Mybl2肽及包含它们的疫苗的制作方法

专利名称：Mybl2肽及包含它们的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物科学领域，更具体的说是癌症治疗领域。具体而言，本发明涉及作为癌症疫苗极为有用的新肽，以及用于治疗和预防肿瘤的药物。优先权本申请要求2009年12月4日提交的美国临时申请No. 61/266，871的权益，通过述及将其全部内容收入本文。
背景技术：
已经证明，⑶8阳性CTL可识别主要组织相容性复合物(MHC) I类分子上出现的肿瘤相关抗原(TAA)所衍生的表位肽，然后杀死肿瘤细胞。从TAA的第一个例子一黑 素瘤抗原(MAGE)家族被发现起，人们主要通过免疫学手段(NPL l:Boon T，Int J Cancer1993May 8, 54(2):177-80;NPL 2:Boon T&van der Bruggen P, J Exp Med 1996MarI, 183(3) :725-9)已经发现了许多其它TAA。这些TAA中的一些目前正在作为免疫治疗靶标接受临床开发。能够诱导强力且特异性的抗肿瘤免疫应答的新TAA的鉴定保证了针对各种类型癌症的肽疫苗接种策略的进一步开发和临床应用(NPL 3, Harris CC, JNatl Cancer Inst 1996 Oct 16，88 (20):1442-55;NPL 4,Butterfield LH etal., Cancer Res 1999Jul 1，59 (13):3134-42;NPL 5,Vissers JL et al., CancerResl999 Nov 1，59 (21):5554-9;NPL 6,van der Burg SH et al.,J Immunol1996May 1，156 (9) :3308-14;NPL 7,Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct15, 57(20) :4465-8;NPL 8, Fujie T et al. , Int J Cancer 1999Jan 18,80(2):169-72;NPL9,Kikuchi M et al. , Int J Cancer 1999 May 5，81 (3):459-66;NPL 10，Oiso M etal.，Int J Cancerl999May 5，81(3) : 387-94)。迄今为止，已经有数项使用这些肿瘤相关抗原衍生的肽进行临床试验的报告。不幸的是，迄今为止在这些癌症疫苗试验中只观察到较低的客观应答率(NPL Il1Belli F et al.，J Clin Oncol 20020ct
15,20(20):4169-80;NPL 12，Coulie PG et al. , Immunol Rev 20020ct, 188:33-42;NPL13，Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004S印，10 (9) : 909-15)。因此，仍然需要鉴定能作为免疫治疗靶的新TAA。通过使用c-myb原癌基因探针筛选cDNA文库，人们鉴定MYBL2 (GenBankAccession No:NM_002466, SEQ ID N0:5，编码 SEQ ID NO:6)，即 v-myb 成髓细胞血症病毒癌基因同源物(鸟)_类2，是转录因子基因MYB家族的成员(NPL 14, Nomura N etal. ,Nucleic Acids Res. 1988 Dec 9，16 (23) : 11075-11089)。已知 MYBL2 调节细胞周期行进，以及由细胞周期蛋白驱动的CDK2-细胞周期蛋白A和CDK2-细胞周期蛋白E复合物进行的磷酸化(NPL15, Robinson C et al. , Oncogene 1996 May 2; 12 (9) : 1855-64, NPL
16,Lane et al. , Oncogene 1997 May 22;14(20):2445-53，NPL 17, Sala et al. , ProcNatl Acad Sci1997 Jan 21;94(2):532-536, NPL 18，Johnson K et al. , J Biol Chem1999Decl7; 274 (51) : 36741-9)。最近的报告显示Mip/LIN-9调节MYBL2的表达，而且这两种蛋白质都通过控制S和M期细胞周期蛋白而对促进细胞周期行进具有关键作用(NPL19，Pilkinton M et al. , J Biol Chem 2007Jan 5; 282 (I) : 168-75)。另外，通过使用含有23，040种基因的基因组范围cDNA微阵列进行基因表达谱分析，还将MYBL2鉴定为在数种癌症中上调的新分子，这些癌症包括，例如，睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌(PTL1，US60/937, 616，PTL 2，W02004/031410)。认为MYBL2是新的癌抗原，并且MYBL2衍生的表位肽可应用于患有数种肿瘤的患者的癌症免疫治疗。弓丨用表专利文献[PTLl]US60/937,616[PTL2]W02004/031410
非专利文献[NPLljBoon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2) :177-80[NPL2]Boon T&van der Bruggen P, J Exp Med 1996Mar I,183 (3):725-9[NPL 3]Harris CC, J Natl Cancer Inst 19960ct 16,88(20) :1442-55[NPL 4]Butterfield LH et al. , Cancer Res 1999Jul I, 59(13):3134-42[NPL 5]Vissers JL et al. , Cancer Res 1999Nov I, 59 (21):5554-9[NPL 6]van der Burg SH et al. , J Immunol 1996May I,156 (9):3308-14[NPL 7]Tanaka F et al. , Cancer Res 19970ct 15, 57(20):4465-8[NPL 8]Fujie T et al. , Int J Cancer 1999Jan 18,80(2) :169-72[NPL 9]Kikuchi M et al. , Int J Cancer 1999May 5,81(3) :459-66[NPL 10]0iso M et al. , Int J Cancer 1999May 5,81 (3) :387-94[NPL IlJBelli F et al. , J Clin Oncol 20020ct 15,20(20):4169-80[NPL 12]Coulie PG et al. , Immunol Rev 20020ct, 188:33-42[NPL 13]Rosenberg SA et al. , Nat Med 2004Sep, 10 (9):909-15[NPL 14]Nomura N et al. , Nucleic Acids Res. 1988Dec 9,16(23):11075-11089[NPL 15]Robinson C et al. , Oncogene 1996May 2;12 (9):1855-64[NPL 16]Lane et al. , Oncogene 1997May 22;14 (20):2445-53[NPL 17]Sala et al. , Proc Natl Acad Scil997Jan 21;94(2) :532-536[NPL 18]Johnson K et al. , J Biol Chem 1999Dec 17;274(51):36741-9[NPL 19]Pilkinton M et al. , J Biol Chem 2007Jan 5;282 (I):168-7
发明内容
本发明部分基于免疫疗法的合适靶标的发现。由于TAA —般被免疫系统察觉为“自身”并因此常常没有免疫原性，适宜靶标的发现是极其重要的。如上所述，MYBL2 (SEQID N0:6，由GenBank登录号NM_002466(SEQ IDNO: 5)的基因编码)在癌症(如睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌)的组织中上调。因此，是癌症/肿瘤免疫治疗的候选靶标。本发明至少部分地基于MYBL2的具有诱导针对MYBL2的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力的特异性表位肽的鉴定。如下文详细讨论的，使用源自MYBL2的HLA-A2结合性候选肽刺激从健康供体获得的外周血单个核细胞(PBMC)。然后建立了可特异性识别经每种候选肽冲激的HLA-A2阳性靶细胞的CTL。因而，这些结果证明这些肽是鉴定了能诱导针对MYBL2的强而特异性的免疫应答的HLA-A24限制型表位肽。因此，这些结果证明了 MYBL2具有强免疫原性，而且它的表位是肿瘤免疫疗法的有效靶标。因此，本发明的一个目的是提供结合HLA的分离的肽，其是MYBL2 (SEQ ID NO: 6)或其片段。本发明的肽预期具有CTL诱导能力，因此可以用来离体诱导CTL或者用来施用给受试者以诱导针对癌症的免疫应答，癌症的例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌。优选地，所述肽是九肽或者十肽，更优选地是具有选自SEQ ID NO: 2-4的氨基酸序列(尤其是具有本文中显示具有特别强的CTL诱导能力的SEQID NO:3的氨基酸序列)的九肽或者十肽。本发明考虑修饰的肽，具有SEQ ID N0:2_4的氨基酸序列，其中替换或添加了一个、两个或更多个氨基酸，只要所述的修饰的肽保留原始的CTL诱导能力。
进一步，本发明提供编码任何本发明的肽的多核苷酸。这些多核苷酸可以用来诱导具有CTL诱导能力的抗原呈递细胞(APC)或者可以和本发明的肽一样施用给受试者以诱导针对癌症的免疫应答。当施用给受试者时，本发明的肽被呈递在抗原呈递细胞或外来体的表面上，以诱导靶向相应肽的CTL。因此，本发明的一个目的是提供包含任何本发明的肽或多核苷酸的用于诱导CTL的作用剂。此外，包含任何本发明的肽或多核苷酸的作用剂、物质或组合物可以用来治疗和/或预防癌症，和/或防范其手术后复发，这样的癌症包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌。因此，本发明的另一个目的是提供用于治疗和/或预防癌症，和/或防范其手术后复发的药剂，这样的药剂包含任何本发明的肽或多核苷酸。作为本发明的肽或多核苷酸的替代或者补充，本发明的作用剂或药剂包括呈递任何本发明的肽的APC或外来体作为有效成分。本发明的肽或多核苷酸可以用来诱导在表面上呈递HLA抗原与本发明的肽的复合物的APC，例如通过使源自受试者的APC与本发明的肽接触，或者通过将编码本发明的肽的多核苷酸导入到APC中。这样的APC具有针对靶标肽的高的CTL诱导能力，并且能够用于癌症免疫治疗。因此，本发明的另一个目标是提供用于诱导具有CTL诱导能力的APC的方法和通过该方法获得的APC。本发明的另一个目的是提供用于诱导CTL的方法，所述方法包括将CD8-阳性细胞与在其表面上呈递本发明的肽的APC或外来体接触的步骤，或者导入包括编码结合本发明的肽的T细胞受体(TCR)亚单位的多核苷酸的基因的步骤。通过此类方法能够获得的CTL也能够用于癌症的治疗和/或预防，所述癌症的例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌。因此，本发明的另一个目的是提供能够通过本发明的方法获得的CTL。本发明的还有一个目的是提供在有需要的受试者体内诱导针对癌症的免疫应答的方法，所述方法包括施用含有MYBL2或其片段、编码MYBL2或其片段的多核苷酸、或呈递MYBL2或其片段的APC或外来体的作用剂或组合物的步骤。本发明的应用延及多种与MYBL2过表达相关，或者源于MYBL2过表达的疾病中的任何一种，包括癌症，癌症的例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌。更具体地，本发明提供下述[I], 一种分离的寡肽，其包含选自SEQ ID N0:2_4的氨基酸序列，其中该寡肽结合HLA抗原并具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力。[2], 一种分离的寡肽，其中该寡肽结合HLA抗原并具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力，其中该寡肽由选自SEQ ID N0:2-4的氨基酸序列组成，其中插入、替换、缺失和/或添加了 I个、2个或数个氨基酸。[3], [2]的寡肽，其中所述寡肽具有下述特征之一或二者(a)从N端起的第二个氨基酸选自亮氨酸和甲硫氨酸，和
(b) C端氨基酸选自缬氨酸和亮氨酸。[4], [1]-[3]的分离的寡肽，其中所述HLA抗原是HLA-A2。[5], [1]-[4]的分离的寡肽，其中所述寡肽是九肽或者十肽。[6],分离的多核苷酸，其编码[1]_[5]中任一项的寡肽。[7], 一种用于诱导CTL的作用剂，其中所述作用剂包含一种或多种如[1]_[5]中任一项所述的寡肽，或者一种或多种[6]所述的多核苷酸。[8], 一种用于治疗和/或预防癌症和/或防止其手术后复发的药剂，其中所述药剂包含一种或多种如[1]_[5]中任一项所述的寡肽，或者一种或多种如[6]所述的多核苷酸。[9]. [8]的药剂，其配制为供施用于其HLA抗原为HLA-A2的受试者。[10]. [8]或[9]的药剂,其配制为用于治疗癌症。[11].诱导具有CTL诱导能力的抗原呈递细胞(APC)的方法，其中所述方法包括下述步骤之一(a)在体外、离体或体内使APC与[1]-[5]中任一项的寡肽接触；或(b)向APC中导入编码[1]-[5]中任一项的寡肽的多核苷酸。[12].通过任何包括至少一个下述步骤的方法来诱导CTL的方法(a)将⑶8-阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与-[5]中任一项的寡肽的复合物；(b)将CD8-阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与-[5]中任一项的寡肽的复合物；和(c)向T细胞中导入包含编码结合[1]_[5]中任一项的寡肽的的T细胞受体(TCR)亚单位多肽的多核苷酸的基因。[13]. —种分离的抗原呈递细胞，该细胞在其表面上呈递HLA抗原与[1]_[5]中任一项的寡肽的复合物。[14], [13]的APC，其是通过[11]的方法诱导的。[15], 一种分离的CTL，其靶向[1]-[5]中任一项的肽。[16]. [15]的CTL，其是通过[12]的方法诱导的。[17]. —种诱导受试者中针对癌症的免疫应答的方法，包括下述步骤对受试者施用包含[1]_[5]中任一项所述的寡肽、其免疫学活性片段、或编码所述寡肽或免疫学活性片段的的作用剂。应当理解的是，前述发明内容和下面的具体详述均是针对示例性的实施方案而言，并不限定本发明或者本发明的其他备选的实施方案。除了上述之外，在联系附图
和实施例阅读下面的详细说明时，本发明的这些和其它目的和特征将变得更加显而易见。然而，应当理解，前面的发明概要和后面的详细说明都仅仅提出了示例性的实施方案，并不对本发明或本发明的其它可替换实施方案构成限制。尤其是，虽然在本文中就若干具体的实施方案对本发明进行了说明，应当理解这些描述对本发明而言是示例说明性的，不解释成对本发明的限制。在不背离如随附的权利要求所描述的本发明的精神和范围的前提下本领域技术人员将容易地想到本发明的多种修改和应用。类似地，本发明的其它目的、特征、好处和优势是从此处的概要和下文描述的特定实施方案可以容易地想到的，并且是本领域技术人员可以显见的。根据上文的内容并结合随附的实施例、数据、附图以及从中能够合理推断的内容，或者进一步考虑本文中引用的参考文献，这样的目的、特征、好处和优势是容易想到的。
附图简述本领域技术人员在考虑了下文的附图简要说明及对本发明及其优选实施方案的详细说明后将清楚地得知本发明的各个方面的应用。[图I]图I包括一系列照片，(a)和(b)，描绘对用源自MYBL2的肽诱导的CTL进行的 IFN-￥￡1^5 01'测定的结果。用]\^812-402-9-144(5￡0 ID NO: 3)刺激的 8 号孔(a)显示与对照相比强的IFN-Y生成。这些图片上的孔上的方框表示来自相应孔的细胞被扩增以建立CTL系。对比地，作为典型的阴性数据实例，用MYBL2-A02-9-355(SEQ ID NO: I) (b)刺激的CTL未检出特异性的IFN-Y生成。在图中，〃+〃指示针对经适宜肽冲激的靶细胞的IFN-Y生成，而〃-〃指示针对未经任何肽冲激的靶细胞的IFN-Y生成。[图2]图2是描绘IFN-YELISA测定法的结果的线图，显示用MYBL2-A02-9-144(SEQ ID NO: 3)刺激的CTL系的IFN-Y生成。结果证明了通过用该肽刺激而建立的CTL系显示与对照相比强的IFN-Y生成。在图中，〃+〃指示针对经适宜肽冲激的靶细胞的IFN-Y生成，而〃-〃指示针对未经任何肽冲激的靶细胞的IFN-Y生成。[图3]图3是描绘用MYBL2-A02-9-144(SEQID NO: 3)刺激的CTL系通过有限稀释而建立的CTL克隆的IFN-Y的生成的线图。结果证明了通过用该肽刺激而建立的CTL克隆显示与对照相比强的IFN-Y生成。在图中，〃+〃指示针对经适宜肽冲激的靶细胞的IFN-Y生成，而〃-〃指示针对未经任何肽冲激的靶细胞的IFN-Y生成。[图4]图3是描绘针对表达MYBL2和HLA_A*0201的靶细胞的特异性CTL活性的线图。制备用HLA-A*0201或用全长MYBL2基因转染的C0S7细胞作为对照。用MYBL2-A02-9-144(SEQ ID NO:3)建立的 CTL 克隆显示针对用 MYBL2 和 HLA_A*0201 二者转染的C0S7细胞的特异性CTL活性(黑色菱形)。另一方面，没有检测到显著的针对表达HLA-A*0201 (三角形)或MYBL2 (圆形)任一的靶细胞的特异性CTL活性。实施方案的描述现在描述优选的方法、装置、和材料，不过在实施或检验本发明的实施方案时可使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本发明材料和方法之前，要理解本发明不限于特定大小、性状、尺度、材料、方法学、方案等，因为它们可因循例行实验和优化而变化。还要理解，所述描述中使用的术语只是出于描述特定样式或实施方案的目的，而非意图限制本发明的范围，本发明的范围只会由所附权利要求来限制。通过提述明确地将本说明书中提到的每一篇出版物、专利或专利申请的公开文本完整收入本文。然而，本文中无一处可解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类公开文本。如果有冲突，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅为举例说明而不构成限制。I.定义如本文中使用的，词语“一个/种”、“该”、和“所述”意味着“至少一个/种”，除非
另有明确说明。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是经过修饰的残基或非天然存在型残基(诸如相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。如本文中使用的，术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及具有与天然存在型氨基酸相似的功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸指由遗传密码编码的氨基酸，以及在细胞中在翻译后被修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、和0-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”指与天然存在型氨基酸具有相同的基础化学结构(a碳与氢、羧基、氨基、和R基团结合)但具有经过修饰的R基团或经过修饰的主链的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。短语“氨基酸模拟物”指与具有与一般氨基酸不同的结构但发挥与一般氨基酸相似的功能的化学化合物。氨基酸在本文中可以通过它们公知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指称。术语“基因”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”在本文中除非另有明确说明可互换使用，而且与氨基酸类似地通过它们普遍接受的单字母代码来指称。术语“(作用)剂”和“组合物”在本文中可以互换使用，指包含规定量的规定成分的产品，以及通过所述规定量的规定成分的组合直接或间接地得到的任何产品。这些术语当与“药剂”和“药物组合物”关联使用时，意在涵盖包括活性成分以及任何组成担载体的惰性成分的产品，以及通过所述任何两种或更多种成分的组合、复合或聚集，或通过一种或多种组分的解离，或通过一种或多种组分的其他类型的反应或相互作用而直接或间接地得到的任何产品。相应地，在本发明的语境中，术语“药剂”和“药物组合物”可互换地用于指任何通过混合本发明的分子或化合物与药学或生理学上可接受的担载体而制成的产品。本文中所用的短语“药学上可接受的担载体”或“生理学上可接受的担载体”意思是药学上或生理学上可接受的材料、组合物、物质或媒介，包括但不限于担载或运输主题的支架多聚药效团从一个器官或身体部分到另一个器官或身体部分所涉及的液体或固体填充剂、赋形齐U、溶剂或包埋材料。术语“活性成分”在本文中意指作用剂或组合物中具有生物学活性或生理学活性的物质。尤其是，在药剂或药物组合物中，“活性成分”是指显示客观的药理学效果的物质。例如，在用于治疗或预防癌症的药剂或药物组合物的场合，作用剂或组合物中的活性成分可直接或间接地导致对于癌细胞的至少一种生物学或生理学作用。优选地，这样的作用包括减少或抑制癌细胞生长、破坏或杀死癌细胞和/或癌组织，等等。典型地，活性成分的间接效果包括诱导可识别或杀死癌细胞的CTL。在配制之前，“活性成分”又称“原料药” (bulk)、“药物物质” (drug substance)或“技术产品” (technical product)。除非另有定义，术语“癌症”指过表达MYBL2基因的癌症，过表达MYBL2的癌症的实例包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌。除非另有定义，术语“细胞毒性T淋巴细胞”、“细胞毒性T细胞”和“CTL”在本文中可互换使用，而且除非另有明确说明，指能够识别非自身细胞(例如肿瘤细胞、病毒感染的细胞)并诱导此类细胞死亡的T淋巴细胞亚群。除非另有定义，术语“HLA-A02”指包含诸如HLA_A*-0201或HLA_A*-0206等亚型的HLA-A2类型。以本发明的材料和方法在“治疗”癌症的语境中有用为限，如果治疗导致临床上的 收益，例如受试者体内MYBL2基因表达的减少、或者癌症的尺寸、普遍性(prevalence)或转移潜力的降低，则认为治疗是“有效的”。当预防性地进行治疗时，“有效的”意思是其阻碍或阻止癌症的形成，或者阻止或减轻癌症的临床症状。“有效性”结合用于诊断或治疗特定肿瘤类型的任何已知方法来确定。除非另有定义，如本文中所用的术语“试剂盒”是指试剂及其他材料的组合。考虑术语“试剂盒”可包括微阵列、芯片、标记物、等等。术语“试剂盒”不意图限于某种特定的试剂和/或材料组合。如本文中使用的，在受试者或者患者的语境中，短语“HLA-A2阳性”是指受试者或患者纯合地或者杂合地拥有HLA-A2抗原基因,且HLA-A2抗原在受试者或患者的细胞中作为HLA抗原表达。以本发明的材料和方法可用于“预防”和“防范”癌症的语境为限，此类术语在本文中可互换使用，指降低缘于疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。预防和防范可发生于“一级、二级和三级预防水平”。一级预防和防范避免疾病的发生，而二级和三级预防和防范水平涵盖旨在预防和防范疾病的进展与症状的出现、以及通过恢复功能和减轻疾病相关并发症来降低已建立的疾病的负面影响的活动。或者，预防和防范可包括旨在减轻特定病症的严重性(例如降低肿瘤的增殖和转移等)的广泛的预防性疗法。在本发明的语境中，治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发包括任何下述步骤，诸如手术去除癌细胞、抑制癌性细胞生长、肿瘤衰退或消退、诱导癌症减退和阻抑癌症发生、及降低或抑制转移。癌症的有效治疗和/或预防可降低患癌个体死亡率及改善其预后，降低其血液中肿瘤标志物的水平，及减轻其伴随癌症的可检测症状。例如，症状的减轻或改善构成有效治疗和/或预防，包括10%、20%、30%或更多降低，或实现病情稳定。除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的普遍理解相同的含义。II.肽为了证明源自MYBL2的肽发挥被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所识别的抗原的功能，对源自MYBL2 (SEQ ID NO: 6)的肽进行了分析以确定它们是否为HLA-A2限制性的抗原表位，HLA-A2是经常遇到的HLA等位基因(Date Y et al. , Tissue Antigens47:93-101, 1996;Kondo A et al. , J Immunol 155:4307-12，1995;Kubo RT et al. , JImmunol 152:3913-24,1994)。基于它们对HLA-A2的结合亲和力，鉴定了源自MYBL2的HLA-A2结合肽的候选者。下述肽被认为是候选肽MYBL2-A02-9-597(SEQ ID NO :2)MYBL2-A02-9-144(SEQ ID NO :3)和MYBL2-A02-10-596(SEQ ID NO:4)。用加载了这些肽的树突细胞(DC)体外刺激T细胞后，使用下述肽成功地建立了CTL
MYBL2-A02-9-144(SEQ ID NO:3)。这些建立的CTL针对经相应肽冲激的靶细胞显示强且特异性的CTL活性。本文中的这些结果证明MYBL2是被CTL识别的抗原，且这些肽可能是MYBL2的受HLA-A2限制的表位肽。由于MYBL2基因在大多数癌细胞和癌症组织(包括但不限于例如睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌的细胞和组织)中过表达，而在正常器官中不表达，它是良好的免疫治疗靶标。因此，本发明提供对应于MYBL2的被CTL识别的表位的九肽(由九个氨基酸残基组成的肽)和十肽(由十个氨基酸残基组成的肽)。本发明的寡肽的特别优选的例子包括那些具有选自SEQ ID N0:2-4，特别是SEQ ID N0:3的氨基酸序列的肽。一般而言，目前可以通过互联网访问的软件程序,如Parker KC et al. , J Immunol1994Jan I, 152(1) :163-75等中描述的那些，可以用来在计算机上计算不同肽与HLA抗原之间的结合亲和力。与HLA抗原的结合亲和力可以按照例如Parker KC et al. , J Immunol1994Jan 1，152 (I) : 163-75 和 Kuzushima K et al. , Blood 2001，98 (6) : 1872-81 中描述的那样进行测定。用于测定结合亲和力的方法在例如Journal of Immunological Methods, I995, 185:181-190. ;Protein Science, 2000，9:1838-1846 中有描述。因而可以利用这样的软件程序来选择具有高度的HLA抗原结合亲和力的源自MYBL2的片段。因此，本发明涵盖由通过这些已知程序被确定为可与HLA抗原结合的MYBL2片段构成的肽。本发明的肽可以是由MYBL2全长构成的肽。此外，本发明肽，尤其是本发明的九肽和十肽，在其侧翼可以具有额外的氨基酸残基，只要所述肽保持其CTL诱导能力即可。本发明肽的侧翼的氨基酸残基可以由任何种类的氨基酸构成，只要其不损害原来的肽的CTL诱导能力。因此，本发明涵盖这样的肽，其包含源自MYBL2的肽且具有对HLA抗原的结合亲和力。这样的肽典型地少于约40个氨基酸，经常少于约20个氨基酸，通常少于约15个氨基酸。一般而言，蛋白质中一个、两个、或更多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能，或者在有些情况下甚至会增强原蛋白质的期望功能。事实上，已知有经过修饰的肽(即由与原始参照序列相比其中修饰(即替换、缺失、添加和/或插入)一个、两个或数个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的肽)保留原始肽的生物学活性(Mark et al.，Proc Natl AcadSci USA 1984，81:5662-6;Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10:6487-500;Dalbadie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在一个实施方案中，本发明的寡肽可既具有CTL诱导能力，又具有选自SEQ ID NO: 2-4，尤其是SEQIDNO:3的氨基酸序列中添加、插入、缺失、和/或替换一个、两个或甚至更多个氨基酸而得到的氨基酸序列。本领域技术人员认可，改变氨基酸序列中的单个氨基酸或少数百分比氨基酸的个别添加或替换往往会导致原始氨基酸侧链的特性得以保留。因此，它们常规上称作“保守替换”或“保守修饰”，其中对蛋白质的改变导致具有与原始蛋白质类似的性质和功能的修饰蛋白质。提供功能上相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。期望保留的氨基酸侧链特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、亲水性氨基酸(R, D, N，C，E, Q, G，H，K，S，T)、和具有下面的共同官能团或特征的侧链脂肪族侧链(G，A, VL, I, P);含羟基侧链(S，T，Y);含硫原子侧链(C, M);含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q);含碱侧链(R，K，H);和含芳香族侧链(H，F，Y，W)。另外，下面的八组各自含有本领域公认互为保守替换的氨基酸I)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)； 3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C),甲硫氨酸(M)(参见例如 Creighton, Proteins 1984)。此类保守修饰肽也被视为本发明的肽。然而，本发明的肽不限于此，可包括非保守修饰，只要该肽保留原始肽的CTL诱导能力。另外，经过修饰的肽不应排除MYBL2的多态变体、种间同源物、和等位基因中的可诱导CTL的肽。为了保持所需的CTL诱导能力，可以修饰(插入、缺失、添加和/或替换)少数(例如，I个、2个或数个)或小百分比的氨基酸。这里，术语“数个”意指5个以下的氨基酸，如3个以下。要被修饰的氨基酸的百分比优选为20%以下，更优选15%以下，进一步更优选10%以下，或1-5%。此外，可以对本发明的肽插入、替换或添加氨基酸残基，或者删除氨基酸残基，来获得更高的结合亲和力。当在免疫疗法的语境中使用时，本发明的肽应呈递在细胞或外来体的表面上，优选作为与HLA抗原的复合物。因此，优选选择不仅诱导CTL而且拥有对HLA抗原的高结合亲和力的肽。为此，可通过替换、插入、缺失和/或添加氨基酸残基来对肽进行修饰，产生具有改良的结合亲和力的修饰肽。除了天然被展示的肽之外，由于已经知道通过结合HLA抗原而被展示的肽的序列规律(J Immunol 1994, 152:3913; Immunogenetics1995, 41:178; J Immunol 1994，155:4307)，可将基于此类规律的修饰引入本发明的免疫原性肽。具有高的HLA-A2结合亲和力的肽倾向于具有亮氨酸或甲硫氨酸残基作为自N端起的第二个氨基酸，以及缬氨酸或亮氨酸残基作为C端氨基酸。因此，具有SEQID NO: 2-4的氨基酸序列，其中所述SEQ ID No的氨基酸序列的自N端起的第二个氨基酸被替换为亮氨酸或甲硫氨酸、和/或其中所述SEQID No的氨基酸序列的C端被替换为缬氨酸或亮氨酸的肽涵盖在本发明之内。不仅可以在肽的末端氨基酸处引入替换，而且可以在肽的潜在TCR识别位置处引入替换。数项研究已证明了肽中的氨基酸替换可等同于或好于原来，例如 CAP1、p53(264_272)、Her-2/neu (369-377)或 gpl00(2(l9_217)(Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577，1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol.
(2002)FebI;168(3):1338-47.，S. 0. Dionne et al.Cancer Immunol immunother.
(2003)52:199-206及 S. 0. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004)53, 307-314)。本发明还考虑向所描述的肽的N和/或C端添加一个、两个或数个氨基酸。此类具有高HLA抗原结合亲和力且保留CTL诱导能力的修饰肽也包含在本发明之内。然而，当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同时，可能诱导副作用，诸如自身免疫性病症和/或针对特定物质的变应性症状。因此，优选的是，首先利用可用的数据库实施同源性搜索，以避免肽的序列与另一种蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。当根据同源性搜索清楚了即使与目标肽相比仅相差I个或2个氨基酸的 肽亦不存在时，可以修饰目标肽以提高其与HLA抗原的结合亲和力，和/或提高其CTL诱导能力，而没有任何发生此类副作用的危险。虽然预期如上所述的对HLA抗原具有高结合亲和力的肽是高度有效的，但还是对根据高结合亲和力的存在为指标选出的候选肽检查了 CTL诱导能力的存在。这里，短语“CTL诱导能力”指肽被呈递到抗原呈递细胞(APC)上时诱导CTL的能力。另外，“CTL诱导能力”包括肽诱导CTL活化、CTL增殖、促进CTL溶解靶细胞、和提高CTL IFN- y生成的能力。CTL诱导能力的确认如下来实现，诱导携带人MHC抗原的抗原呈递细胞(例如B-淋巴细胞、巨噬细胞、和树突细胞(DC))，或者更具体地说，源自人外周血单核白细胞的DC，并且在用肽刺激后，与⑶8-阳性细胞混合，然后测量由CTL针对靶细胞生成和释放的IFN-y。作为反应系统，可使用已经制成的表达人HLA抗原的转基因动物，例如BenMohamed L,Krishnan R, Longmate J, Auge C，Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum TmmunoI2000Aug, 61 (8) :764-79中描述的那些。例如，可以用51Cr等放射性标记靶细胞，并且可以自靶细胞释放的放射性计算细胞毒性活性。或者，CTL诱导能力可以如下评估测量在携带固定化肽的APC存在下由CTL生成和释放的IFN- y，并使用抗IFN- y单克隆抗体显现培养基上的抑制区。作为如上所述检查肽的CTL诱导能力的结果，发现选自SEQ ID N0:2_4，尤其是SEQID N0:3所示的氨基酸序列的肽的九肽或十肽不但具有对HLA抗原的高亲和力，还具有特别高的CTL诱导能力。因此，例举这些肽为本发明优选的实施方案。另外，同源性分析的结果显示了该肽与自任何其它已知人基因产物衍生的肽没有显著的同源性。这降低了用于免疫疗法时发生未知的或不想要的免疫应答的可能性。因此，也是根据这个方面，这些肽可用于在癌症患者中引发针对MYBL2的免疫力。因此，本发明的肽，优选具有SEQ ID N0:2-4，尤其是SEQ ID NO:3的氨基酸序列的肽。除上文所述修饰之外，还可将本发明的肽连接至其它物质，只要所得的连接肽保留原始肽的CTL诱导能力，并且，更优选地，还保留所需的HLA结合。合适的物质包括肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天然的和合成的聚合物等。肽还可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、和/或磷酸化，前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。这些修饰可赋予额外的功能(例如靶向功能和投递功能)和/或使肽稳定。例如，为了提高多肽的体内稳定性，本领域已知引入D-氨基酸、氨基酸模拟物或非天然氨基酸；此构思也可适用于本发明多肽。可以以多种方式测定多肽的稳定性。例如，可使用肽酶和各种生物学介质(诸如人血浆和血清)来测试稳定性(参见例如Verhoef etal. , Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11:291-302)。当本发明的肽包含半胱氨酸残基时，肽倾向于通过半胱氨酸残基的SH基团之间的二硫键形成二聚体。因此，本发明的肽的二聚体也包括在本发明的肽之内。此外，如上文所述，在上述替换、缺失或添加了一个、两个或数个氨基酸残基的修饰肽中，可以筛选或选择与原始肽相比活性相同或更高者。因此，本发明还提供由于筛选或选择与原始肽相比活性相同或更高的修饰肽的方法。一个示例性的方法可包括下述步骤a:对本发明的肽替换、删除或添加至少一个氨基酸残基， b:测定肽的活性，和c :选择具有与原始肽相比相同或更高活性的肽。本文中，要测定的活性可包括HLA结合活性，APC或CTL诱导能力，和细胞毒活性。本文中，本发明的肽也可以称为“MYBL2肽”或“MYBL2多肽”。III.MYBL2 狀的制各本发明的肽可使用公知技术来制备。例如，肽可以通过合成、使用重组DNA技术或化学合成来制备。本发明的肽可个别地合成，或合成为由两个或更多个肽构成的较长多肽。然后可以分离，即纯化或分离所述肽，使其基本上不含其它天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段或任何其它化学物质。本发明的肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化，前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。其他示例性的修饰包括掺入D-氨基酸或其他可用的氨基酸模拟物，以便例如增加肽的血清半寿期。可以根据选定的氨基酸序列，借助化学合成来获得本发明的肽。可适用于合成的常规肽合成法的例子包括但不限于(i)Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976 ；(iii) Peptide Synthesis (日文)，Maruzen Co. , 1975 ；(iv)Basics and Experiment of Peptide Synthesis (日文),MaruzenCo.,1985 ；(v) Development of Pharmaceuticals (second volume)(日文)，Vol. 14 (peptidesynthesis), Hirokawa, 1991 ；(vi)W099/67288 ;和(vii)Barany G. & Merrifield R. B. , Peptides Vol. 2，"Solid Phase PeptideSynthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118。或者，可应用任何已知的遗传工程肽生产方法来获得本发明的肽(例如Morrison J, J Bacteriology 1977,132:349-51;Clark-Curtiss & Curtiss, Methods inEnzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101:347-62)。例如，首先，制备包含处于可表达形式(例如处于相当于启动子序列的调节序列下游)的编码目标肽的多核苷酸的合适载体，并转化入合适的宿主细胞。然后培养宿主细胞以生成感兴趣的肽。也可以采用体外翻译系统在体外生产肽。IV.多核苷酸本发明还提供编码任何上述本发明肽的多核苷酸。这些包括源自天然存在型MYBL2 基因(GenBank Accession No. NM_002466 (SEQ ID NO: 5))的多核苷酸以及具有它们的经过保守修饰的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短语“经过保守修饰的核苷酸序列”指编码相同或本质上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性，对于任何给定蛋白质都有极其多种功能上相同的核酸来编码它。例如，密码子GCA、GCC、GCG、和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子规定为丙氨酸的任何位置处，该密码子可改变成任何相应所述密码子，而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文中编码肽的每一种核酸序列也涵盖该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域普通技术人员会认识到，核酸中的每一个密码子(AUG和TGG除外，AUG在正常情况下是甲硫氨酸的唯一密码子，而TGG在正常情况下是色氨酸的唯一密码子)都可以被修饰以产生功能上相 同的分子。因而，每一种所公开的序列隐含涵盖了编码肽的核酸的每一种沉默变异。本发明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物构成。本领域公知，DNA由碱基诸如天然存在的A、T、C、和G合适地构成，而T在RNA中被U替换。本发明的多核苷酸可编码多个本发明肽，其中它们之间有或无居间氨基酸序列存在。例如，居间氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻译的肽的切割位点(例如酶识别序列)。另外，多核苷酸除编码本发明肽的编码序列以外还可包括任何额外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表达肽所需要的调节序列的重组多核苷酸，或者可以是具有标志基因等等的表达载体(质粒)。一般而言，此类重组多核苷酸可通过常规重组技术操作多核苷酸来制备，例如通过使用聚合酶和内切核酸酶。重组和化学合成技术都可用来生成本发明的多核苷酸。例如，可以通过插入在转染入感受态细胞后能表达的适宜载体来生成多核苷酸。或者，可借助PCR技术或通过在合适宿主中的表达来扩增多核苷酸(参见例如Sambrook et al. , MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,1989)。或者，可使用固相技术来合成多核苷酸，如Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron1992，48:2223-311;Matthes et al. , EMBO J 1984，3:801-5 中记载的。V.夕卜来体(exosomes)本发明进一步提供了称作外来体的细胞内囊泡，这些外来体在它们的表面上呈递本发明肽与HLA抗原之间形成的复合体。外来体可以通过，例如在日本专利申请公表公报平11-510507和W099/03499中详细描述的方法来制备，并可以用从作为治疗和/或预防对象的患者获得的APC制备。本发明的外来体可以作为疫苗以与本发明的肽相似的方式进行接种。复合体中包含的HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防的受试者的类型匹配。例如，HLA-A2(尤其是A*0201和A*0206)在日本人群中是主要的，因而适合用于日本人患者的治疗。使用在日本人和白种人中高度表达的A2型对于获得有效的结果是有利的。典型地，在临床上，预先考察需要治疗的患者的HLA抗原类型，这样就能够合适地选择对这种抗原具有高水平的结合亲和力、或者具有藉由抗原呈递的CTL诱导能力的肽。此外，为了获得具有高结合亲和力和CTL诱导能力二者的肽，可以在天然存在的MYBL2部分肽的氨基酸序列的基础上进行I个、2个或数个氨基酸的替换和/或添加。当本发明的外来体使用A2型HLA抗原时，具有SEQ ID NO: 2_4中任一项，尤其是SEQ ID NO:3的序列的肽是有用的。VI.杭原旱递细朐(APC)本发明还提供在其表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物的分离的APC。所述APC可源自作为治疗和/或预防对象的患者，而且可作为疫苗单独地或与其它药物(包括本发明的肽、外来体、或CTL)组合来施用。APC不限于特定种类的细胞，包括树突细胞(DC)、Langerhans细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞，已知这些细胞可在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原，以供淋巴细胞识别。由于DC是APC中具有最强CTL诱导作用的代表性APC，DC可以用作本发明的APC。 例如，可通过自外周血单核细胞诱导DC，然后在体外、离体或在体内用本发明的肽接触(刺激)它们来获得APC。当对受试者施用本发明的肽时，在受试者的身体中诱导出呈递本发明肽的APC。因此，可以通过对受试者使用本发明的肽，然后从受试者收集APC本发明的APC，来获得本发明的APC。或者，可以通过使从受试者收集的APC与本发明的肽接触来获得本发明的APC。本发明的APC可以单独或者与其他药物，包括本发明的肽、外来体或CTL组合施用给受试者，以在受试者体内诱导针对癌症的免疫应答。离体施用可包括下述步骤a :自第一受试者收集APC ；b :使肽接触步骤a的APC ;并c :对第二受试者步骤b的APC。第一受试者和第二受试者可以是同一个体，或者可以是不同个体。步骤b获得的APC可以作为疫苗施用来治疗和/或预防癌症，包括睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌。本发明还提供用于制备诱导APC的药物组合物的方法或工艺，其中所述方法包括将本发明的肽与药学上可接受的担载体混合或配制的步骤。依照本发明的一个方面，本发明的APC具有高水平的CTL诱导能力。在术语“高水平的CTL诱导能力”中，高水平是相对于未与肽接触或与不能诱导CTL的肽接触的APC的该水平而言的。这样的具有高水平CTL诱导能力的APC除了用上文描述的方法外，还包括在体外将含有编码本发明肽的多核苷酸的基因转移至APC的步骤的方法来制备。所导入的基因可以是DNA或RNA的形式。用于进行导入的方法的例子包括但不具体限于本领域中常规实施的各种方法，诸如可使用脂质体转染、电穿孔、和磷酸钙法。更具体的说，可以如CancerRes 1996，56:5672-7; J Immunol 1998，161:5607-13; J Exp Medl996, 184:465-72;国际公开文本No. 2000-509281的已
公开日文翻译中所述来实施。通过将基因转移入APC，基因在细胞中经历转录、翻译、等等，然后得到的蛋白质被MHCI类或II类加工，并经由呈递途径呈递给本发明的肽。VII.细胞毒件T细胞(细胞毒件T淋巴细胞CTL)诱导出的针对任何本发明肽的细胞毒性T细胞可在体内加强靶向肿瘤相关内皮的免疫应答，并且因此可以以与肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本发明还提供由任何本发明肽特异性诱导或活化的、分离的CTL。此类CTL可通过下述步骤来获得(I)对受试者施用本发明的肽，并从该受试者收集CTL;或(2)在体外用本发明的肽接触(刺激)源自受试者的APC，以及CD8阳性细胞或外周血单核白细胞，然后分离CTL ;或(3)在体外使CD8-阳性细胞或外周血单核白细胞接触在其表面上呈递HLA抗原与肽之间形成的复合物的APC或外来体，然后分离CTL ;或⑷向CTL中导入包括编码能结合本发明的肽的T细胞受体(TCR)亚单位的多核苷酸的基因。上述APC或外来体可通过上文记载的方法来制备，而且(4)之方法的详情记载于下文“VIII.T细胞受体(TCR) ”部分。可以从要进行治疗和/或预防的患者获取本发明的CTL，而且可以将它们单独施用，或者与其它药物(包括本发明的肽或外来体)组合施用以产生调节效果。所得到的CTL特异性针对呈递本发明的肽(例如与用于诱导的肽相同的肽)的靶细胞起作用。靶细胞可以是内源表达MYBL2的细胞，例如癌细胞，或者或被MYBL2基因转染的细胞；而且因本发明肽的刺激而在细胞表面上呈递本发明肽的细胞也可充当活化CTL攻击的靶标。 VIII. T 细朐等体(TCR)本发明还提供包含编码能够形成T细胞受体(TCR)的亚单位的多肽的核酸的组合物，及使用该组合物的方法。这些TCR亚基能够形成TCR，后者赋予T细胞以针对表达MYBL2的肿瘤细胞的特异性。通过使用本领域已知的方法，可鉴定出在用本发明的一种或多种肽诱导的CTL中表达的TCRa和0链的核酸序列(W02007/032255及Morganet al. , J Immunol, 171, 3288 (2003)) 0例如，优选用PCR方法分析TCR。用于分析的PCR引物可以是，例如，作为5’侧引物的5’ -R引物(5’ -gtctaccaggcattcgcttcat-3’)(SEQ ID NO:7)，以及作为3’侧引物的对TCR a链C区特异的3_TRa_C引物(5，-tcagctggaccacagccgcagcgt-3，)(SEQ ID NO: 8),对 TCRP 链 Cl 区特异的 3_TRb_Cl引物(5，-tcagaaatcctttctcttgac-3 ' ) (SEQ ID NO :9),或对 TCR 3 链 C2 区特异的3_TRbeta_C2 引物(5，-ctagcctctggaatcctttctctt-3，)(SEQ ID NO: 10),但不限于此。衍生的TCR能够以高亲合力展示MYBL2肽，并任选地在体内和体外介导针对呈递MYBL2肽的靶细胞的高效杀伤。可以将编码TCR亚单位的核酸掺入合适的载体，例如逆转录病毒载体中。这些载体是本领域公知的。可以将所述核酸或者包含它们的载体有用地转入T细胞，例如来自患者的T细胞中。有利的是，本发明提供一种即配即用型组合物，其容许快速修饰患者自己的T细胞(或其他哺乳动物的T细胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌细胞杀伤特性的修饰型T细胞。特异性的TCR是这样的受体，它能够特异性地识别本发明的肽与HLA分子的复合物，当TCR处于T细胞的表面上时给予T细胞针对靶细胞的特异性。上述复合物的特异性识别可以通过任何已知方法来确认，优选的方法包括，例如，利用HLA分子和本发明的肽的四聚体分析、以及ELISP0T测定。通过实施ELISP0T测定，可以确认在细胞表面上表达TCR的T细胞借助TCR识别细胞，且信号在细胞内被传递。也可以通过已知方法来确认上述复合物当存在于T细胞表面时能够给予T细胞以细胞毒活性。优选的方法包括，例如，测定针对HLA阳性靶细胞的细胞毒活性，例如铬释放测定。
此外，本发明提供通过用编码在HLA-A02的背景下结合MYBL2肽(例如SEQ IDN0:2-4，尤其是SEQ ID N0:3)的TCR亚单位多肽的核酸转导而制备的CTL。经过转导的CTL在体内能够归巢(homing)到癌细胞，并且可以利用公知的培养方法体外扩增(例如 Kawakami et al. , J Immunol.，142，3452-3461 (1989))。可以利用本发明的 T 细胞来形成免疫原性组合物，所述组合物可以用来在需要治疗或保护的患者中治疗或预防癌症(W02006/031221)。IX.药剂或药物组合物由于MYBL2表达在癌症(包括睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌)中与正常组织相比特异性上升，本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸可用于治疗和/或预防癌症或肿瘤，和/或预防它们的手术后复发。因此，本发明提供用于治疗和/或预防癌症或肿瘤，和/或预防它们的手术后复发的药剂或药物组合物，这样的药剂或药物组合物包括一种或多种本发明肽或编码所述肽的多核苷酸作为活性成分。或者，可以在任何上述外来体或细胞诸如APC的表面上表达本发明的肽，以用作药剂或药物组合物。另夕卜，上述靶向任何本发明的肽的CTL也可用作本发明药剂或药物组合物的活性成分。 在另一个实施方案中，本发明还提供选自下组的活性成分在制备用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物或药剂中的用途(a)本发明的肽，(b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC或外来体，和(d)本发明的细胞毒性T细胞。或者，本发明进一步提供用于治疗癌症或肿瘤的选自下组的活性成分(a)本发明的肽，(b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，(C)在其表面上呈递本发明的肽的APC或外来体，和(d)本发明的细胞毒性T细胞。或者，本发明进一步提供一种制备用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物或药剂的方法或工艺，其中该方法或工艺包括配制药学或生理学上可接受的担载体与选自下组的活性成分作为活性成分的步骤(a)本发明的肽，(b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC或外来体，和(d)本发明的细胞毒性T细胞。在另一个实施方案中，本发明还提供一种制备用于治疗癌症或肿瘤的药物组合物或药剂的方法或工艺，其中该方法或工艺包括混合活性成分与药学或生理学可接受的担载体的步骤，其中所述活性成分选自下组(a)本发明的肽，(b)处于可表达形式的编码如本文中公开的肽的核酸，(C)在其表面上呈递本发明的肽的APC或外来体，和(d)本发明的细胞毒性T细胞。
或者，本发明的药物组合物或药剂可用于防范癌症或肿瘤和/或预防其手术后复发。本发明的药剂和药物组合物可用作疫苗。在本发明的语境中，短语“疫苗”(也称作“免疫原性组合物”)指具有在接种入动物后诱导抗肿瘤免疫力的功能的物质。本发明的药剂或药物组合物可用于在受试者或患者(包括人和任何其它哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、犬、绵羊、山羊、猪、牛、马、猴、狒狒、和黑猩猩，特别是商业上重要的动物或驯养的动物)中治疗和/或预防癌症或肿瘤，和/或预防其手术后复发。依照本发明，已经发现具有选自SEQ ID NO:2-4中任一个，尤其是SEQID N0:3的氨基酸序列的肽是能诱导强且特异性的免疫应答的HLA-A2限制性表位肽。因此，包括任何这些具有SEQ ID NO:2-4中任一个，尤其是SEQ IDN0:3的氨基酸序列的肽的本发明药剂或药物组合物特别适合于对其HLA抗原为HLA-A2的受试者施用。对于包含编码这些肽中的任一个的多核苷酸(即本发明的多核苷酸)的药剂和药物组合物也是如此。 要用本发明的药剂或药物组合物治疗的癌症或肿瘤不受限制，包括其中涉及(例如过表达)MYBL2的所有种类的癌症或肿瘤，包括例如睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌。本发明的药剂或药物组合物除上述活性成分之外还可含有其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽、编码所述其它肽的其它多核苷酸、呈递所述其它肽的其它细胞，等等。在本文中，其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽以癌症特异性抗原(例如已鉴定的TAA)为例，但是不限于此。如果需要，本发明的药剂或药物组合物可任选包括其它治疗性物质作为活性成分，只要该物质不抑制活性成分(例如任何本发明肽)的抗肿瘤效果。例如，配制剂可包括抗炎剂、镇痛剂、化疗剂、诸如此类。除了在药物自身中包括其它治疗性物质之外，本发明的药物还可以与一种或多种其它药理学作用剂顺序或同时施用。药物和药理学作用剂或的量取决于例如所使用的药理学作用剂的类型、所治疗的疾病、及施用的时序安排和路径。应当理解，除在本文中具体提及的组分之外，本发明的药剂或药物组合物可包括与所讨论的配制剂类型相关的本领域常规的其它制剂或组合物。在本发明的一个实施方案中，本发明的药剂或药物组合物可包括在制品和试剂盒中，该制品和试剂盒含有可用于治疗要治疗的疾病(例如癌症)的病理状况的材料。制品可包括任何本发明药剂或药物组合物的容器及标签。合适的容器包括瓶、管形瓶、和试管。容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器上的标签应指明该药剂用于治疗或预防疾病的一种或多种状况。标签还可指明关于施用的指导等等。除上文描述的容器之外，包括本发明药剂或药物组合物的试剂盒还可任选进一步包括第二容器，其中装有药学可接受的稀释剂。它可进一步包括从商业和用户立场看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器、和载有使用说明的包装插页。如果期望的话，药剂或药物组合物可在药包或分配器装置中提供，该药包或分配器装置可装有一个或多个含有活性成分的单位剂型。例如，药包可包括金属或塑料箔，诸如泡罩包。药包或分配器装置可附有施用说明书。(I)含有肽作为活性成分的药剂或药物组合物
本发明的肽可以作为药剂或药物组合物直接施用，或者如果必要，通过常规配制方法来配制。在后一种情况中，除本发明的肽之外，还可以视情况包括通常用于药物的担载体、赋形剂、等等，没有特别限制。此类担载体的例子有灭菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液、等等。另外，药剂或药物组合物可在必要时含有稳定剂、悬浮液、防腐剂、表面活性剂等等。本发明的药剂或药物组合物可用于抗癌目的。本发明的肽可制备成由两种或更多种本发明肽构成的组合以在体内诱导CTL。肽组合可采取鸡尾酒的形式，或者可使用标准技术彼此缀合。例如，可以将各个肽化学连接或表达成为单一融合多肽序列。组合中的各个肽可以是相同的或不同的。通过施用本发明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后诱导出与所展示的肽与HLA抗原之间形成的复合物特异性起反应的CTL。或者，可以通过从受试者分离APC (例如DC)，并用本发明的肽刺激它们，来获得在其细胞表面上展示任何本发明的肽的APC，将这些APC重新施用给受试者而在受试者体内诱导出CTL，结果，可提高针对肿瘤相关内皮的攻击性。包括本发明的肽作为活性成分、用于治疗和/或预防癌症或肿瘤的药剂或药物组合物还可包括已知可有效建立细胞免疫的佐剂。或者，所述药剂或药物组合物可以与其它 活性成分一起施用，或者通过配制成颗粒来施用。佐剂指在与具有免疫学活性的蛋白质一起(或顺序)施用时增强针对该蛋白质的免疫应答的化合物。本文中涵盖的佐剂包括文献中记载的那些(Clin Microbiol Rev 1994,7:277-89)。合适佐剂的例子包括但不限于磷酸招、氢氧化招、明帆、霍乱毒素、沙门氏菌毒素、不完全弗氏佐剂(IFA)、完全弗氏佐剂(CFA)、ISCOMatrix, GM-CSF, CpG, 0/W 乳液等等，但不限于此。另外，可方便地使用脂质体配制剂、其中肽结合至几微米直径的珠子的颗粒配制齐U、和其中脂质结合至肽的配制剂。在本发明的另一个实施方案中，本发明的肽还可以作为可药用盐的形式施用。所述盐的优选实例包括与碱金属的盐、与金属的盐、与有机碱的盐、与有机酸的盐、和与无机酸的盐。本文中所用的“可药用盐”是指保留所述化合物的生物学有效性和性质，通过与无机酸或碱(如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等)反应所得到的盐。优选的盐包括与碱金属的盐、与金属的盐、与有机碱的盐、与有机酸的盐、和与无机酸的盐。在一些实施方案中，本发明的药剂或药物组合物可进一步包括引发(prime)CTL的成分。已经确认脂质是能够在体内引发针对病毒抗原的CTL的作用剂或组合物。例如，可将棕榈酸残基连接至赖氨酸残基的e-和a-氨基，然后连接至本发明的肽。然后脂化肽可以在胶束或颗粒中直接施用，掺入脂质体，或在佐剂中乳化。作为脂质引发CTL应答的另一个例子，大肠杆菌(E. coli)脂蛋白，诸如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS),当与适宜的肽共价连接时,可用来引发CTL (参见例如Deres et al. , Nature1989，342:561-4)。施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，及系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。本发明肽的剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当加以调整，通常是0. OOlmg至IOOOmg,例如0. OOlmg至IOOOmg,例如0. Img至IOmg,而且可以每少数天施用一次至每少数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。
(2)含有多核苷酸作为活性成分的药剂或药物组合物本发明的药剂或药物组合物也可含有处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸。在本文中，短语“处于可表达形式的”意味着多核苷酸在导入细胞时会在体内表达成诱导抗肿瘤免疫力的多肽。在一个例示性的实施方案中，感兴趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表达所必需的调节元件。多核苷酸可具有为实现稳定插入靶细胞的基因组所需的配置(关于同源重组盒载体的描述参见例如Thomas KR&Capecchi MR, Cell1987,51:503-12)。参见例如 Wolff et al. , Science 1990，247:1465-8;美国专利 No. 5，580，859; 5，589，466; 5，804，566; 5，739，118; 5，736，524; 5，679，647;及 W098/04720。基于DNA的投递技术的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介导的)投递、阳离子脂质复合物、和颗粒介导的(“基因枪”)或压力介导的投递(参见例如美国专利No. 5，922，687)。本发明的肽还可用病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，诸如牛痘或禽痘。这种办法涉及使用例如牛痘病毒作为载体来表达编码肽的核苷酸序列。在导入宿主后，重组牛痘病毒表达表达免疫原性肽，并由此引发免疫应答。可用于免疫接种 方案的牛痘载体和方法记载于例如美国专利No. 4，722，848。另一种载体是卡介苗(BCG，Bacille Calmette Guerin)。BCG 载体记载于 Stover et al. , Nature 1991,351:456-60。有很多种可用于治疗性施用或免疫接种的其它载体是容易想到的，例如腺病毒和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、去毒炭疽毒素载体、诸如此类。参见例如 Shata et al. , Mol Med Today 2000，6:66-71; Shedlocket al. , J LeukocBiol 2000,68:793-806;Hipp et al. , In Vivo 2000,14:571-85。将多核苷酸投递入受试者可以是直接的，其中使受试者直接暴露于携带多核苷酸的载体，或者是间接的，其中首先在体外用感兴趣的多核苷酸转化细胞，然后将细胞移植入受试者。这两种办法分别称作体内和离体基因疗法。关于基因疗法的方法的一般综述参见Goldspiel et al.，ClinicalPharmacy1993, 12:488-505;Wu and ffu, Biotherapy 1991,3:87-95;Tolstoshev, Ann RevPharmacol Toxicol 1993，33:573-96;Mulligan, Science 1993,260:926-32;Morgan& Anderson,Ann Rev Biochem 1993，62:191-217;Trends in Biotechnology1993，11 (5):155-215。 在 eds. Ausubel et al., Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, NY,1993;及 Krieger, Gene Transfer and Expression, ALaboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990中描述的重组DNA技术领域的公知方法也可用于本发明。施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，而且可使用系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。合适的担载体或经编码本发明肽的多核苷酸转化的细胞中的多核苷酸的剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当加以调整,通常是0. OOlmg至lOOOmg，例如0. OOlmg至IOOOmg,例如0. Img至IOmg,而且可以每数天施用一次至每数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法本发明的肽和编码此类肽的多核苷酸可用于诱导APC和CTL。本发明的外来体和APC也可用于诱导CTL。以及用于诱导针对癌症或肿瘤的免疫应答。肽、多核苷酸、外来体和APC可以与任何其它化合物组合使用，只要该化合物不抑制它们的CTL诱导能力。因此，任何前文所述的本发明的药剂或药物组合物均可用于诱导CTL，而且除它们之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于诱导APC，如下文讨论的。(I)诱导抗原呈递细胞(APC)的方法本发明提供了使用本发明的肽或多核苷酸来诱导具有高的CTL诱导能力的APC的方法。本发明的方法包括在体外、离体或体内使APC与本发明的肽接触的步骤。例如，离体将APC与肽接触的方法包括下述步骤a :从受试者收集APC ;和b 使步骤a的APC与肽接触。
APC不限于特定种类的细胞，而且包括DC、Langerhans细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞，已知它们在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原，从而被淋巴细胞识另IJ。优选地，由于DC是APC中具有最强CTL诱导能力的，可使用DC。任何本发明肽可以以它们自身或与其它肽一起使用。或者，可以将本发明的肽施用给受试者以使肽在体内接触APC。结果，可以在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APC。因此，本发明也考虑将本发明的肽施用于受试者以在体内诱导APC的方法。还可以将处于可表达形式的编码本发明的肽的多核苷酸施用于受试者，使得本发明的肽在体内表达并与APC接触，从而在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APC。因此，本发明还考虑将本发明的多核苷酸施用于受试者以在体内诱导APC的方法。短语“可表达的形式”描述于上文“IX.药剂或药物组合物(2)含有多核苷酸作为活性成分的药剂”部分。此外，本发明包括将本发明的多核苷酸导入APC以诱导具有CTL诱导能力的APC。例如，该方法可包括下述步骤a 自受试者收集APC ；并b :导入编码本发明肽的多核苷酸。步骤b可如上文“VI.抗原呈递细胞”部分中所述来实施。(2)诱导CTL的方法本发明还提供了使用本发明的肽、多核苷酸、或外来体或APC来诱导CTL的方法。本发明还提供了使用编码能形成T细胞受体(TCR)亚单位的多肽的多核苷酸来诱导CTL的方法，所述TCR亚单位识别本发明的肽与HLA抗原的复合物。优选地，所述诱导CTL的方法包括选自下组的至少一个步骤(a)使⑶8-阳性T细胞与抗原呈递细胞和/或外来体接触，所述抗原呈递细胞和外来体在其表面上呈递HLA抗原与本发明的肽之间形成的复合物；和(b)向⑶8阳性T细胞中导入编码能够形成TCR亚单位的多肽的多核苷酸，所述TCR亚单位可识别HLA抗原与本发明的肽之间形成的复合物。当本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体被施用给受试者后，受试者的身体中诱导出CTL，而且靶向癌细胞的免疫应答的强度增强。因此，本发明还设想这样的方法，其包括将本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体施用于受试者以诱导APC的步骤。或者，也可通过离体使用它们来诱导CTL。在此场合，在诱导CTL后，将活化的CTL返还受试者。例如，本发明的诱导CTL的方法可包括下述步骤a:自受试者收集APC;b :用肽接触步骤a)的APC ;并c :将步骤b的APC与CD8-阳性细胞共培养。上文步骤c中要与⑶8-阳性细胞共培养的APC也可通过将包括本发明多核苷酸的基因转移入APC来制备，如上文“VI.抗原呈递细胞”部分所述，但是本发明不限于此，而且涵盖任何在其表面上有效呈递HLA抗原和本发明肽形成的复合物的APC。作为此类APC的替代，也可使用在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽形成的复合物的外来体。即，本发明还设想这样的方法，其中将在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽形成的复合物的外来体与CD8-阳性细胞共培养。此类外来体可通过上文“V.外来体”部分中描述的方法来制备。 另外，可通过将包括编码能与本发明的肽结合的TCR亚单位的多核苷酸的基因导A⑶8-阳性细胞来诱导CTL。此类转导可如上文“VIII. T细胞受体(TCR) ”部分中所述来实施。另外，本发明提供了一种制造用于诱导CTL的药剂或药物组合物的方法或工艺，其中该方法包括混合或配制本发明的肽与药学可接受的担载体的步骤。(3)诱导免疫应答的方法此外，本发明提供了诱导针对涉及MYBL2的疾病的免疫应答的方法。合适的疾病包括癌症，其例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌。本发明的方法包括施用含有任何本发明肽或编码它们的多核苷酸的作用剂或组合物的步骤。本发明的方法还涵盖施用呈递任何本发明肽的外来体或APC。关于详情参见“IX.药剂或药物组合物”项，特别是描述本发明的药剂或药物组合物作为疫苗的用途的部分。另夕卜，可用于本发明诱导免疫应答的方法的外来体和APC详细描述于上文“V.外来体”、“VI.抗原呈递细胞(APC) ”、和“X.使用肽、外来体、APC和CTL”等项目下。 本发明还提供在受试者体内诱导针对癌症，例如睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌的免疫应答的方法。为此目的，本发明涵盖制造用于诱导免疫应答的药剂、药用物质或药物组合物的方法，其中该方法可包括混合或配制本发明的肽或多核苷酸与药学上可接受的担载体的步骤。或者，本发明的诱导免疫应答的方法可包括配制和施用疫苗的步骤，这样的疫苗包含(a) 一种或多种本发明的表位肽，或其免疫学活性片段；(b) 一种或多种编码(a)的表位肽或其免疫学活性片段的多核苷酸；(c) 一种或多种本发明的分离的CTL ;或(d) 一种或多种本发明的分离的抗原呈递细胞。在本发明的语境中，过表达MYBL2的癌症可用这些活性成分来治疗。所述癌症的例子包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌。因而，在施用包括活性成分的疫苗或药物作用剂或组合物之前，优选确认要治疗的细胞或组织中的MYBL2表达水平与同一器官的正常细胞相比是否增强了。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于在有需要的患者中治疗(过)表达MYBL2的癌症的方法，该方法可包括下述步骤
i)测定自具有要治疗的癌症的受试者获得的细胞或组织中的MYBL2表达水平；ii)将MYBL2表达水平与正常对照比较；并iii)对具有与正常对照相比过表达MYBL2的癌症的受试者施用至少一种选自上文所述(a)至⑷的成分。或者，本发明还提供包括至少一种选自上文所述(a)至(d)的成分的疫苗或药剂或药物组合物，其用于对具有过表达MYBL2的癌症的受试者施用。换言之，本发明进一步提供了用于鉴定要用本发明MYBL2多肽来治疗的受试者的方法，所述方法包括测定源自受试者的癌细胞或组织中的MYBL2表达水平的步骤，其中该水平与该基因的正常对照水平相比的升高指示该受试者具有可用本发明MYBL2多肽来治疗的癌症。本发明的治疗癌症的方法将在下面更加详细的加以叙述。需用本方法治疗的受试者优选为哺乳动物。例示性的哺乳动物包括但不仅限于例 如人类、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马、和牛。根据本发明，测定在自受试者获得的癌细胞或组织中MYBL2的表达水平。表达水平可在转录(核酸)产物水平确定，使用本领域已知方法。举例而言,MYBL2的mRNA可通过杂交方法(例如，Northern杂交)使用探针定量。检测可在芯片或阵列上实施。对检测MYBL2的表达水平而言，优选使用阵列。本领域技术人员可利用MYBL2的序列信息制备上述探针。举例而言，MYBL2的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物来标记，例如染料、荧光物质和同位素，且所述基因的表达水平可以作为所杂交的标记物的强度检测。任何源自受试者的细胞或组织均可用于测定MYBL2表达水平，只要其包括目标的MYBL2转录或翻译产物。合适样品的例子包括但不仅限于身体组织与体液，例如血液、痰与尿液。优选地，源自受试者的细胞或组织样品含有这样的细胞群体，该群体包括上皮细胞，更优选癌性上皮细胞或源自怀疑为癌性的组织的上皮细胞。进一步，如果必要，可从所得的身体组织与体液中纯化所述细胞，然后将其用为源自受试者的样品。MYBL2的转录产物还可通过基于扩增的检测方法(例如，RT-PCR)使用引物定量。此类引物可基于所述基因的可得序列信息制备。具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件或低严格条件下与MYBL2的mRNA杂交。如本文中所使用的，短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，而且在不同的环境下会不同。较长序列的特异杂交与较短序列相比在较高温度下观察至IJ。一般地，严格条件的温度选择比特定序列在限定的离子强度和PH下的热熔点(Tm)低大约5° C。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡状态下有50%的与其靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm，平衡时50%的探针被占据。典型地，严格条件会是这样的其中盐浓度小于大约I. OM钠离子，典型地大约0.01-1. OM钠离子(或其它盐)，pH7. 0-8. 3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约30° C，用于较长的探针或引物是至少大约60° C。严格条件也可以通过添加去稳定物质，例如甲酰胺，来实现。探针或引物可具有特定的大小。大小的范围可为至少10个核苷酸，至少12个核苷酸，至少15个核苷酸，至少20个核苷酸，至少25个核苷酸，至少30个核苷酸，且探针和引物的大小范围可为5-10个核苷酸，10-15个核苷酸，15-20个核苷酸，20-25个核苷酸，和25-30个核苷酸。或者，可以检测翻译产物以进行本发明的诊断。例如，可以确定MYBL2蛋白(SEQID NO:6)的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法，此类方法使用特异识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于检测，只要该片段或经修饰抗体保留对MYBL2蛋白的结合能力即可。制备这些类型的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。作为另一种基于MYBL2的翻译产物检测其基因的表达水平的方法，可利用针对MYBL2蛋白的抗体通过免疫组织化学分析观察其染色的强度。意即，在这种测量中，强染色表明所述蛋白质存在/水平增加，且同时表明MYBL2基因的高表达水平。对于癌细胞中的靶基因(例如MYBL2基因)，如果其较之靶基因的对照水平(例如正常细胞中的水平)增加了例如10%，25%或50%的话，或增加到超过I. I倍，超过I. 5倍，超过2. 0倍，超过5. 0倍，超过10倍或者更多，则可以认为其在癌细胞中的表达水平增加了。 对照水平可以与癌细胞同时确定，使用先前从疾病状态(患癌或未患癌)已知的受试者收集和保存的样品。另外，自具有要治疗的癌症的器官的非癌性区获得的正常细胞可用作正常对照。或者，对照水平可以借助统计方法，根据通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的MYBL2基因表达水平获得的结果加以确定。进一步，对照水平可以是来自先前测试过的细胞的表达模式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中MYBL2基因的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。优选地使用从来自与源自受试者的样品的组织类型相似的组织类型的参考样品确定的对照水平。而且，优选地，使用具有已知的疾病状态的群体中MYBL2基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值+/-2S. D.或平均值+/-3S. D.的范围可以用作标准值。在本发明的语境下，从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，如果对照水平从癌性生物样品确定，则称作“癌对照水平”。样品表达水平与对照水平间的差异可以相对已知表达水平不会随着细胞的癌或非癌状态改变的对照核酸(例如管家基因)的表达水平加以标准化。示例的对照基因包括，但不仅限于，￠-肌动蛋白、甘油醛-3磷酸脱氢酶和核糖体蛋白Pl。当MYBL2基因的表达水平相比正常表达水平有所提高，或与癌性对照水平相似/等同，则受试者可诊断为具有要治疗的癌症。本发明还提供了一种(i)诊断受试者是否具有要治疗的癌症，和/或(ii)选择受试者进行癌症治疗的方法，该方法包括下述步骤a)测定MYBL2在自怀疑具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中的表达水平；b)将MYBL2的表达水平与正常对照水平比较；c)若MYBL2的表达水平与正常对照水平相比升高的话，将受试者诊断为具有要治疗的癌症；并d)若在步骤c)中受试者被诊断为具有要治疗的癌症的话，选择或鉴别受试者进行癌症治疗。
或者,此类方法包括下述步骤a)测定MYBL2在自怀疑具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中的表达水平；b)将MYBL2的表达水平与癌性对照水平比较；c)若MYBL2的表达水平与癌性对照水平相似或等同的话，将受试者诊断为具有要治疗的癌症；并d)若在步骤c)中受试者被诊断为具有要治疗的癌症的话，选择或鉴别受试者进行癌症治疗。本发明还提供了用于确定患有能用本发明的MYBL2多肽来治疗的癌症的受试者的试剂盒，其亦可用于评价和/或监测癌症免疫疗法的功效。优选地，癌症包括但不限于睾丸肿瘤、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌和食道癌。更特别地，所述试剂盒优 选包含至少一种在源自受试者的癌细胞中检测MYBL2基因表达的试剂，所述试剂可选自下组(a)用于检测MYBL2基因的mRNA的试剂；(b)用于检测MYBL2蛋白的试剂；和(c)用于检测MYBL2蛋白的生物学活性的试剂。适于检测MYBL2基因的mRA的试剂包括特异性结合或识别MYBL2mRNA的核酸，诸如具有与MYBL2mRNA的一部分互补的序列的寡核苷酸。这类寡核苷酸的例子有对MYBL2mRNA特异性的引物与探针。这类寡核苷酸可基于本领域众所周知的方法制备。如果需要，用于检测MYBL2mRNA的试剂可固定化在固体基质上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测MYBL2mRNA的试剂。另一方面，适于检测MYBL2蛋白的试剂包括针对MYBL2蛋白的抗体。所述抗体可为单克隆的或多克隆的。进一步，任何所述抗体的片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用作所述试剂，只要所述片段或经修饰抗体保留与MYBL2蛋白的结合能力。为检测蛋白制备此类抗体的方法在本领域是众所周知的，且可在本发明中使用任何方法制备上述抗体及其等价物。进一步，所述抗体可用能产生信号的分子通过直接连接或间接标记技术进行标记。标记物与标记抗体以及检测抗体与其靶的结合的方法在本领域是众所周知的，且本发明可使用任何标记物与方法。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种用于检测MYBL2蛋白的试剂。所述试剂盒可包含多于一种前述的试剂。举例而言，从没有癌症或患有癌症的受试者获取的组织样品可用作有用的对照试剂。本发明的试剂盒可进一步包括其它从商业或用户角度而言期望的材料，包括缓冲液、稀释液、滤器、针头、注射器和带有使用说明书(例如，书面的、磁带、⑶-ROM等等)的装箱单。这些试剂之类的可标上标签包含在容器中。合适的容器包括瓶、管状瓶(vials)和试管。所述容器可用多种材料制造，例如玻璃或塑料。在本发明的一个实施方案中，当所述试剂是针对MYBL2mRNA的探针时，所述试剂可固定化于固体基质例如多孔条上，以形成至少一个检测位置。所述多孔条的测量或检测区域可包含多个位置，每个都包含核酸(探针)。测试条亦可包含阴性和/或阳性对照的位置。或者，对照位置可位于与测试条不同的条上。任选地，不同的检测位置可包含不同量的固定化核酸，即，在第一个检测位置上量较大而在后面的位置上量较小。在加入测试样品之后，显示可检测信号位置的数目提供了在样品中存在的MYBL2mRNA量的定量指征。所述检测位置可设置成具有任何合适可检测的形状，通常是横跨测试条宽度的条状或点状。本发明所述试剂盒可进一步包括阳性对照样品或MYBL2标准样品。本发明的所述阳性对照样品可通过收集MYBL2阳性样品，随后测定其MYBL2水平来制备。此外，可将纯化的MYBL2蛋白或多核苷酸添加到不表达MYBL2的细胞中以形成所述阳性样品或MYBL2标准品。在本发明中，纯化的MYBL2可以是重组蛋白。例如，阳性对照样品的MYBL2水平大于截留值。在一个实施方案中，本发明进一步提供了一种诊断试剂盒，其包括能够特异性识别本发明抗体的蛋白或其部分蛋白或其免疫原性片段。本发明的蛋白的部分肽的例子包括由本发明蛋白的氨基酸序列中的至少8个、优选15个、和更优选20个连续氨基酸构成的多肽。癌症可通过使用本发明的蛋白或肽(多肽)检测样品(例如血液、组织)中的抗体来诊断。上文描述了用于制备本发明的肽或蛋白质的方法。 本发明用于诊断癌症的方法可通过如上所述测定抗MYBL2抗体量和相应对照样品中的量之间的差异来进行。若受试者的细胞或组织含有针对该基因的表达产物(MYBL2)的抗体和抗MYBL2抗体的数量测定为大于截留值(与正常对照中的水平相比)的话，则怀疑该受试者患有癌症。在另一个实施方案中，本发明的诊断试剂盒可包括本发明的肽及与它结合的HLA分子。使用抗原性肽和HLA分子检测抗原特异性CTL的合适方法早已确立(例如AltmanJD et al.，Science. 1996，274(5284) :94-6)。因此，本发明肽和HLA分子形成的复合物可用于检测方法来检测肿瘤抗原特异性CTL，由此能够较早检测癌症的复发和/或转移。进一步，它可用于选择适合包含本发明肽作为活性成分的药物的受试者或评估该药物的治疗效果。特别地,依照已知方法(参见例如Altman JD et al. , Science. 1996, 274(5284):94-6)，可制备放射性标记的HLA分子和本发明肽的寡聚物复合物，诸如四聚体。可使用该复合物来对源自怀疑患有癌症的受试者的外周血淋巴细胞中的抗原-肽特异性CTL定量。本发明进一步提供了使用如本文所述的肽表位来评估受试者的免疫应答的方法或诊断试剂。在本发明的一个实施方案中，使用本文所述的HLA限制肽作为试剂来评估或预测受试者的免疫应答。要评估的免疫应答是通过在体外或在体内使免疫原接触有免疫能力的细胞来诱导的。在优选的实施方案中，用于评估免疫应答的有免疫能力的细胞可以选自外周血、外周血淋巴细胞(PBL)、和外周血单个核细胞(PBMC)。用于收集或分离此类有免疫能力的细胞的方法是本领域公知的。在一些实施方案中，任何可导致识别和结合肽表位的抗原特异性CTL的生成的作用剂均可用作所述试剂。肽试剂无需用作免疫原。用于此类分析的测定系统包括相对较新的技术发展，诸如四聚体、胞内淋巴因子染色和干扰素释放测定法、或ELISP0T测定法。在一个优选的实施方案中，要与肽试剂接触的有免疫能力的细胞可以是抗原呈递细胞，包括树突细胞。例如，本发明的肽可用于四聚体染色测定法，评估外周血单个核细胞在暴露于肿瘤细胞抗原或免疫原后抗原特异性CTL的存在。HLA四聚体复合物可用于直接显现抗原特异性CTL(参见例如 Ogg et al. , Science 279:2103-2106，1998;和Altman et al, Science174:94-96, 1996)和测定抗原特异性CTL群体在外周血单个核细胞样品中的频率。四聚体多聚体试剂的试剂(例如使用本发明肽的四聚体)可如下所述来生成见下文。与HLA分子结合的肽在相应HLA重链和P 2_微球蛋白存在下重折叠以生成三分子复合物。在该复合物中，重链的羧基末端在先前工程化到蛋白质中的位点处被生物素化。然后，将链霉亲合素添加至复合物以形成由三分子复合物和链霉亲合素组成的四聚体。借助荧光标记的链霉亲合素，四聚体能用于对抗原特异性细胞染色。然后可鉴定细胞，例如通过流式细胞术。此类分析可用于诊断或预后目的。通过该规程鉴定的细胞也可用于治疗目的。本发明还提供了包括本发明肽的用于免疫回忆应答的试剂(参见例如 Bertoni et al,J.Clin.Invest.100:503-513,1997 和 Penna et al.,J Exp.Med. 174:1565-1570, 1991)。例如，可使用特定肽对来自具有要治疗的癌症的个体的患者PBMC样品分析抗原特异性CTL的存在。含有单个核细胞的血液样品可如下评估，即培养PBMC并用本发明的肽刺激该细胞。适宜培养时段后，可对扩增的细胞群体进行分析，例如分析CTL活性。 肽还可作为试剂用于评估疫苗的功效。可使用例如上文所述方法来分析自疫苗接种免疫原的患者获得的PBMC。测定患者的HLA型，并选择识别患者中存在的等位基因特异性分子的肽表位试剂进行分析。疫苗的免疫原性可通过PBMC样品中表位特异性CTL的存在来指示。本发明的肽还可用于制备抗体，使用本领域公知技术(参见例如CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY ；和 Antibodies A LaboratoryManual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),其可作为试剂用于诊断或监测癌症。此类抗体可包括识别HLA分子背景中的肽的抗体，即结合肽-MHC复合物的抗体。或者，本发明还提供了多种应用，本文中描述了其中一些。例如，本发明提供了一种用于诊断或检测以MYBL2免疫原性多肽表达为特征的病症的方法。这些方法涉及测定MYBL2HLA结合肽、或MYBL2HLA结合肽与I类HLA分子形成的复合物在生物学样品中的表达。肽或肽和I类HLA分子形成的复合物的表达可通过用针对肽或复合物的结合配偶测定来测定或检测。在一个优选的实施方案中，针对肽或复合物的结合配偶是识别和特异性结合肽的抗体。MYBL2在生物学样品诸如肿瘤活检中的表达也可使用MYBL2引物通过标准PCR扩增方案来测试。本文中呈现了肿瘤表达的一个例子，而且用于MYBL2扩增的例示性条件和引物的进一步公开内容可见于W02003/27322。优选地，诊断方法涉及使自受试者分离的生物学样品接触对MYBL2HLA结合肽特异性的作用剂以检测MYBL2HLA结合肽在生物学样品中的存在。如本文中使用的，“接触”意味着在适宜条件(例如浓度、温度、时间、离子强度)下放置生物学样品使其足够接近所述作用剂，以容许作用剂和生物学样品中存在的MYBL2HLA结合肽之间的特异性相互作用。一般地，作用剂接触生物学样品的条件是本领域普通技术人员知道的可促进生物学样品中分子与其关联物(例如蛋白质与其受体关联物、抗体与其蛋白质抗原关联物、核酸与其互补序列关联物)之间的特异性相互作用的条件。用于促进分子与其关联物之间的特异性相互作用的例示性条件记载于授权给Low等人的美国专利No. 5，108，921。本发明的诊断方法可以在体内和/或在体外实施。因而，生物学样品在本发明中可位于体内或体外。例如，生物学样品可以是体内组织，而且可使用对MYBL2免疫原性多肽特异性的作用剂来检测此类分子在组织中的存在。或者，可在体外收集或分离生物学样品(例如血液样品、肿瘤活检、组织提取物)。在一个特别优选的实施方案中，生物学样品可以是含有细胞的样品，更优选自要诊断或治疗的受试者收集的含有肿瘤细胞的样品。或者，诊断可使用容许通过对荧光素标记的HLA多聚体复合物染色而直接定量抗原特异性 T 细胞的方法来进行(例如 Altman, J. D. et al. , 1996, Science274:94; Altman, J.D.et al. , 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10330)。还提供了对胞内淋巴因子的染色和干扰素-Y释放测定法或ELISP0T测定法。四聚体多聚体染色、胞内淋巴因子染色和ELISP0T测定法都表现出比更常规的测定法灵敏至少10倍(Murali-Krishna，K. etal. , 1998, Immunity 8:177; Lalvani, A. et al. , 1997, J. Exp. Med. 186:859; Dunbar, P. R. etal. , 1998, Curr. Biol. 8:413) 也可使用五聚体(例如 US 2004-209295A)、Dextramers (例如 W002/072631)、和 Streptamers (例如 Nature medicine 6. 631-637 (2002))。 例如，在一些实施方案中，本发明提供一种用于诊断或评价被施用了至少一种本发明的MYBL2肽的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括下述步骤(a)在适合诱导对免疫原特异性的CTL的条件下使免疫原与具有免疫能力的细胞接触；(b)检测或测定步骤(a)中诱导的CTL的诱导水平；和(c)将所述受试者的免疫应答与所述CTL诱导水平相关联。在本发明中，免疫原是下述中至少一种(a)选自SEQ ID NO:2-4的氨基酸序列的MYBL2肽，具有所述氨基酸序列的肽，和具有所述氨基酸序列中已经过I个、2个或更多个氨基酸替换而修饰的氨基酸序列的肽。同时，适合诱导免疫原特异性CTL的条件是本领域公知的。例如，可以在体外在免疫原存在下培养具有免疫能力的细胞来诱导免疫原特异性CTL0为了诱导免疫原特异性CTL，可以将任何刺激因子添加至细胞培养物。例如，IL-2是用于CTL诱导的优选的刺激因子。在一些实施方案中，对要用肽癌症疗法治疗的受试者的免疫应答的监测或评价可以在治疗之前、之中和/或之后进行。一般而言，在癌症治疗规程中，反复地对要治疗的受试者施用免疫原性肽。例如，可以每周施用免疫原性肽3-10周。相应地，可以在整个癌症治疗程序中评价或监测受试者的免疫应答。或者，评价或监测免疫应答的步骤可以在治疗程序完成时进行。根据本发明，免疫原特异性CTL的诱导相对于对照增强，表明要评价或诊断的受试者对已施用的免疫原免疫应答。用于评价免疫应答的合适的对照可包括，例如，具有免疫能力的细胞未接触肽时的CTL诱导水平，或者与具有MYBL2肽之外的氨基酸序列(例如随机氨基酸序列)的对照肽接触时的CTL诱导水平。在一个优选的实施方案中，以序列特异性的方式评价受试者的免疫应答，方法是在施用给受试者的各种免疫原之间比较免疫应答。具体地，即使当数种MYBL2肽的混合物被施用给受试者时，免疫应答也会依赖于肽而改变。在这种情况下，通过比较每种肽的免疫应答，可以鉴定出受试者对其显示更高应答的肽。XI.抗体本发明进一步提供了与本发明的肽结合的抗体。优选的抗体特异性结合本发明的肽且不会结合(或会微弱结合)非本发明的肽。或者，抗体能结合本发明的肽及其同源物。针对本发明肽的抗体可用于癌症诊断和预后测定法、及成像方法学。类似地，此类抗体可用于其它癌症的治疗、针对、和/或预后，只要癌症患者中也表达或过表达MYBL2。此外，胞内表达的抗体(例如单链抗体)在治疗上可用于治疗涉及MYBL2表达的癌症，这样的癌症的例子包括但不限于乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、胃弥散型癌、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌。本发明还提供了多种免疫学测定法，用于检测和/或定量MYBL2蛋白(SEQ IDNO:6)或其片段，包括具有选自SEQ ID N0:2-4的氨基酸序列的多肽。此类测定法可根据需要包括一种或多种能够识别和结合MYBL2蛋白或其片段的抗MYBL2抗体。在本发明的语境中，能与MYBL2多肽结合的抗MYBL2抗体优选识别具有选自SEQ ID NO: 2-4的氨基酸序列的多肽。抗体的结合特异性可用抑制测试来确认。即，当要分析的抗体与全长MYBL2多肽之间的结合在任何具有选自SEQ ID NO:2-4的氨基酸序列的片段多肽存在下受到抑制时，证明此抗体特异性结合该片段。在本发明的语境中，此类免疫学测定法以本领域公知的各种免疫学测定形式实施，包括但不限于各种类型的放射免疫测定法、免疫层析技术、酶联免 疫吸附测定法(ELISA)、酶联免疫荧光测定法(ELIFA)、等等。本发明的相关免疫学的但非抗体的测定法也包括T细胞免疫原性测定法(抑制性的或刺激性的)以及主要组织相容性复合物(MHC)结合测定法。另外，本发明还提供能够检测表达MYBL2的癌症的免疫学成像方法，包括但不限于使用经标记的本发明抗体的放射闪烁成像方法。此类测定法在临床上可用于表达MYBL2的癌症的检测、监测、和预后，此类癌症的例子包括但不限于乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、胃弥散型癌、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌。本发明还提供了与本发明的肽结合的抗体。本发明的抗体可以以任何形式使用，例如单克隆或多克隆抗体，而且包括通过用本发明的肽免疫动物(诸如家兔)而获得的抗血清、所有种类的多克隆和单克隆抗体、及通过遗传重组生成的人抗体和人源化抗体。本发明的作为抗原用于获得抗体的肽可来源于任何动物物种，但优选来源于哺乳动物，诸如人、小鼠或大鼠，更优选来源于人。来源于人的肽可以由本文所公开的核苷酸或氨基酸序列获得。根据本发明，用作免疫抗原的肽可以是完整的蛋白质或蛋白质的部分肽。部分肽可以包含例如本发明肽的氨基(N)末端或羧基(C)末端片段。在本文中，抗体定义为能与MYBL2肽的全长或片段起反应的蛋白质。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体识别具有选自SEQ ID NO:2-4的氨基酸序列的MYBL2的片段肽。用于合成寡肽的方法是本领域公知的。合成后，可任选在作为免疫原使用之前纯化肽。在本发明的语境中，寡肽(例如9或10聚物)可与担载体缀合或连接以增强免疫原性。匙孔,嘁血蓝蛋白(KLH)作为载体是公知的。用于缀合KLH和肽的方法也是本领域公知的。或者，可以将编码本发明肽或其片段的基因插入已知的表达载体，然后用该载体转化本文所述宿主细胞。可以通过任何标准方法从宿主细胞外部或内部回收所需肽或其片段，然后可将其用作抗原。或者，表达肽的完整细胞或其溶胞物或者化学合成的肽也可用作抗原。可以用抗原免疫任何哺乳动物，但优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常，可使用卩齿齿目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或灵长目(Primate)的动物。啮齿科动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形科动物包括例如家兔。灵长科动物包括例如狭鼻猿(Catarrhini)(东半球猴(old world monkey))诸如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。腹膜内注射或皮下注射抗原是免疫哺乳动物的标准方法。更具体的说，可以在适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中稀释和悬浮抗原。如果需要，可将抗原悬浮液与适量的标准佐剂诸如弗氏(Freund)完全佐剂混合，制成乳状液，然后施用于哺乳动物。优选的是，其后每4-21天施用数次与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原。还可使用适宜的担载体进行免疫。如上所述进行免疫后，可通过标准方法检验血清中所需抗体的量的增加。可以如下制备针对本发明肽的多克隆抗体从经过免疫的哺乳动物(该哺乳动物经检验其血清中所需抗体增加)收集血液,并通过任何常规方法从血液中分离血清。多克隆抗体可包括含有多克隆抗体的血清,并且可以从所述血清中分离的、含有该多克隆抗体 的级分。可以使用例如偶联有本发明肽的亲和柱从仅识别本发明肽的级分中制备免疫球蛋白G或M，并进一步使用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分。为了制备单克隆抗体，从经过抗原免疫并如上所述检查出血清中所需抗体水平升高的哺乳动物收集免疫细胞，并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞可优选获自脾。其它要与上述免疫细胞融合的优选亲本细胞包括例如哺乳动物的骨髓瘤细胞，更优选具有为了用药物选择融合细胞而获得的特性的骨髓瘤细胞。可根据已知的方法，例如Milstein 等(Galfre 和 Milstein, MethodsEnzymo173:3-46 (1981))的方法，将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞进行融合。对于由细胞融合得到的杂交瘤，可在标准选择培养基诸如HAT培养基(含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)中培养以进行选择。通常，细胞培养在HAT培养基中连续进行数天至数周，培养的时间足以使除了所需杂交瘤之外的所有其它细胞(非融合的细胞)死亡。然后，可进行标准有限稀释(standard limiting dilution)来筛选和克隆生成所需抗体的杂交瘤细胞。除了上述用抗原免疫非人动物来制备杂交瘤的方法外，还可以在体外用肽、表达肽的细胞或其溶胞物免疫人淋巴细胞，诸如那些感染了 EB病毒的人淋巴细胞。然后，使经过免疫的淋巴细胞与能够无限分裂的源自人的骨髓瘤细胞诸如U266融合，以产生期望的生成能够与所述肽结合的人抗体的杂交瘤(已公开但未审查的日本专利申请No. Sho63-17688)。随后将所得杂交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得的单克隆抗体可通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联有本发明肽的亲和柱进行纯化。本发明的抗体不仅可用于纯化和检测本发明的肽，还可以用作本发明肽的激动剂和拮抗剂的候选物。或者，可以通过癌基因使生成抗体的免疫细胞(诸如经过免疫的淋巴细胞)永生化，并用于制备单克隆抗体。如此获得的单克隆抗体也可以使用遗传工程技术来重组制备(参见例如 Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies,由 MacMillanPublishers LTD在英国出版(1990))。例如，可以从生成抗体的免疫细胞诸如杂交瘤或经免疫淋巴细胞克隆编码抗体的DNA，将该DNA插入合适的载体，并导入宿主细胞以制备重组抗体。本发明还提供如上所述制备的重组抗体。此外，本发明的抗体可以是抗体片段或经过修饰的抗体，只要它结合一种或多种本发明的肽。例如，抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或将来自H链和L链的Fv片段通过合适的接头连接而成的单链Fv(scFv) (Huston et al. , Proc Natl Acad SciUSA 85:5879-83(1988))。更具体的说，可以通过用酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体来生成抗体片段。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体，并在合适的宿主细胞中表达(参见例如Co et al. , J Immunol 152:2968-76 (1994) ;Betterand Horwitz, Methods Enzymol 178:476-96(1989);Pluckthun and Skerra, MethodsEnzymol 178:497-515(1989);Lamoyi, Methods Enzymol 121:652-63(1986);Rousseauxet al. , Methods Enzymol 121:663-9 (1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol9:132-7(1991))。
抗体可以通过与多种分子诸如聚乙二醇(PEG)缀合来修饰。本发明提供了经过这样修饰的抗体。可通过化学修饰抗体来获得经过修饰的抗体。这些修饰方法是本领域常规的。或者，可以以源自非人抗体的可变区与源自人抗体的恒定区之间的嵌合抗体或者包含源自非人抗体的互补决定区(CDR)、源自人抗体的框架区(FR)及恒定区的人源化抗体的形式来获得本发明的抗体。此类抗体可依照已知技术来制备。人源化可通过用啮齿类的⑶R或⑶R序列替换人抗体的相应序列来进行(参见例如Verhoeyen et al. , Science239:1534-1536(1988))。因而，此类人源化抗体是嵌合抗体，其中人可变域的一小部分已被来自非人物种的相应序列所替换。也可以使用完全的人抗体，这样的抗体除了人框架区和恒定区外还包含人可变区。此类抗体可使用本领域已知的多种技术来制备。例如，体外方法包括使用展示在噬菌体上的人抗体片段的重组文库(例如Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991)) 类似的，可通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例如内源免疫球蛋白基因部分或完全灭活的小鼠，来生成人抗体。该方法记载于例如美国专利Nos. 6，150，584 ;5，545,807 ；5，545，806 ;5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016。可以将如上获得的抗体纯化至同质。例如，可依照用于一般蛋白质的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，可以通过适当选择和组合使用柱层析诸如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦来分出和分离抗体(Antibodies:A Laboratory Manual. Ed Harlow 和 David Lane, Cold Spring HarborLaboratory (1988)),但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。例示性的可使用的蛋白 A 柱包括例如 Hyper D、POROS 和 Sepharose F. F. (Pharmacia)。除亲和层析外的例示性层析包括例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析、等等(Strategies for Protein Purification 和 Characterization:ALaboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring HarborLaboratory Press (1996))。可以通过液相层析来进行层析规程,诸如HPLC和FPLC。例如，可使用吸光度测量、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)和/或免疫荧光来测量本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定化在板上，将本发明的肽施加到该板上，再施加含有所需抗体的样品，诸如生成抗体的细胞的培养物上清液或纯化的抗体。然后施加用酶(诸如碱性磷酸酶)标记的、识别第一抗体的第二抗体，并将板温育。接着，在洗涤后，向板中加入酶底物，诸如磷酸对硝基苯酯，并测量吸光度以评估样品的抗原结合活性。可以使用肽的片段，诸如C-末端或N-末端片段作为抗原来评估抗体的结合活性。可以使用BIAcore (Pharmacia)来评估本发明抗体的活性。上述方法允许通过将本发明的抗体暴露于假定含有本发明肽的样品，并检测或测量由抗体与肽形成的免疫复合物，来检测或测量本发明的肽。因为依照本发明的肽检测或测量方法可特异性的检测或测量肽，所以该方法可用于使用肽的各种实验。
XII.载体和宿丰细朐本发明还提供了导入有编码本发明肽的核苷酸的载体和宿主细胞。本发明的载体可用于在宿主细胞中维持本发明的核苷酸、尤其是DNA，用于表达本发明的肽，或者用于施用本发明的核苷酸以用于基因疗法。当宿主细胞为大肠杆菌且在大肠杆菌(例如JM109、DH5a、HBlOl或XLlBlue)中大量扩增和生成载体时，载体应具有能在大肠杆菌中扩增的“(复制)起点”和用于选择经过转化的大肠杆菌的标志基因(例如通过药物诸如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等进行选择的药物抗性基因)。例如，可以使用M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR_Script等。另外，与上述载体一样，pGEM_T、pDIRECT和pT7也可以用于亚克隆和提取cDNA。当使用载体来生成本发明的蛋白质时，表达载体是特别有用的。例如，要在大肠杆菌中表达的表达载体应具备上述在大肠杆菌中扩增的特征。当使用大肠杆菌诸如JM109、DH5a、HBlOl或XLlBlue作为宿主细胞时，载体应具有能在大肠杆菌中高效表达所需基因的启动子，例如IacZ启动子(Ward et al. , Nature341:544-6(1989);FASEB J 6:2422-7 (1992))、araB 启动子(Better et al. , Science240:1041-3(1988))、17 启动子等。在这方面，可以使用例如 pGEX_5X_l (Pharmacia)、“QIAexpress系统” (Qiagen)、pEGFP和pET(在这种情况中，宿主优选为表达T7RNA聚合酶的BL21)来替代上述载体。另外，载体还可以包含用于多肽分泌的信号序列。指导肽分泌至大肠杆菌周质的例示性信号序列有pelB信号序列(Lei et al.，J Bacteriol169:4379(1987))。用于将载体导入靶宿主细胞的手段包括例如氯化钙法和电穿孔法。除了大肠杆菌外，还可以使用例如源自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3 (Invitrogen)和 pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18 (17):5322 (1990))、pEF、PCDM8)、源自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、源自植物的表达载体(例如pMHl、pMH2)、源自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、源自逆转录病毒的表达载体(例如pZIpneo)、源自酵母的表达载体(例如“毕赤酵母表达试剂盒”(Invitrogen)、pNVll、SP-QOI)及源自枯草芽孢杆菌的表达载体(例如PPL608、pKTH50)来生成本发明的多肽。为了在动物细胞诸如CHO、COS或NIH3T3细胞中表达载体，载体应具有在所述细胞中进行表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan et al. , Nature277:108(1979))、MMLV-LTR 启动子、EFla 启动子(Mizushima et al. , Nucleic Acids Res18:5322 (1990))、CMV启动子、等等，及优选用于选择转化子的标志基因(例如通过药物(例如新霉素、G418)进行选择的药物抗性基因)。具有这些特征的已知载体的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV 和 pOP13。提供下面的实施例来例示本发明及帮助本领域普通技术人员来制备和使用本发明。实施例并非意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例材料和方法细朐系人B-淋巴母细胞样细胞系T2 (HLA-A2)和非洲绿猴肾细胞系C0S7购自ATCC。
源自MYBL2的肽的候选者选择使用“NetMHC3. O，，结合预测月艮务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) (Buus et al. (Tissue Antigens.，62:378-84，2003)，Nielsen et al. (Protein Sci.，12:1007-17, 2003, Bioinformatics, 20(9) :1388-97, 2004))预测了源自 MYBL2 的结合HLA_A*0201分子的9聚体和10聚体肽。这些肽由Biosynthesis (Lewisville, Texas)根据标准固相合成法合成，并通过反相高效液相色谱(HPLC)纯化。分别通过分析型HPLC和质谱分析来确定肽的纯度(>90%)和身份。将肽以20mg/ml溶解在二甲基亚砜(DMSO)中并保存于-80°C。体外CTL诱导使用单核细胞衍生的树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞(APC)来诱导针对呈现在人白细胞抗原(HLA)上的肽的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。如他处所述(NakaharaS et al. , Cancer Res 2003Jul 15，63 (14) :4112-8)体外制备 DC。具体地说，对于用Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液从正常志愿者(HLA_A*0201阳性)分离的外周血单个核细胞(PBMC)，通过粘附塑料组织培养盘(Becton Dickinson)加以分离，以将它们作为单核细胞级分加以富集。将富集了单核细胞的群体在含2%热灭活的自体血清(AS)的AM-V培养基(Invitrogen)中，在1000U/ml的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(R&D System)和1000U/ml白介素(IL)-4(R&D System)的存在下培养。培养7天后，将经细胞因子诱导的DC在AIM-V培养基中在3微克/ml ^ 2-微球蛋白存在下用20微克/ml每一种合成肽于37° C冲激3小时。所生成的细胞表观上在它们的细胞表面上表达DC相关分子，诸如⑶80、⑶83、⑶86和HLA II类(数据未显示)。然后将这些经肽冲激的DC用X辐照(20Gy)灭活，并以1:20比例与用⑶8阳性分离试剂盒(Dynal)通过正选择获得的自体⑶8+T细胞混合。在48孔板(Corning)中设立这些培养物；每个孔在0. 5ml AM_V/2%AS培养基中含有 I. 5xl04 个经肽冲激的 DC、3xl05 个 CD8+T 细胞和 10ng/ml IL-7 (R&D System)。3 天后，给这些培养物补充IL-2 (CHIRON)至终浓度20IU/ml。在第7天和第14天，将T细胞用经肽冲激的自体DC进一步刺激。每次通过与上文所述相同的方式来制备DC。在第21天在第三轮肽刺激后测试针对经肽冲激的T2细胞的CTL (Tanaka H et al. , Br J Cancer 2001 Jan5,84 (I):94-9;Umano Y et al. , Br J Cancer 200IApr 20，84 (8):1052-7;Uchida N etal., Clin Cancer Res 2004Dec 15,10(24):8577-86;Suda T et al. , Cancer Sci 2006May, 97 (5):411-9;Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005Aug, 96 (8):498-506)。CTL扩增规稈使用与Riddell 等人(Walter EA et al. , N Engl J Med 19950ct19, 333(16) :1038-44; Riddell SR et al.，Nat Med 1996Feb, 2 (2) : 216-23)记载的方法相似的方法在培养中扩增CTL。将总共5xl04个CTL在25ml AIM-V/5%AS培养基中悬浮，其中有在40ng/ml抗CD3单克隆抗体(Pharmingen)存在下经丝裂霉素C灭活的两种人B-淋巴母细胞样细胞系。启动培养后一天，向培养物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第11天给培养物补加新鲜的含有30IU/ml IL-2的AIM_V/5%AS培养基(TanakaH et al. , Br J Cancer 2001Jan 5,84 (I):94-9;Umano Y et al. , Br J Cancer 200IApr20,84(8):1052-7;Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004Dec 15,10(24):8577-86;SudaT et al. , Cancer Sci 2006May, 97(5) :411-9;Watanabe T et al. , Cancer Sci2005Aug, 96(8) :498-506)。
CTL克降的律立在96圆底微量滴定板(Nalge Nunc International)中进行稀释以获得0. 3、I和3个CTL/孔。在总体积为150微升/孔的含5%AS的AIM-V培养基中，将CTL与IxlO4个细胞/孔的两种人B-淋巴母细胞样细胞系、30ng/ml的抗CD3抗体，和125U/ml的IL-2 —起培养。10天后向培养基中加入50微升/孔的IL-2以达到终浓度125U/ml的IL-2。在第14天测试CTL活性，并使用如上所述的相同方法扩增CTL克隆(Uchida N etal. , Clin Cancer Res 2004Dec 15, 10(24):8577-86;Suda T et al. , Cancer Sci 2006May, 97(5):411-9;Watanabe T et al. , Cancer Sci2005Aug, 96(8):498-506)。特异件CTL活件为了检查特异性CTL活性，实施了干扰素(IFN)-Y酶联免疫斑点(ELISP0T)测定法和IFN-Y酶联免疫吸附测定法(ELISA)。具体而言，制备经肽冲激的T2 (IxlO4/孔)作为刺激细胞。使用48孔中培养的细胞作为应答细胞。依照制造商的规程实施IFN-Y ELISP0T测定法和IFN- y ELISA测定法。强迫表汰靶基因和/或HLA-A02的细胞的津立通过PCR来扩增编码靶基因可读框或HLA_A*0201的cDNA。将PCR扩增产物克隆入载体。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)依照制造商推荐的规程将质粒转染入C0S7(靶基因和HLA-A*0201阴性的细胞系)。自转染起2天后，用Versene (Invitrogen)收获经转染细胞，并用作CTL活性测定法的靶细胞(5X104个细胞/孔)。结果源自MYBL2的HLA-A02结合肽的预测表Ia和Ib以高结合亲和力的顺序显示了 MYBL2的HLA-A02结合性9聚体和10聚体肽。选择并检查了总共4种具有潜在HLA-A02结合能力的肽，以确定表位肽。表 Ia源自MYBL2的HLA-A02结合性9聚体肽
权利要求
1.一种分离的寡肽，其包含选自SEQ ID NO: 2-4的氨基酸序列，其中该寡肽结合HLA抗原并具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力。
2.一种分离的寡肽，其中该寡肽结合HLA抗原并具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力，其中该寡肽由选自SEQ ID NO: 2-4的氨基酸序列组成，其中插入、替换、缺失和/或添加了 I个、2个或数个氨基酸。
3.权利要求2的寡肽，其中所述寡肽具有下述特征之一或二者 (a)从N端起的第二个氨基酸选自亮氨酸和甲硫氨酸，和 (b)C端氨基酸选自缬氨酸和亮氨酸。
4.权利要求1-3的分离的寡肽，其中所述HLA抗原是HLA-A2。
5.权利要求1-4的分离的寡肽，其中所述寡肽是九肽或者十肽。
6.分离的多核苷酸，其编码权利要求1-5中任一项的寡肽。
7.一种用于诱导CTL的作用剂，其中所述作用剂包含一种或多种如权利要求1-5中任一项所述的寡肽，或者一种或多种权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种用于治疗和/或预防癌症和/或防止其手术后复发的药剂，其中所述药剂包含一种或多种如权利要求1-5中任一项所述的寡肽，或者一种或多种如权利要求6所述的多核苷酸。
9.权利要求8的药剂，其配制为供施用于其HLA抗原为HLA-A2的受试者。
10.权利要求8或9的药剂，其配制为用于治疗癌症。
11.诱导具有CTL诱导能力的抗原呈递细胞(APC)的方法，其中所述方法包括下述步骤之一 (a)在体外、离体或体内使APC与权利要求1-5中任一项的寡肽接触；或 (b)向APC中导入编码权利要求1-5中任一项的寡肽的多核苷酸。
12.通过任何包括至少一个下述步骤的方法来诱导CTL的方法 (a)将CD8-阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1-5中任一项的寡肽的复合物； (b)将CD8-阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1-5中任一项的寡肽的复合物；和 (c)向T细胞中导入包含编码结合权利要求1-5中任一项的寡肽的T细胞受体(TCR)亚单位多肽的多核苷酸的基因。
13.一种分离的抗原呈递细胞，该细胞在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1-5中任一项的寡肽的复合物。
14.权利要求13的APC，其是通过权利要求11的方法诱导的。
15.一种分离的CTL，其靶向权利要求1-5中任一项的肽。
16.权利要求15的CTL，其是通过权利要求12的方法诱导的。
17.一种诱导受试者中针对癌症的免疫应答的方法，包括下述步骤对受试者施用包含权利要求1-5中任一项所述的寡肽、其免疫学活性片段、或编码所述寡肽或免疫学活性片段的多核苷酸的作用剂。
全文摘要
本文描述了针对癌症的肽疫苗。具体地说，提供了源自MYBL2基因的结合HLA抗原并具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力的表位肽，更具体地说是具有SEQ ID NO:5的氨基酸的肽及其片段。本发明还延及在上述肽或片段中包含一个、两个或者数个氨基酸插入、替换或添加而得到的肽，条件是它们保留细胞毒性T细胞诱导能力。还提供了编码任意上述肽的核酸，靶向此类肽的抗原呈递细胞和分离的CTL，以及包含任意上述肽、核酸和APC作为活性成分的药剂或药物组合物。本发明的组分特别可以用于治疗和/或预防(及防范)癌症(肿瘤)，和/或防范其手术后复发的相关用途。
文档编号C12N15/09GK102753567SQ20108006357
公开日2012年10月24日 申请日期2010年12月2日 优先权日2009年12月4日
发明者中村佑辅, 吉村祥子, 大泽龙司, 渡边朝久, 角田卓也 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司