德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen)。缩写NRRL代表ARS菌种保藏中心北区研究实验室(ARS culturescollection Northern Regional Research Laboratory, Peorea, IL, USA)。在某些实施方案中，本发明的微生物是“Campbell in”或“Campbellout”微生物(或细胞或转化体)。如本文使用的，词组“Campbell in”转化体应表示原始宿主细胞的转化体，其中整个环状双链DNA分子(例如质粒)已通过单个同源重组事件(cross in事件))整合进细胞的染色体。所述同源重组事件有效导致环状DNA分子的线性化版本插入与环状DNA分子的第一 DNA序列同源的染色体的第一 DNA序列。词组“Campbelled in”指已整合进“Campbell in”转化体的染色体中的线性化DNA序列。“Campbell in”转化体包含第一同源DNA序列的副本，其包含并包围同源重组交叉点。“Campbell out” 指来源于 “Campbell in” 转化体的细胞,其中在 “Campbell edin”DNA的线性化的插入DNA上包含的第二 DNA序列与和线性化插入物的第二 DNA序列同源的染色体来源的第二 DNA序列之间发生第二次同源重组事件(cross out事件)，第二次重组事件导致整合的DNA序列的一部分缺失(掷荷(jettisoning))，但重要的是也导致整合的DNA序列的一部分(这可短至单个碱基)保留在染色体中，使得相比原始宿主细胞，“Campbell out”细胞包含在染色体中的一个或多个有意的改变(例如，单碱基取代，多碱基取代，插入异源基因或DNA序列，插入同源基因或修饰的同源基因的额外拷贝或多个拷贝，或插入包含多于一种上面列出的这些上述实例的DNA序列)。
“Campbell out”细胞或菌株通常,但不一定,通过针对“Campbelled in”DNA序列的一部分(期望被掷荷的部分)中包含的基因，例如枯草芽孢杆菌sacB基因(当在存在约5%_10%蔗糖时生长的细胞中表达时，其是致死的)的反选择得到。不管使用或不使用反选择，可通过筛选期望的细胞得到或鉴定期望的“Campbell out”细胞，使用任意可筛选的表型，例如，但不限于，菌落形态、菌落颜色、存在或缺乏抗生素抗性，存在或缺乏给定的DNA序列(通过聚合酶链式反应)，存在或缺乏营养缺陷型，存在或缺乏酶，菌落核酸杂交，等等。导致“Campbell in”或“Campbell out”的同源重组事件可在同源DNA序列内的一定范围的DNA碱基上发生，因为同源序列将在此范围的至少部分上彼此相同，通常不可能精确地指定交叉事件发生的位置。换句话说，不可能精确地指定哪些序列来源于插入DNA，和哪些序列来源于染色体DNA。此外，第一同源DNA序列和第二同源DNA序列通常被部分非同源区隔开，此非同源区保持存在于“Campbell out”细胞的染色体中。为了实用性，在谷氨酸棒状杆菌中，一般的第一和第二同源DNA序列为至少约200碱基对的长度，并可多达数千碱基对的长度，然而，可以使操作对更短或更长的序列起作用。第一和第二同源序列的优选长度是约500-2000碱基，通过将第一和第二同源序列安排成大约相同的长度，优选地低于200碱基对的差异，和最优选地使二者中的较短序列为较长序列的碱基对长度的至少70%,帮助从“Campbell in”得到“Campbell out”。赖氨酸脱羧酶活性指L-赖氨酸脱羧为尸胺，这是由赖氨酸脱羧酶催化的。此酶被归类为E.C.4. I. I. 18。例如，从具有赖氨酸脱羧酶活性的大肠杆菌中分离的酶是cadA基因产物(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Entry b4131)和 IdcC 基因产物(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Entry JW0181)。测量和比较酶活性的方法是本领域已知的，并在例如“Handbook ofCorynebacetrium glutamicum 2005Eggeling, Borth 编 CRC Press Boca Raton USA和其中的参考)或 Methods in Enzymology 卷 17,部分 1pp. 3-1098 (1970),卷 17,部分 2，pp. 3-961(1971)，卷 41，pp. 3-564(1975)，卷 42pp. 3-537 (1975)，卷 63，pp. 3-547 (1979)，卷 64，pp. 3-418 (1980)，卷 89，pp. 3-656 (1982)，卷 90pp. 3-602 (1982)，卷142，pp. 3-732(1987)，卷143pp. 3-582(1987)和其中的参考中描述。用于比较谷氨酸棒状杆菌菌株的标准菌株是 ATCC13032 (Handbook of Corynebacetrium glutamicum2OO5Eggeling, Borth 编 CRC Press Boca Raton USA)。大肠杆菌IdcC的氨基酸序列公开在登记号SEQ ID NO: I中，大肠杆菌cadA的氨基酸序列公开在SEQ ID NO:2中。编码大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因的DNA分子可通过筛选cDNA或基因组文库得到，使用具有从SEQ ID N0:1或2的氨基酸序列逆转录的核苷酸序列的多核苷酸探针。可选地，大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因或本文描述的任意基因可通过合成DNA分子得到，使用互相引发(priming)的长寡核苷酸。见，例如，Ausubel等人，(编)，⑶RRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,第 8. 2. 8 至 8. 2. 13 页(1990) [ " Ausubel "]。又见 Wosnick 等人，Gene 60:115(1987)；和 Ausubel 等人(编)，SHORT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,第 3 版，第 8-8 至 8-9 页(John Wiley & Sons, Inc. 1995)。使用聚合酶链式反应建立的技术提供了合成长至少2千碱基的DNA分子的能力。Adang等 人，Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993) ;Bambot 等人，PCR Methods and Applications2:266(1993) ;Dillon 等人，"Use of the Polymerase Chain Reaction for the RapidConstruction of Synthet ic Genes, " in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol. 15:PCRPROTOCOLS:CURRENT METHODS AND APPLICATIONS, White (编)，第 263-268 页，(HumanaPress, Inc. 1993) ;Holowachuk 等人，PCR Methods Appl. 4:299 (1995)。可产生相比亲本酶包含保守氨基酸改变的大肠杆菌赖氨酸脱羧酶变体或本文描述的任意基因的变体。即，可得到包含例如SEQ ID N0:1或2的一个或多个氨基酸取代的变体，其中用烷基氨基酸取代赖氨酸脱羧酶氨基酸序列中的烷基氨基酸，用芳基氨基酸取代大肠杆菌赖氨酸脱羧酶氨基酸序列中的芳基氨基酸，用含硫氨基酸取代大肠杆菌赖氨酸脱羧酶氨基酸序列中的含硫基氨基酸，用含羟基氨基酸取代大肠杆菌赖氨酸脱羧酶氨基酸序列中的含羟基氨基酸，用酸性氨基酸取代大肠杆菌赖氨酸脱羧酶氨基酸序列中的酸性氨基酸，用碱性氨基酸取代大肠杆菌赖氨酸脱羧酶氨基酸序列中的碱性氨基酸。在常见氨基酸中，例如，"保守的氨基酸取代"表示在以下每一组内的取代(I)甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸，酪氨酸，和色氨酸，(3)半胱氨酸和甲硫氨酸，(4)丝氨酸和苏氨酸，(5)天冬氨酸和谷氨酸，(6)谷氨酰胺和天冬酰胺，和(7)赖氨酸，精氨酸和组氨酸。可通过用核苷酸取代在SEQ ID N0:1或2中列出的核苷酸引入大肠杆菌赖氨酸脱羧酶中的保守的氨基酸变化。这样的"保守的氨基酸"变体可通过，例如，寡核苷酸定向的诱变，接头扫描诱变，使用聚合酶链式反应的诱变等等得到。Ausubel等人，见上，第8. 0. 3-8. 5. 9 页；Ausubel 等人(编)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,第 3 版，第8-10 至 8-22 页(John Wiley & Sons, Inc. 1995)。一般又见，McPherson(编)，DIRECTEDMUTAGENESIS:A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)。可使用标准酶活性测定确定这些变体将L-赖氨酸转化为尸胺的能力，如本文描述的测定测定。根据本发明的优选的赖氨酸脱羧酶是大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶及其等同基因，所述等同基因与相应的“原始”基因产物具有高达80%，优选地90%和最优选地95%和98%的序列同一性(基于氨基酸序列)，且仍然具有赖氨酸脱羧酶的生物学活性。可通过引入核苷酸取代，缺失或插入容易地构建这些等同基因，通过本领域已知的方法或通过克隆其他生物的同源基因，所述同源基因可通过本领域熟知的方法鉴定和克隆，例如数据库检索、文库筛选、互补测定或酶活性检测。优选地，优化克隆的同源基因的核苷酸序列，用于在预期的宿主微生物中的表达，例如通过改造为适用谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌的密码子使用。本发明的其他优选实施方案使用大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶(SEQ ID NO: I或2)，其通过应用谷氨酸棒状杆菌的密码子使用重译为DNA。这些赖氨酸脱羧酶的多核苷酸序列用于在棒状杆菌属的微生物中，特别是谷氨酸棒状杆菌中表达赖氨酸脱羧酶。细胞内赖氨酸脱羧酶活性是由位于微生物细胞膜的细胞质侧的赖氨酸脱羧酶导致的。在真核微生物的情况下，赖氨酸脱羧酶可位于细胞的一个或多个区室内。优选地，其位于微生物的细胞质中，插入或连接在细胞膜上。细胞外赖氨酸脱羧酶活性是由位于细胞膜外侧的赖氨酸脱羧酶导致的。赖氨酸脱羧酶可位于壁膜间隙中、细胞壁中、细胞壁表面上、分泌进培养基，或任意这些的组合。本发明的微生物包含细胞内赖氨酸脱羧酶活性。优选包含高的细胞内脱羧酶活性。细胞内赖氨酸脱羧酶活性可通过用一种或多种将被微生物表达的赖氨酸脱羧酶基因转 化微生物而产生或增强。另外或可选地，赖氨酸脱羧酶基因可为突变的，以增强编码的赖氨酸脱羧酶的表达或酶活性。在另一个实施方案中，细胞内赖氨酸脱羧酶活性与细胞外赖氨酸脱羧酶活性组合。可以转化缺乏细胞内或细胞外赖氨酸脱羧酶活性的微生物，以在细胞内或细胞外表达赖氨酸脱羧酶。可通过突变赖氨酸脱羧酶实现细胞外表达，以包含用于细胞外表达的信号序列，例如分泌信号或用于分子锚的信号，所述信号在待转化的微生物中有功能。细胞外表达的实例可在Choi和Lee Appl Microbiol Biotechnol 200464:625635,Current Opinionin Biotechnology 2005,16:538545, Trends in Biotechnology2007 16 73-79 中找到。如果细胞内或细胞外赖氨酸脱羧酶活性是由于编码具有赖氨酸脱羧酶活性的不同多肽的多于一种赖氨酸脱羧酶基因的表达，细胞内或细胞外赖氨酸脱羧酶总活性将是这些不同赖氨酸脱羧酶活性的结果。可通过比较特定微生物中的不同赖氨酸脱羧酶基因的表达水平和比较这些基因表达的赖氨酸脱羧酶的特定酶活性，测量特定赖氨酸脱羧酶基因对总赖氨酸脱羧酶活性的贡献。可根据本领域熟知的方法测量不同基因的表达水平，优选地在蛋白质水平上测量表达水平，例如通过蛋白质印迹或ELISA测定。测量赖氨酸脱羧酶的特定酶活性的方法也是本领域熟知的。在W02007113127中公开了优选的方法。如果内源赖氨酸脱羧酶活性是通过至少另一种具有赖氨酸脱羧酶活性的多肽的转基因表达而增强，则这些另外的多肽的贡献可通过比较转化和未转化微生物的总赖氨酸脱羧酶活性测量。在一个优选的实施方案中，细胞内或细胞外脱羧酶活性或这两种活性至少部分，优选地多于30%或多于50%或多于60%或多于70%或多于75%，80%,85%,90%,95%98%，99%是由于包含与SEQ ID NO: I或2至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一的氨基酸序列、且具有赖氨酸脱羧酶活性，优选地具有高赖氨酸脱羧酶活性的一种或多种多肽。在一个实施方案中，细胞内或细胞外脱羧酶活性或这两种活性的多于98%或多于99%是由于包含与SEQ ID NO: I或2至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一的氨基酸序列，且具有赖氨酸脱羧酶活性，优选具有高的赖氨酸脱羧酶活性的一种或多种多肽。在一个实施方案中，细胞内或细胞外脱羧酶活性或这两种活性至少部分，优选地多于30%或多于50%或多于60%或多于70%或多于75%，80%, 85%, 90%, 95%98%，99%是由于包含与SEQ ID NO: I至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一的氨基酸序列，且具有赖氨酸脱羧酶活性，优选地具有高赖氨酸脱羧酶活性的一种或多种多肽。在一个实施方案中，细胞内或细胞外脱羧酶活性或这两种活性至少部分，优选地多于30%或多于50%或多于60%或多于70%或多于75%，80%, 85%, 90%, 95%98%，99%是由于包含与SEQ ID NO: 2至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一的氨基酸序列，且具有赖氨酸脱羧酶活性，优选地具有高赖氨酸脱羧酶活性的一种或多种多肽。在一个实施方案中，包含细胞内赖氨酸脱羧酶活性、或细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性的微生物确实也包含增强的赖氨酸输入能力。可通过增加从发酵培养基进入微生物的赖氨酸流、或通过减少从微生物到发酵培 养基的赖氨酸流的任意措施实现提高的赖氨酸输入能力。测定赖氨酸输出和输入活性的方法可在Bellmann, A, Vrljic, M, Patek, M,等人 MICR0BI0L0GY-SGM 147pp.1765-1774，2001，和 Burkovski, A, Kramer, R. AppliedMicrobiology and Biotechnology 58pp. 265-274. 2002 和其中引用的文献中找到。例如,可通过减少或消除赖氨酸输出体活性,或增强赖氨酸通透酶活性,或增强赖氨酸/尸胺逆向转运体活性，或其任意组合提高赖氨酸输入能力。赖氨酸输出体活性可由能够将赖氨酸从培养基转运到细胞的任意多肽导致，例如赖氨酸输出体，同向转运体(symporter)或逆向转运体多肽。如果微生物具有细胞外赖氨酸脱羧酶活性和高的赖氨酸生产能力，通过采取与描述的用于增强赖氨酸输入能力的措施相反的措施增强赖氨酸输出能力将是有利的，例如通过增强某些基因的表达，而不是减少某些基因的表达。具有高赖氨酸生产能力和减少或消除的赖氨酸输出多肽的表达，但缺乏细胞外赖氨酸脱羧酶活性的微生物的实例可在WO97/23597和W02005073390 (其中公开了通过培养具有增强的氨基酸输出蛋白的表达或活性的微生物，提高氨基酸生产的方法)和US 7，435，584 (其中公开了通过培养具有IysE (赖氨酸输出载体)基因的高表达的棒状杆菌，提高L-赖氨酸生产的方法)中找到。在本发明的一个实施方案中，降低至少一种赖氨酸输出多肽的活性,其中赖氨酸输出多肽包含与SEQ ID NO: 3至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一的氨基酸序列且具有赖氨酸输出活性，或其中赖氨酸输出多肽包含与SEQ ID N0:4至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一的氨基酸序列且具有赖氨酸输出活性，或降低其中至少2种赖氨酸输出多肽的活性，至少一种包含与SEQ ID N0:3至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一的氨基酸序列且具有赖氨酸输出活性，和至少一种包含与SEQ ID NO: 4至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一的氨基酸序列且具有赖氨酸输出活性。IysE 基因已在文献 Eggeling，L, Sahm, H JOURNAL OF BIOSCIENCE ANDBIOENGINEERING 92,3201-213, Eggeling, L, Sahm, H ARCHIVES OF MICROBIOLOGY 180,3155-1602003中描述。又见德国专利申请DE95-01048222。YbjE基因产物(SEQ ID NO:4)及其突变体已在例如W02005073390中描述。
术语“降低的活性”包括在低于操纵微生物前或未经操纵的可比微生物中的表达水平上的基因产物的表达，例如赖氨酸输出体分子，亚精胺合酶，高丝氨酸脱氢酶或其他基因产物的表达，优选地将基因产物的表达与在相同条件下生长的特定微生物物种的熟知菌株相比较，例如在棒状杆菌的情况下，将基因表达优选地与菌株ATCC13032中的表达水平相比较，在大肠杆菌的情况下，将基因表达优选地与在菌株保藏中心ATCC中保藏的菌株MG1665中的表达水平相比较,在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，将表达水平与在菌株保藏中心ATCC中保藏的菌株W303相比较。在一个实施方案中，可遗传操纵(例如，遗传改造)微生物，从而在低于操纵微生物前或未经操纵的可比微生物中的表达水平表达基因产物。遗传操纵可包括，但不限于，改变或修饰与特定基因的表达相关的调控序列或位点(例如，通过去除强启动子、诱导型启动子或多个启动子)，修饰特定基因 的染色体位置，改变特定基因的相邻核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子，减少特定基因的拷贝数，修饰参与特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译的蛋白质(例如，调控蛋白，抑制物，增强物，转录激活物等)，或本领域例行操作的降低特定基因的表达的任意其他常规手段(包括但不限于使用反义核酸分子，或敲除或阻断靶蛋白表达的其他方法)。特别地，可操纵基因使I个或多个核苷酸从宿主生物的染色体中缺失。也可通过引入导致基因产物活性降低的一个或多个基因突变得到基因产物例如赖氨酸输出体分子的降低的活性。此外，也可通过影响调控所述基因产物的表达或活性的调控蛋白降低基因产物的活性，例如通过影响所述基因的转录。实例是转录阻抑物和转录激活物。例如IysE基因的表达受IysG基因产物的负面影响。IysG基因(本文中以SEQ ID NO: 5公开)和LysG基因产物(本文中以SEQID N0:6公开)的序列也可见如下登记号P94632，X96471。在另一个实施方案中，通过增强的赖氨酸通透酶活性或通过增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性或二者的组合增强赖氨酸输入能力。可通过提高一种或多种内源赖氨酸通透酶基因(例如在SEQ ID N0:7中公开的)的表达，或提高赖氨酸通透酶多肽(例如在SEQ ID NO:8中公开的)的通透酶活性增强给定微生物的赖氨酸通透酶活性，例如通过微生物的随机诱变或通过用一种或多种赖氨酸通透酶基因转化微生物或通过其任意组合进行。在一个实施方案中，通过重组表达一种或多种赖氨酸通透酶多肽增强微生物的赖氨酸通透酶活性，所述多肽包含与SEQ ID NO:8至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一的氨基酸序列，并具有赖氨酸通透酶活性,例如具有赖氨酸通透酶活性的同源物或突变体。测定赖氨酸通透酶活性的方法可在Bellmann, A, Vrljic, M, Patek,M,等人 MICROB10L0GY-SGM 147pp. 1765-17742001，和 Burkovski，A, Kramer, R APPLIEDMICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 58pp. 265-2742002，Fujii，T，等人，以及 BIOSCIENCEBIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY 66，ppl981_1984，2002 和其中引用的参考中找到。可例如通过一种或多种赖氨酸通透酶基因的转化，通过使用具有更高表达活性的去调控的启动子提供内源赖氨酸通透酶基因，或通过减少赖氨酸通透酶基因表达或基因产物活性的负调控物实现重组表达。在另一个实施方案中，通过增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性增强赖氨酸输入能力。赖氨酸/尸胺逆向转运体是在跨越细胞膜的不同方向上同时转运赖氨酸和尸胺的蛋白质。可通过提高一种或多种内源赖氨酸/尸胺逆向转运体基因的表达，通过微生物的随机突变，用一种或多种赖氨酸/尸胺逆向转运体基因转化微生物，或通过优化赖氨酸/尸胺逆向转运体多肽的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性(例如偏好赖氨酸输入和尸胺输出)，或通过其任意组合实现增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性。在一个实施方案中，通过重组表达一种或多种赖氨酸/尸胺逆向转运体多肽增强微生物的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性，所述多肽包含与SEQ ID NO:9至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一的氨基酸序列，并具有赖氨酸/尸胺逆向转运体活性，例如具有赖氨酸/尸胺逆向转运体活性的同源物或突变体。可例如通过一种或多种赖氨酸/尸胺逆向转运体基因的转化，通过使用具有更高表达活性的去调控的启动子提供内源赖氨酸/尸胺逆向转运体基因，或通过减少赖氨酸/尸胺逆向转运体基因表达或基因产物活性的负调控物实现重组表达。已知cadB基因产物(本文以SEQ ID NO:9公开)的输入或输出活性依赖于细胞和发酵培养基中的赖氨酸和尸胺浓度。因此，可通过增加发酵培养基中的赖氨酸浓度，避免发 酵培养基的低PH值，或通过插入在发酵培养基中的给定赖氨酸浓度或PH值下促进赖氨酸输入的突变，或通过其组合增强表达功能性cadB基因产物的特定微生物的赖氨酸输入能力(Soksawatmaekhin W.等人；Excretion and uptake of cadaver ine by CadB and itsphysiological functions in Escherichia coli ；Molecular Microbiology；2004,;卷51，5 ;第 1401-1412 页)。描述了在发酵培养基中的给定赖氨酸浓度或pH值下促进大肠杆菌cadB基因产物的赖氨酸输入的若干突变(Soksawatmaekhin W.等人；Identification of theCadaverine Recognition Site on the Cadaverine-Lysine Antiporter CadB ；TheJournal of Biological Chemistry ;2006 ;卷 281，39 ;第 29213-29220 页)。本领域技术人员将能够鉴定在其他cadB蛋白，例如cadB的同源物或突变体中的类似突变。因此，在一个实施方案中，赖氨酸/尸胺逆向转运体多肽包含与SEQ ID NO:9至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一的氨基酸序列，并包含一种或多种以下突变C12S, W41L, W43L, Y55L, Y57L, Y73L, Y73F, Y73W, Y89L, Y89F, Y89W, Y90L, Y90F,Y90W,Y107L,Y174L,C125S,D185N,E204Q,E204D,Y235L,Y235F,Y235W, W289L,D303N,D303E,Y310L, Y366L, Y368L, D372N, E377Q, E408Q, Y423L, Y423F 和 Y423W。上述突变根据 cadB 基因产物的氨基酸序列命名。通过使用序列比较工具，例如通过使用序列比对，本领域技术人员将能够将这些突变转移到其他基因产物上，例如与cadB基因产物同源的基因产物。优选地，赖氨酸/尸胺逆向转运体多肽包含与SEQ ID NO:9至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一的氨基酸序列，并包含一种或多种以下突变W41L，W43L, Y57L, Y89L, Y107L, Y174L, D185N, E204Q, Y235L, W289L, D303N, Y366L, Y368L, D372N和 E408Q。更优选地，赖氨酸/尸胺逆向转运体多肽包含与SEQ ID NO: 9至少80%或至少85%或至少90%或至少95%或至少98%同一的氨基酸序列，并包含一种或多种以下突变W41L，W43L, Y57L, Y107L, Y174L, D185N, Y366L, Y368L 和 E408Q。在本发明的另一个实施方案中提供了微生物，其包含细胞内赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性并具有高赖氨酸生产能力。具有高赖氨酸生产能力的微生物能够在例如细胞内或周围培养基中富集赖氨酸，如果赖氨酸不被进一步代谢为例如尸胺的话。优选地，具有高赖氨酸生产能力的微生物具有选自组(i)的至少一种去调控的基因。组(i)是一组在赖氨酸生物合成中起关键作用的基因，由天冬氨酸激酶，天冬氨酸半醒脱氧酶(aspartatesemialdehyde dehydrogenase), 二氧批卩定二竣酸合酶，二氧卩比唳二羧酸还原酶，四氢卩比唳二羧酸琥拍酰化酶(tetrahydrodipicolinate succinylase),玻拍酸 _ 氨基-酮基庚二酸转氨酶(succinyl-amino-ketopimelate transaminase),玻拍酸 _ 二氨基 _ 庚二酸脱玻拍酸酶(811(^[1171-(113111；[1101；[111613七6 desuccinylase),二氨基庚二酸表异构酶，二氨基庚二酸脱氢酶，精氨酰-tRNA合成酶，二氨基庚二酸脱羧酶，丙酮酸羧化酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，转酮醇酶，转醛醇酶，6-磷酸葡糖酸内酯酶，果糖1，6- 二磷酸酶，高丝氨酸脱氢酶，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phophoenolpyruvate carboxykinase),琥拍酰辅酶A合成酶，甲基丙二酰辅酶A变位酶，二胺乙酰基转移酶基因组成。
根据本发明的方法，组(i)的至少一个基因必须是去调控的。优选地，在根据本发明的微生物中，组(i)的多于I个基因，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个基因是去调控的。将被去调控的组(i)的优选基因是天冬氨酸激酶，天冬氨酸半醛脱氢酶，二氢吡啶二羧酸合酶，二氢吡啶二羧酸还原酶，二氨基庚二酸脱氢酶，二氨基庚二酸脱羧酶，丙酮酸羧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，转酮醇酶，转醛醇酶，6-磷酸葡糖酸内酯酶，果糖1，6-二磷酸酶，高丝氨酸脱氢酶，琥珀酰辅酶A合成酶，二胺乙酰基转移酶。组⑴的基因和基因产物是本领域已知的。EP 1108790公开了在高丝氨酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶基因中的突变，所述突变对重组棒状杆菌生产赖氨酸的生产力具有有利影响。WO 00/63388公开了在天冬氨酸激酶基因中的突变，所述突变对重组棒状杆菌生产赖氨酸的生产力具有有利影响。关于在上述这些基因中的突变，引入EP 1108790和WO00/63388作为参考。在下表中对每个基因/基因产物描述了去调控各个基因的可能方法。关于基因的去调控，将表的“去调控”行中引用的文献和文件一同引入作为参考。在表中提及的方法是去调控各个基因的优选实施方案。表I
权利要求
1.微生物，其包含细胞内赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性。
2.权利要求I的微生物，其中所述细胞内赖氨酸脱羧酶活性、或所述细胞外赖氨酸脱羧酶活性、或所述细胞内和所述细胞外脱羧酶活性至少部分是由于一种或多种赖氨酸脱羧酶多肽的表达，所述多肽包含与SEQ ID NO: I或2至少80%同一的氨基酸序列。
3.权利要求I或2的微生物，其中所述赖氨酸脱羧酶活性、或所述细胞外赖氨酸脱羧酶活性、或所述细胞内和所述细胞外脱羧酶活性至少部分是由于一种或多种赖氨酸脱羧酶多肽的表达，所述多肽包含与SEQ ID NO: I至少80%同一的氨基酸序列。
4.权利要求I至3中任一项的微生物，其中所述细胞外赖氨酸脱羧酶活性和所述细胞内赖氨酸脱羧酶活性至少部分是由于一种或多种赖氨酸脱羧酶多肽的表达，所述多肽包含与SEQ ID NO: I至少80%同一的氨基酸序列。
5.权利要求I至4中任一项的微生物，其中所述增强的赖氨酸输入活性是由于降低的赖氨酸输出体活性、或增强的赖氨酸通透酶活性、或增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性、或其任意组合。
6.权利要求I至5中任一项的微生物，其中所述增强的赖氨酸输入活性是由于降低的赖氨酸输出多肽的活性，所述多肽包含与SEQ ID NO:3或4至少80%同一的氨基酸序列。
7.权利要求I至6中任一项的微生物，其中所述增强的赖氨酸输入活性是由于增强的赖氨酸通透酶活性、或由于增强的赖氨酸/尸胺逆向转运体活性、或二者的组合。
8.权利要求I至7中任一项的微生物，其中所述增强的赖氨酸输入活性是由于以下多肽的重组表达 a.至少一种包含与SEQID NO:8至少80%同一的氨基酸序列并具有赖氨酸通透酶活性的多肽，或 b.至少一种包含与SEQID NO: 9至少80%同一的氨基酸序列并具有赖氨酸/尸胺逆向转运体活性的多肽，或 c.至少一种包含与SEQID NO: 8至少80%同一的氨基酸序列并具有赖氨酸通透酶活性的多肽，和至少一种包含与SEQ ID NO: 9至少80%同一的氨基酸序列并具有赖氨酸/尸胺逆向转运体活性的多肽。
9.权利要求I至8中任一项的微生物，其具有高的赖氨酸生产能力。
10.权利要求I至9中任一项的微生物，其中所述微生物没有乙酰尸胺形成活性或具有降低的乙酰尸胺形成活性。
11.权利要求I至10中任一项的微生物，其中通过降低乙酰尸胺形成多肽的活性降低乙酰尸胺形成活性，所述多肽包含与SEQ ID NO: 11至少80%同一的氨基酸序列。
12.权利要求I至11中任一项的微生物，其中所述微生物没有氨丙基尸胺形成活性或具有降低的氨丙基尸胺形成活性。
13.权利要求I至12中任一项的微生物，其中通过降低氨丙基尸胺形成多肽的活性降低氨丙基尸胺形成活性，所述多肽包含与SEQ ID NO: 12至少80%同一的氨基酸序列。
14.权利要求I至13中任一项的微生物，其中所述微生物没有高丝氨酸脱氢酶活性或具有降低的高丝氨酸脱氢酶活性。
15.权利要求I至14中任一项的微生物，其中通过降低高丝氨酸脱氢酶多肽的活性降低高丝氨酸脱氢酶活性，所述多肽包含与SEQ ID NO: 13，14或15至少80%同一的氨基酸序列。
16.权利要求I至15中任一项的微 生物，其中所述微生物没有赖氨酸降解活性或具有降低的赖氨酸降解活性。
17.权利要求I至16中任一项的微生物，其中通过降低至少一种赖氨酸羟化酶多肽的活性降低赖氨酸降解活性，所述多肽包含与SEQ ID NO: 16至少80%同一的氨基酸序列。
18.权利要求I至17中任一项的微生物，其中所述微生物具有去调控的亚精胺形成或摄取活性、或腐胺形成或摄取活性、或两者兼具。
19.权利要求I至18中任一项的微生物，其中通过降低下述多肽的活性降低所述亚精胺形成或摄取活性、或腐胺形成或摄取活性 a.至少一种亚精胺形成多肽，所述多肽包含与SEQID NO: 12至少80%同一的氨基酸序列，或 b.至少一种腐胺形成多肽，所述多肽包含与SEQID NO: 17至少80%同一的氨基酸序列，或 c.至少一种腐胺形成多肽，所述多肽包含与SEQID NO: 18至少80%同一的氨基酸序列，或 d.至少一种亚精胺/腐胺转运多肽，所述多肽包含与SEQID NO: 19至少80%同一的氨基酸序列，或 e.a, b, c或d的任意组合。
20.权利要求I至19中任一项的微生物，其中所述微生物属于真细菌分支。
21.权利要求I至20中任一项的微生物，其中所述微生物属于棒状杆菌属或埃希氏菌属。
22.权利要求I至21中任一项的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌。
23.权利要求I至22中任一项的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌。
24.尸胺生产系统，其包含权利要求I至23中任一项的微生物和适合培养所述微生物的培养基。
25.权利要求24的尸胺生产系统，其中所述培养基包含赖氨酸。
26.生产尸胺的方法，其包括发酵权利要求I至23中任一项的微生物。
27.权利要求26的方法,其中所述培养基包含赖氨酸。
28.权利要求26或权利要求27的方法，其中在培养基中的尸胺浓度(mol/1)是 a.乙酰尸胺浓度(mol/1)的至少I.2倍，或 b.氨丙基尸胺浓度(mol/1)的至少I.2倍。
29.权利要求26至28中任一项的方法，其中在培养基中的尸胺浓度(mol/1)是乙酰尸胺浓度(mol/1)的至少I. 2倍。
30.培养基，其中所述尸胺浓度(mol/1)是 a.乙酰尸胺浓度(mol/1)的至少I.2倍，或 b.氨丙基尸胺浓度(mol/1)的至少I.2倍。
31.权利要求30的培养基，其中所述尸胺浓度(mol/1)是乙酰尸胺浓度(mol/1)的至少I. 2倍。
32.培养基，其包含至少0.25mol/l的尸胺，但包含 a.不多于0.lmol/1的乙酰尸胺，或 b.不多于0.lmol/1的氨丙基尸胺。
33.培养基，其包含至少0.25mol/l的尸胺，但包含不多于0. lmol/1的乙酰尸胺。
34.权利要求I至23中任一项的微生物或权利要求24至25中任一项的尸胺生产系统用于生产尸胺的用途。
35.权利要求I至23中任一项的微生物或权利要求24至25中任一项的尸胺生产系统在权利要求26至29中任一项的方法中的用途。
36.权利要求30至33中任一项的培养基用于回收尸胺的用途。
37.在权利要求26至29中任一项的方法中产生的培养基用于纯化尸胺的用途。
全文摘要
本发明涉及包含提高尸胺生产的去调控形式的DNA分子的重组微生物的用途，以及用于产生所述微生物的重组DNA分子和多肽，所述微生物包含细胞内赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性，或包含细胞内和细胞外赖氨酸脱羧酶活性和增强的赖氨酸输入活性。本发明也涉及使用重组微生物生产尸胺的方法。
文档编号C12N9/88GK102753682SQ201080063889
公开日2012年10月24日 申请日期2010年12月15日 优先权日2009年12月17日
发明者A·泽维, H·施罗德, O·策尔德尔, W·K·郑 申请人:巴斯夫欧洲公司