细菌杀昆虫蛋白的制作方法

专利名称：：细菌杀昆虫蛋白的制作方法细菌杀昆虫蛋白
背景技术：
：1.发明领域本发明涉及从细菌菌林，优选短芽孢杆菌(Brevibacillus)菌抹，最优选侧孢短小芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)菌抹分离的、新的杀昆虫分泌蛋白("ISP")及编码该蛋白的DNA，当所述蛋白与ISP-支助蛋白(ISP-complimentaryprotein),如本发明的另一种ISP蛋白组合被昆虫才l^v后即可杀昆虫。这些蛋白可用于防止或减少田地里昆虫，特别是玉米根虫对植物的损害。本发明还涉及植物，特别是玉米植物，所述植物通过在其细胞中表#发明的ISP蛋白而具有杀昆虫能力，优选杀鞘翅目昆虫特别是叶甲属(Diabrotica)、马铃薯叶甲属(Leptinotarsa)和花象属(Anthonomus)种的昆虫。本发明还涉及通过使下述的昆虫才IIX本发明的ISP蛋白，特别是具有SEQIDNo.2，4，8或10之任一项的^酸序列的蛋白，或其中具有杀昆虫活性的片段来控制由叶甲属(Diabrotica)、马铃薯叶甲属(Leptinotarsa)或花象属(Anthonomus)种昆虫，优选叶甲属(Diabrotica)种昆虫害虫，特别是玉米才艮虫引起的损失的方法。2.现有纟支术的描述已发现一些最具石皮坏性的害虫属于Diabroticinebeetles,在北美，人们i人为三种重要的玉米才艮虫，玉米才艮叶曱(Diabroticavirgifera)(西部玉米根虫)、Diabroticabarberi(北部玉米根虫)和黄瓜十一星叶曱食根亚种(Diabroticaundecimpunctatahowardi)(南部玉米根虫)是需要花费最昂贵资金来控制的病虫害。(Metcalf，1986，Foreword，"MethodsfortheStudyofPestDiabrotica"，pp.vii-xv，编者Krysan，J丄.和Miller,T.A.，Springer國Verlag，纽约)。玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)和Diabroticabarberi被i人为是美国和加拿大主要生产玉米的州中最为严重的玉米病虫害(Levine和Oloumi-Sadeghi，1991，Annu.Rev.Entomol.36，229-55)。其幼虫以玉米根为食，从而对玉米的生长和收获造成直接的损害。控制幼虫损害玉米根系的土壤杀昆虫剂和减少曱虫损害玉米穗的空气喷雾剂的费用，加上玉米的亏损每年有将近十亿美圆(Metcalf，1986，参见上文)。最近，在美国的一些州发现在种植玉米后种植大豆的轮作方式失去了作用，这是由于玉米根虫已经适应了这种情况。对玉米根虫具有毒性的细菌菌林和/或基因在美国专利6,023,013;6，015，553;6，001，637;5，卯6，818和5，645，831中已有描述。另夕卜，PCT出版物、VO00/09697，WO99/57282，WO98/18932,WO97/40162，和WO00/26378也涉及到可从芽孢杆菌(Bacillus)或其它细菌种获得的毒素和基因，其中的一些被ial^对玉米根虫具有毒性。WO98/44137，WO94/21795和WO96/10083涉及以在营养生长过程中产生的杀昆虫蛋白和辅助蛋白为特征的杀昆虫芽孢杆菌(Bacillus)菌林，并描述了其中的一些对玉米根虫具有毒性。美国专利5,055,293描述了一种通过向土it裏中接种形成伴胞晶体的侧孢芽孢杆菌(Bacilluslaterosporus)来控制玉米才艮虫的方法。Orlova等(1998，AppliedEnvironmentalMicrobiol.64，2723)报道了在有晶体形成的侧孢芽孢杆菌(Bacilluslaterosporus)中与蛋白晶体相关的杀蚊虫活性。发明目的M明简述本发明的目的在于提供对昆虫，优选叶曱属(Diabrotica)种昆虫,特别是玉米根虫具有显著毒性的新的蛋白和编码该蛋白的DNA序列。在本发明的一个实施方案中，提供了包含SEQIDNo.2中最小活性毒素蛋白的M酸序列的蛋白，其中所述最小活性毒素a)是SEQIDNo.2所示蛋白的片段，且b)当与SEQIDNo.4中51到457位^J^,列所示的蛋白组合被玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)幼虫才l^^能够将所述幼虫杀死。还提供了包含SEQIDNo.4中最小活性毒素蛋白的絲,列的蛋白，其中所述的最小活性毒素a)是SEQIDNo.4所示蛋白的片段，且b)当与SEQIDNo,2中38到871位M,列所示的蛋白组合被玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)幼虫損Uv后能够将所述幼虫杀死。特别优选的是以包含SEQIDNo.2中38到768或781位的^J^,列为特征的蛋白，优选以SEQIDNo.2或SEQIDNo.lO的^J^酸序列为特征的蛋白；和以含有SEQIDNo.4从第51位M酸到第449或457位綠酸的序列为特征的蛋白，优选以SEQIDNo.4或SEQIDNo.8的^J^崎列为特征的蛋白。本发明的另一个目的是提供一种蛋白质，其包含isplADNA所编码蛋白的蛋白酶消化片段的氨基酸序列，所述的isplADNA保藏于BCCM-LMBP，保藏号为LMBP4009，其中所述蛋白酶消化片段当与SEQID.No.4中第51位到第457位M酸组成的蛋白组合施用时对玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)具有杀昆虫作用;以及一种包含isp2ADNA所编码蛋白的蛋白酶消化片段的M^列的蛋白，所述的isp2ADNA保藏于BCCM-LMBP,保藏号为LMBP4009,所述蛋白酶消化片段当与SEQID.No.2中第38位到第871位M酸组成的蛋白组合施用时对玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)具有杀昆虫作用;具体地说，其中所述的蛋白酶消化片段可经鞘翅目昆虫消化液处理得到。本发明还提供编码上述蛋白的DNA序列，特别是含有与天然存在的DNA序列相比所使用的密码子不同但编码的蛋白序列相同的人工DNA序列的DNA，该DNA优选包含在嵌合基因中可操作地与能在植物中表达的启动子区域(即适合用于植物细胞中的表达的启动子区域，其可来源于细菌，病8毒或植物也可以是人工制备的)，尤其是优先在根组织中具有活性的启动子区域相连接。在本发明的一个实施方案中，所述嵌合基因中的启动子包含SEQIDNo.5或6的DNA序列或者可在严紧M下与其杂交的DNA。在本发明另一实施方案中，所述的嵌合基因还包含用于从细胞中向外分泌或靶向细胞器的信号肽，特别是叶绿体转运肽。本发明还提供如下植物细胞、植物或种子，特别是玉米细胞、植物或种子，它们包含整合到其细胞中的上述任一嵌合基因，特别是编码ISP1A或其具有杀昆虫活性的片段的嵌合基因与编码ISP2A或其具有杀昆虫活性的片段的嵌合基因的组合。在本发明的另一个实施方案中，提供了经转化而含有上述任意一种DNA序列的摆t生物。本发明还提^^控制昆虫的方法，特別是使植物抗鞘翅目昆虫的方法，该方法包括在植物细胞中表达任意一种本发明的ISP蛋白，再从所述的抗昆虫性细胞再生出转化植物。在这一方法中所述的昆虫优选选自根虫，象甲，马铃薯甲虫，叶甲属(Diabrotica)种，花象属(Antho翻us)种，马铃薯叶甲属(Leptinotarsa)种，杨树莹叶甲(Agelasticaalni)，紫油苜蓿叶象(Hyperapostica)，埃及苜蓿叶象(Hyperabmimeipetmis)，Halticatombacina,墨西哥棉铃象(Anthonomusgrandis)，黄粉虫(Tenebriomolitor)，赤才以谷盗(Triboleumcastaneum)，7JC稻4失甲(Dicladispa水稻负泥虫(Oulemaoryzae)，葡萄肖叶甲(Colaspisbrunnea)，稻7JC象甲(LissorhorDtrusoryzophilus)，萝卜菜跳甲(Phyllotretacruciferae)，黄曲条菜跳曱(Phyllotretastriolata)，忽布跳甲(Psylliodespunctulata)，美洲油菜叶甲(Entomoscdisamericana)，油菜露尾曱(Mdigcthcs狄ncus),龟象属(Ceutorynchus)种，油菜金头跳甲(Psylliodeschrysocephala)，豌豆细腳匕曱(Phyllotretaundulata)，马铃薯叶曱(Leptinotarsadecemli腦ta)，黄瓜十一星叶曱亚种(Diabroticaundecimpunctataundedmpunctata,)黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabroticaundecimpunctatahowardi)，Diabroticabarberi，和玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)。本发明的另一个目的是提供使植物抗鞘翅目昆虫的方法以及控制鞘翅目昆虫的方法，所述的方法包括4吏用编码本发明的ISP蛋白的DNA序列转化植物，特别是玉米，然后大田种植、播种或栽培所述植物。在本发明的一个实施方案中，所述的ISP蛋白与其它杀昆虫蛋白或蛋白组合，优选对玉米根虫具有毒性的蛋白相联合。本发明还提供ISP1A或ISP2A的等价物，其优选来自侧孢短小芽M菌(Brevibacilluslaterosporus)菌林，特别是来自不形成晶状包含体的侧孢短小芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)菌林。利用适当的分子量标记在标准的8-10%SDS-PAGE^^电泳中确定，这类等价物的分子量优选地为ISP1A等价物约95到约100kD,ISP2A等价物约45到约50kD。本发明优选实施方案的详细描述依照本发明，我们分离并表征了新的细菌毒素和编码它们的DNA序列。所述的新蛋白命名为ISP1A和ISP2A，编码它们的DNA序列分别为isplA和isp2A。依照本发明，"ISP1A蛋白"是指包含当与适宜的ISP-支助蛋白，特别是ISP2A成熟蛋白组合被昆虫摄入后仍保持杀昆虫活性的SEQIDNo.2氨基,列中的最小蛋白片段的任何蛋白，所述杀昆虫活性特别是对鞘翅目昆虫，更特别是对玉米根虫、棉铃象甲和马铃薯甲虫，优选对叶甲属(Diabrotica)种，尤其是对南部、西部和北部玉米根虫，特别是对玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)的杀昆虫活性。这包括任何具有下述^^*列的蛋白，所述的氨基酸序列包含SEQIDNo.2中从第32或38位优选第38位氮基酸到第768位至871位氨基酸中的一个位置的M酸序列；特别是任何具有下述M酸序列的蛋白，所述的M酸序列包含至少SEQIDNo.2中从第38到第768位氨基酸的序列。这也包括通过从SEQIDNo.2的氨基酸序列中切除部分或全部N-末端信号肽序列所获得的蛋白，或者其中的信号肽被另一(如植物的)引导肽、甲硫氨酸或甲硫氨酸-丙氨酸二肽替换的蛋白。具体地，这包括含有原核或真核(如细菌或植物)的N-末端分泌或靶向信号肽的蛋白。这还包括含有上述最小毒性蛋白片段的杂合或嵌合蛋白，如本发明的ISP2A蛋白和ISP1A蛋白之间的杂合体。而且，用昆虫消化液处理后获得的保持了杀昆虫活性的ISP1A蛋白的蛋白酶抗性片段也包含在此处所用到的名称"ISP1A"中，所述的昆虫消化液优选是鞘翅目昆虫消化液，特别是鞘翅目昆虫肠道蛋白酶，优选玉米根虫蛋白酶，如半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。具体说来，所述的鞘翅目昆虫选自玉米根虫，棉铃象甲和马铃薯曱虫，叶甲属(Diabrotica)种，玉米才艮叶甲(Diabroticavirgifera)，Diabroticabarberi，黄瓜十一星叶甲(Diabroticaundeeimpuncata)，马铃著叶甲(Leptinotarsadecemlineata)和墨西哥棉铃象(Anthonomusgrandis)。在本发明的优选实施方案中，在不同时或相继提供ISP支助蛋白，如ISP2A蛋白的情况下，根据本发明的ISP1A蛋白被单独才l^v时没有杀昆虫活性。依照本发明，"ISP2A蛋白"是指包含当与适宜的ISP-支助蛋白，特氨基^列中的最小蛋白片段的任何蛋白，所述杀昆虫活性特别是对鞘翅目昆虫，更特别是对玉米根虫、棉铃象曱和马铃薯曱虫，优选对叶曱属(Di3brotk3)种，尤其是对玉米才艮叶甲(Diabroticavirgifera)，Diabroticabarberi，黄瓜十一星叶甲(Diabroticaundecimpuncata)的杀昆虫活性。这包括任何具有下述M酸序列的蛋白，所述的M酸序列包含SEQIDNo.4中从第43或51位优选第51位氨基酸到第449位至457位氨基酸中的一个位置的M酸序列；特别是任何具有下述氨基酸序列的蛋白，所述的氨基酸序列包含至少SEQIDNo.4中从第51到第449位氩基酸的序列。这也包括从SEQIDNo.4的氨基酸序列中切除该蛋白的部分或全部N-末端信号肽序列所获得的蛋白，以及其中的信号肽被另一(如植物的)引导肽、甲硫氨酸或曱硫氨酸-丙氨酸二肽替换的蛋白。具体地，这包括含有原核或真核(如细菌或植物)的N-末端分泌或耙向信号肽的蛋白。这还包括含有上述最小毒性蛋白片段的杂合或嵌合蛋白，如本发明的ISP2A蛋白和ISP1A蛋白之间的杂合体。而且，用昆虫消化液处理后获得的保持了杀昆虫活性的ISP2A蛋白中的蛋白酶抗性片段也包含在此处所用到的名称"ISP2A"中，所述的昆虫消化液优选是鞘翅目昆虫消化液，特别是鞘翅目昆虫肠道蛋白酶，如半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。在本发明的优选实施方案中，在不同时或相继提供ISP支助蛋白，如ISP1A蛋白的情况下，根据本发明的ISP2A蛋白被单独摄入时没有杀昆虫活性。此处所用的"ISP-支助蛋白"是指当与一种本发明的ISP蛋白组合,皮昆虫特别是鞘翅目昆虫損k后具有杀昆虫活性的蛋白，其包括但不限于成熟的ISP1A或ISP2A蛋白，所述的昆虫优选是玉米根虫、棉铃象甲或马铃薯甲虫，尤其是玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)，Diabroticabarberi，黄瓜十一星叶甲(Diabroticaimdecimp獄ata)或墨西哥棉铃象(Anthonomusgrandis)。具体地，WO98/44137，WO94/21795和WO96/10083中所述的V1P蛋白及其活性片段，尤其是切除了信号序列的成熟VIP蛋白也是本发明的ISP-支助蛋白。ISP1A蛋白的理想ISP-支助蛋白是ISP2A蛋白或者美国专利5，990，383中所描述的VIP2Aa或VIP2Ab蛋白或其活性片段(例如去除了信号序列的成熟蛋白)，或与ISP2或VIP2蛋白之任一种具有至少50%、优选至少75。/。、特别是至少85%序列同一性且与成熟的ISP1A蛋白组合被昆虫，优选鞘翅目昆虫，特别是玉米根虫摄入后具有杀昆虫活性的任何细菌分泌蛋白。ISP2A蛋白的理想ISP-支助蛋白是成熟的ISP1A蛋白或如美国专利5，9卯，383中所描述的VIPlAa或VIPlAb蛋白或其活性片段(例如去除了信号序列的成熟蛋白)，或与ISP1或VIP1蛋白之任一种具有至少50%、优选至少75%、特别是至少85%序列同一性且与成熟的ISP2A蛋白组合被昆虫，优选鞘翅目昆虫，特别是玉米根虫才聂入后具有杀昆虫活性的任何细菌分泌蛋白。为避免混淆，ISP-支助蛋白和ISP蛋白总是指不同的蛋白。12在本发明的一个优选实施方案中，当在标准昆虫食物上进行表面污染试验时，本发明的ISP蛋白或其等价物以如下浓度单独使用时(即不存在任何ISP支助蛋白)优选对玉米根虫幼虫特别是玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)不表现明显的杀昆虫活性，所述浓度为这些蛋白的组合(每一种蛋白均以此浓度应用)可以导致玉米根虫幼虫，尤其是玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)100%死亡率的浓度。具体地i兑，在使用标准的玉米根虫食物的表面污染试验中以70ng/cn^的浓度单独应用ISP1蛋白时，本发明的ISP1蛋白并不引起玉米根叶曱(Diabroticavirgifera)幼虫的明显死亡(即，与仅使用緩冲液的对照没有区别)，在使用标准的玉米根虫食物的表面污染试验中以36ng/cm2的浓度单独应用ISP2蛋白时，本发明的ISP2蛋白并不引起玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)幼虫的明显死亡(即，与仅使用緩冲液的对照没有明显的区别)，而在这些浓度下将ISPl和ISP2—起使用在同种类型的试验中可以使这些幼虫的死亡率达到100%。此处所用到的"ISP1A等价物"或"ISP2A等价物"是指这样的蛋白，当将其与ISP-支助蛋白二元组合应用于耙昆虫时，优选被这样的昆虫^聂取时其对靶昆虫的毒性分别与ISP1A或ISP2A蛋白对耙昆虫的毒性相同或基本相同，而且其分别与ISP1A或ISP2A蛋白具有基本相同的氨基,列。按标准8-10%SDS-PAGE^!^电泳确定的分子量分别为约45到约50kD和约95到约100kD且在组合而非单独使用时对玉米根虫幼虫有明显的杀昆虫活性的细菌蛋白，优选来自侧孢短小芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)，特别是不产生晶状包含体的侧孢短'J、芽孢杆菌(Brevibacilluslat园porus)的该细菌蛋白也包含在ISP1A或ISP2A等价物的定义内。在提及对靶昆虫施用ISP蛋白(或其等价物)和ISP-支助蛋白以取得杀昆虫效果时，所使用的术语"组合"包括同时施用(即，在相同的铜料，细胞或組织中同时施用于昆虫或由昆虫摄入)和分开地相继施用(即，施用一个之后再施用另外一个，但不是同时施用或摄入)本发明的ISP蛋白(或其等价物)和ISP-支助蛋白，只要能如期在昆虫的消化道中同时发现这些蛋白即可。因此，本发明的ISP1A蛋白可以在植物根部的某种细胞类型或某个区域表达，而本发明的ISP2A蛋白可以在同一植物根部的另一种细胞类型或另一区域表达，以致只有当根物质被摄入后上述蛋白才能相互作用。ISP蛋白或其等价物在植物，特别是玉米根部的表达及ISP-支助蛋白在与才M目关的细菌如根瘤菌(rhizobacteria)菌林中的表达(或反过来)也包括于此。此处所用到的有关ISP蛋白和ISP等价物蛋白"对靶昆虫的相同毒性，，是指，在适宜的ISP支助蛋白存在时1SP蛋白引起的平均死亡率与在同样的适宜1SP支助蛋白存在时ISP等价物引起的平均死亡率没有明显的差异。具体说来，这是指ISP蛋白的LC50的95%置信界限(在适宜的ISP支助蛋白存在下进行试验时)与ISP等价物的LC50的95%置信界限(在适宜的ISP支助蛋白存在下进行试验时)相重叠的情况。此处所用到的有关1SP蛋白和1SP等价物蛋白"对靶昆虫的基本相同的毒性"是指优选当这些蛋白在植物中表达时，由ISP和ISP等价物蛋白引起的乾昆虫的平均死亡率水平有明显的差异，但这些死亡率仍处于可用于控制或杀死相关靶昆虫的杀昆虫活性范围内。在本发明的优选实施方案中，当在相同的实验条件下相同的(重复的)体外实验中这些蛋白对靶昆虫的LC50值相差2到100,优选2到50,特别是2到20，最优选2到10倍时，所述蛋白对乾昆虫具有基本相同的毒性。同样，可以用功能类似的氨基酸替换ISP1A或ISP2A蛋白中的某些氨基酸以获得ISP1A或ISP2A等价物。例如，所述序列中的一个或多个J^酸可用具有相似极性的其它M酸作为功能等价物进行替代，导致就所述蛋白功能而言的沉默改变。序列中的氨基酸的替代物可以选自该氨基酸所属类型中的其它氨基酸。例如，非极性的(疏水的)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲疏氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。用上述相同类型中的氨基酸进行保守M酸替换所得的、与原始蛋白相比对靶昆虫保持了基本相同的杀昆虫活性的蛋白也包含于此作为本发明的ISP蛋白的等价物。此处所用的与ISP1A蛋白有"基本上相同的M,列"的蛋白是指与ISP1A蛋白具有至少90%,尤其是至少95%,优选至少97%序列同一性的蛋白，其中序列同一性百分数是用WisconsinGCG软件包(Madison，Wisconsin,USA)10.0版(用GCG缺省值)中的GAP程序里的blosum62评分矩阵确定的。在本申请中沿用的"序列同一性，，当涉及蛋白时是指用此指定的分析方法得到的同一氨基酸的百分数。此处所用的"序列同一性"当涉及DNA序列时是用WisconsinGCG软件包(Madison,Wisconsin,USA)IO.O版(用GCG缺省值)中的GAP程序里的nwsgapdna评分矩阵确定的。此处所用的"ISP蛋白"或"本发明的ISP蛋白，，是指本发明中的任意一种新蛋白，此处表示为ISP1A或ISP2A蛋白或它们的等价物。"ISP原毒素"是指由天然存在的细菌DNA序列编码的包括信号肽在内的全长1SP1A或1SP2A蛋白。"ISP毒素，，是指其中的杀昆虫片段，特别是其最小毒性片段或已去除了信号肽的成熟蛋白。此处所用的"成熟的ISP"是指由天然的细菌宿主细胞分泌出的本发明的ISP蛋白，其与ISP-支助蛋白(没有N末端细菌信号肽序列)组合具有杀昆虫活性。成熟的ISP蛋白可以具有完整的天然C末端也可以是C-末端截短的蛋白。由细菌，优选非苏云金芽孢杆菌(B.Thuringiensis)或蜡状芽M茵(B.ccrcus)的细菌，特别是侧孢短小芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)分泌的、成熟形式的表观分子量为约95到约100kD、且特征在于当与下述第二蛋白或其具有杀昆虫活性的片段相组合时具有显著的杀昆虫活性的第一蛋白，或所述第一蛋白中具有杀昆虫活性的片段也作为ISP蛋白包括在本发明的范围内，其中所述的第二蛋白是由细菌，优选不是苏云金芽孢杆菌(B.Thurindensis)或蜡状芽孢杆菌(B.cereus)细菌，特别是侧孢短小芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)分泌的、成熟形式的表爿见分子量为约45到约50kD，优选约45kD的蛋白，其中所述第一和所述第二蛋白或它们的杀昆虫片段的組合在被昆虫摄入后对马铃薯甲虫、西部玉米根虫、南部玉米根虫和北部玉米根虫的幼虫具有明显的杀昆虫活性，但所述蛋白组合被玉米螟(Ostrinianubilalis)、草地粘虫(Spodopterafrugiperda)、烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)、美洲棉铃虫(Hclicovcrpazcb)和Sesamianonagroides賴Uv后没有明显的杀昆虫活性，且其中所述的第一蛋白单独被昆虫損k后也没有明显的杀昆虫活性。与上述第一蛋白组合被昆虫摘入后具有杀昆虫活性的上述第二蛋白也包括在本发明内。此处所用到的"^Jf见分子量，，是以分子量标准为参照通过SDS-PAGE分析显示的分子量。本领域的技术人员知道这一分子量是近似确定的分子量，与基于M酸序列确定的分子量相比可以有约10-15%的差异。此处所用的术语"isplADNA"或"isp2ADNA"是指分别编码以上定义的ISP1A或ISP2A蛋白的DNA序列。这包括编码以上定义的新分离蛋白或其片段的天然、人工的或合成的DNA序列，特别是经修饰后具有与植物中的密码子使用更为匹配的密码子使用的DNA序列。编码ISP1A和ISP2A蛋白的人工DNA序列的例子分别如SEQIDNos.9和7(由这些DNA序列编码的ISP蛋白在此处定义为ISP1A-1和ISP2A-1)所示。编码杀昆虫蛋白并与SEQIDNo.1,3，7或9DNA序列足够相似以致于能够与这些DNA序列在严紧条件下杂交(即，有这种能力)的DNA序列也包含于此。此处所用到的"严紧杂交条件"特别是指在其中仍可获得杂交的下述条件将第一DNA序列固定在滤膜上，于50%甲酰胺，5%SSPE，2xDenhardt氏试剂和0.1%SDS中于42。C预杂交l到2小时，或在6xSSC，2xDenhardt氏试剂和0.1%SDS中于68°C下预杂交1到2小时。然后将变性的放射性标记的第二DNA直接加到预杂交液中，在任意一个以上选择的温度下温育16到24小时。温育后将上述滤膜在室温下用lxSSC，O.l。/。SDS洗20分钟，然后在68。C下用0.2xSSC和0.1%SDS洗3次，各20分钟。使用增感屏将上述的滤膜对X-光片(KodakXAR-2或其等价物)于-70。C曝光24到48小时得到放射自显影像。当然，上述过程中也可以使用等价的条件和参数而仍能保持所需的严紧杂交条件。此处16所用到的严紧杂交优选出现于至少有90%到95%，优选至少97%，特别是99%序列同一性的DNA序列之间。包含在"isplDNA"定义中的还有编码下述蛋白的所有DNA序列，所述的蛋白与SEQID.No.2的蛋白具有至少卯％，优选至少95%，特别是至少97%，最优选至少99%的序列同一性，而且其与SEQID.No.2所示蛋白具有基^目同，优选相同的杀昆虫活性，其中所述蛋白序列同一性是用WisconsinGCG软件包(Madison，Wisconsin,USA)10.0版(用GCG缺省值)中的GAP程序里的blosum62评分矩阵确定的。包含在"isp2DNA，，定义中的还有编码下述蛋白的所有DNA序列，所述的蛋白与SEQID.No.4的蛋白有至少90%,优选至少95%，特别是至少97%,最优选至少99%的序列同一性，并且其与SEQID.No.4所示蛋白具有基本相同，优选相同的杀昆虫活性，其中所述蛋白序列同一性是用WisconsinGCG软件包(Madison，Wisconsin,USA)10.0版(用GCG缺省值)中的(;AP程序里的blosum62评分矩阵确定的。此处所用的"^j2基因"或"1^EDNA"是编码本发明的ISP蛋白的DNA序列，指4壬何一种上述定义的isplA或isp2ADNA序列。此处所用到的"i^DNA等价物"或"i^基因等价物"是编码上述定义的ISP等价物蛋白的DNA。此处所用到的术语"含序列X的DNA/蛋白"和"具有含序列X的序列的DNA/蛋白"是指在其核香酸序列或氨基酸序列中包括或含有至少序列X的DNA或蛋白，因此可以在5，(或N-末端)和/或3，(或C-末端)端包括其它核苷酸或^J^酸序列，例如N-末端转运肽或信号肽。此处所用的术语"包含"是一种开放式的表述，是"包括"的意思，指不是特指元件的其它元件也可以存在。此处所用术语"由…组成"是一种封闭式的表述，即仅存在那些特指元件。此处所用的术语"编码含序列X的蛋白的DNA"指含有下述编码序列的DNA，所述的编码序列经转录翻译后形成至少包含氨基酸序列X的蛋白。编码蛋白的DNA无需是天然存在的DNA，可以是半合成的，全合成的或人工DNA，并可以包括内含子和5，和/或3，侧翼区。此处所用的术语"核苷酸序列"指DNA或RNA分子的序列，所述分子可以是单链或双链形式。此处所用的术语"基因"指侧翼带有可使能翻译成蛋白的RNA得以转录的5，和/或3，调节序列的DNA编码区，典型地，所述的调节序列至少包含启动子区。对于本发明的J5fiDNA,"嵌合基因"是指具有不同于在天然的宿主细胞中驱动ISP蛋白表达的天然细菌5，和/或3，调节序列的5，和/或3'调节序列的j^DNA序列。此处所用到的"杀昆虫活性"或"杀昆虫作用"当指本发明的ISP蛋白或其等价物时是指当昆虫，优选鞘翅目昆虫，特别是玉米根虫，尤其是玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)才"ISP蛋白与ISP支助蛋白如第二ISP蛋白后，ISP蛋白杀死昆虫的能力比相同的实验条件下对照处理的杀昆虫水平高。优选地，所述的第二ISP蛋白是由与第一ISP蛋白相同的细菌操纵子编码的另一蛋白或其具杀昆虫活性的片段或其等价物，从而当昆虫摄入此蛋白组合时能获得最佳的昆虫死亡率。ISP蛋白的"昆虫控制量"是指在与ISP-支助蛋白组合应用这样的ISP蛋白时，足以将以该植物为食的昆虫对所述植物的损害限制在商业上可接受的水平的ISP蛋白的量，所述限制可以通过例如杀死昆虫或抑制昆虫的发育或生长从而降低它们对植物的损害且对植物的产量不造成明显的负面影响的方式来实现，其中所述的1SP-支助蛋白是例如另一种ISP蛋白，优选由与第一ISP蛋白相同的操纵子编码的另一蛋白或其具有杀昆虫活性的片段。此处所用到的"有杀昆虫作用的ISP片段"是指本发明的ISP蛋白的片段，其在与ISP支助蛋白，如另一种ISP蛋白，优选由与第一ISP蛋白相同的操纵子编码的另一ISP蛋白組合施用时保持杀昆虫活性。在上述涉及杀昆虫活性的定义中，所述的昆虫优选地是处于任何幼虫阶段的幼虫。本申请中会提到"I^DNA和其具有杀昆虫活性的片段或等价物"，在此种情况下所述的杀昆虫活性显然是指由所述DNA编码的蛋白的活性，而非DNA本身的杀昆虫活性。根据本发明，发现本发明的ISP蛋白及其等价物，尤其是成熟的ISP1A和ISP2A蛋白对选自烟芽夜蛾(Hdiothisviresceiis)，美洲棉铃虫(Helicoverpazea)，烟草天蛾(Manducasexta)，棉铃虫(Helicoverpaarmigera)，海灰翅夜蛾(Spodopteralittoralis)，草地粘虫(Spodopterafrugiperda),Sesamianonagroides和玉米螺(Ostrinianubilalis)的蜂翅目昆虫没有明显的杀昆虫活性。依照本发明，通过使编码ISP蛋白的DNA序列在转基因植物中表达，可使对本发明的ISP蛋白或其等价物敏感的靶昆虫与昆虫控制量，优选杀昆虫量的上述蛋白相接触。只有当所述的靶昆虫才聂入植物组织时，其才受这些杀昆虫蛋白的影响。因此，本发明的另一个目的是提^H吏植物具有杀鞘翅目昆虫活性的方法以^^控制鞘翅目昆虫的方法，所述的方法包括在田地里种植、播种或栽培用编码本发明的ISP蛋白的DNA序列转化的植物，特别是玉米。可以通it^领域已知的方法去除或修饰本发明的ISP蛋白的信号肽，参见例如已发表的PCT专利申请WO96/10083，或者可以用下述的肽替换所述的信号肽，所述肽为将所述蛋白转运到叶绿体的叶绿体转运肽(例如,VanDenBroeck等，1985，Nature313,358，或优选美国专利5，510,471中的经修饰的叶绿体转运肽)、分泌信号肽或使所述蛋白单巴向其它质体、线粒体、ER或另一种细胞器的肽，或者可以用甲硫氨酸或甲疏氨酸-丙氨酸二肽替换ISP蛋白的信号肽。使蛋白靶向胞内细胞器或分泌到植物细胞外或细胞壁的信号序列存在于天然存在的耙向或分泌蛋白中，优选在下述文献中描述的那些K16sgen等(1989,Mol,Gen.Genet.217，155-161)，K16sgen和Weil(1991，Mol.Gen.Genet.225，297-304)，Neuhaus&Rogers(1998,PlantMol.Biol.38，127-144)，Bih等(1999，J,Biol.Chem.274，2288422894)，Morris等(1999，Biochem.Biophys.Res.Commun.255，328-333)，Hesse等(1989，EMBO丄82453-2461),Tavladoraki等(1998，FEBSLett.426,62-66),Terashima等(1999,Appl.Microbiol.Biotechnol.52，516-523)，Park等(1997,J.Biol.Chem.272，6876-6881)，Shcherban等(1995，Proc.Natl.Acad.SciUSA92，9245-9249)(所有这些文献引A^文作为参考)，尤其是来自玉米的靶向或分泌蛋白的信号肽序列。尽管可以将编码这类植物信号肽的DNA序列插入到编码ISP1A的嵌合基因中和编码ISP2A的嵌合基因中用于在植物中表达，但在本发明的一个实施方案中，编码这类信号肽的DNA序列仅被插入到嵌合的ISP2A基因中，而嵌合的ISP1A基因中缺少信号肽或者由甲疏氨酸或曱疏氨酸-丙氨酸二肽替代了所述的信号肽。在本发明的一个优选实施方案中，如Gleba等(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA25，5973-5977)和Borisjuk等，1999(Nat.Biotechn.17，466-469)中所述，用强的根优先启动子(特别是来自玉米的强的根优先启动子)和使蛋白从根细胞向外分泌的N-末端信号肽(优选来自玉米的信号肽，特别是分泌蛋白的信号肽，优选选自青霉杀菌素、a-淀粉酶、多胺氧化酶、细胞分裂素氧化酶、内切木聚糖酶的玉米分泌蛋白的信号肽)，使所述的蛋白从根分泌出来。包含在本发明范围内的植物有玉米，棉花，大豆，豌豆，蚕豆，兵豆,马铃薯，番痴，烟草，莴苣，芸苔科植物，甘蔗，稻，油菜籽，芥菜，芦夢，小麦，大麦，咖啡，茶，葡萄，橡胶植物，甜菜，草皮草，高粱，燕麦，黑麦，洋葱，胡萝卜，韭菜，黄瓜，南瓜，甜瓜，向曰葵，特别是易受鞘翅目昆虫损害的任何植物，最优选玉米，所述的鞘翅目昆虫优选玉米根虫、马铃薯甲虫或象曱，特别是叶曱属(Diabrotica)或马铃薯叶曱属(Leptinotarsa)种的昆虫，最优选选自下组的任何昆虫玉米根叶曱(Diabroticavirgifera),Diabroticabarberi，黄瓜十一星叶甲(Diabroticaundecimpuncata)，马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata)和墨西哥棉铃象(Anthonomusgrandis)。此处所用到的"玉米"指所有的玉蜀黍(Zea呵s)种的植物、及各种玉蜀黍的种子、根或谷粒、或包含玉米细胞或直接由玉米细胞产生的其它材料，所述玉蜀黍包括但不限于饲料玉米、甜玉米、杂交玉米、白玉米和臼齿形玉米，其既可是杂交系也可是近交系。优选地，用于本发明的玉米是产生杂交玉米的适宜亲M系，最优选的是它们已经具有内源或转基因抗昆虫性，这4吏它们可以抗主要的玉米鳞翅目病虫害，其包括但不限于玉米螟(Ostrinianubilalis)。本发明的ISP1A和ISP2A蛋白可以按常规的方式从依照布达佩斯条约的规定于2000年1月11日保藏在BCCM-LMBP(比利时微生物协调保藏中心-分子生物学实验室-普拉斯米得科莱特(LMBP)，根特大学,K丄.莱德甘克街35，B-9000根特，比利时(BelgianCoordinatedCollectionsofMicroorganisms-LaboratoriumvoorMoleculaireBiologie-Plasmidencollectie,UniversityofGent,K丄.Ledeganckstraat35,B-9000Gent,Belgium)、保藏号为LMBP4009的大肠杆菌菌林中分离出来，或更优选地，上述蛋白可以从如下芽孢杆菌(Bacillus)菌抹的上清液中分离，所述的芽孢杆菌优选是用含有质粒pUCIB120/ISP(保藏号为LMBP4009)中的约7kbA^"I-EcoRI片段的质粒转化的无晶体苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)。所述的ISP蛋白可用于通过常规的方法制备特异的单克隆或多克隆抗体(H6fte等，1988，Appl.Environm.Microbiol.54，2010)。所述的ISP蛋白可以用蛋白酶，如半胱氨酸蛋白酶处理，以获得ISP蛋白的蛋白酶抗性片段。编码ISP蛋白的DNA序列可由常规的方法从所保藏的菌林中分离也可以在所编码的M酸序列的基础上合成。编码本发明的其它ISP蛋白的DNA序列可通过下述方式鉴定用限制性酶消化由分离菌林获得的总DNA;按大小分级分离由此产生的DNA片段，得到5到10Kb,优选7到10Kb的DNA断片；将这些断片与克隆载体相连接；用下述DNA探针筛选由所述克隆载体转化的大肠杆菌，所述的DNA探针为由已知的ISP蛋白基因的区域构建的DNA探针，或基于通过相应于已知isp蛋白基因的某个区域的引物从Medna产生的特定PCR片段的DNA探针。与本发明的ISP蛋白类似，根据本发明分离的这种"其它ISP蛋白"以任一个或4^P，优选全部下迷特性为特征a)当这种所谓的其它ISP蛋白与ISP-支助蛋白，优选本发明的成熟ISP1A或ISP2A蛋白被昆虫摄入后，它们对南部玉米根虫、黄瓜十一星叶甲的幼虫和马铃薯甲虫、马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata)的幼虫具有明显的杀昆虫活性；b)当这种所谓的其它ISP蛋白与ISP-支助蛋白，优选本发明的成熟ISPlA或ISP2A蛋白被昆虫才t7v后，它们对鳞翅目昆虫，优选玉米螟(Ostrinianubilalis)不具有明显的杀昆虫活性；c)其成熟形式(不21含信号肽)的表观分子量为约lOOkD或约45kD;d)它们存在于细菌培养物的上清液中，所述的细菌不是苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)或蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus);和e)在无ISP-支助蛋白存在的情况下被昆虫4IUV后，它们对玉米根虫，优选玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)没有明显的毒性。当然，可以根据特定的目的构建出在密码子使用上存在差异，但编码相同蛋白或具有基本上相同的杀昆虫活性的类似蛋白的任何其它DNA序列。已有报道在一些原核和真核表达系统中将密码子使用改变为宿主的密码子使用对于基因在外源宿主中的表达是理想的(Bennetzen&Hall，1982，J.Biol.Chem.257,3026;Itakura,1977，Science198，1056-1063)。密码子使用表可以从文献(Wada等，1990，Nucl.AcidsRes.18，2367-1411;Murray等，1989，NucleicAcidsResearch17，477-498)和主要的DNA序列数据库中获得。由此可以构建合成的DNA序列以产生相同或基本上相同的蛋白。显然，当本发明的ISP蛋白的^J^酸序列已知时可以设计几种DNA序列。这样的其它DNA序列包括经改变以^J^因中的某些位点失活的合成的或半合成的DNA序列，所述改变可通过例如选择性灭活存在于天然序列中的某些隐藏的调节或加工元件、或通过调节全部的密码子使用使之适应更相关的宿主生物(优选需要在其中表达所述DNA序列的宿主生物)的密码子使用来进行。合成的DNA序列也可以按EP0385962，EP0618967或EP0682115所描述的方法产生。对DNA序列进行的小修饰如上述的小修饰可以通过PCR介导的诱变常规进行(Ho等，1989，Gene77，51-59;White等，1989，TrendsinGenet.5，185-189)。新的合成的或半合成的基因可通过自动DNA合成然后连接所得的DNA片段来制备。为阻止或延迟鞘翅目昆虫，特别是玉米根虫、棉铃象甲或马铃薯曱虫，优选马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata)、Diabroticabarberi、Diabroticaundecimpuncata、墨西哥棉铃象(Anthonomusgrandis)或玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)对表达本发明的ISP蛋白或其等价物的转基因宿主(特别是植物)产生抗性，优选在相同的宿主(优选转基因植物)中再表达另一种当其在转基因宿主(优选植物)中产生后以不同的作用方式对上述第一种毒素或毒素复合物所靶向的同种昆虫产生高毒性的蛋白或蛋白复合物。适合与本发明的ISP1A和ISP2A相组合的侯选蛋白包括与PCT出版物WO96/10083中的成熟VIP2Aa或VIP2Ab蛋白组合的成熟VIPlAa蛋白，条件是这些VIP蛋白与所述的ISP蛋白相比具有不同的作用方式；Photorhabdus或致病杆菌属(Xenorhabdus)种的玉米根虫毒素，例如发光杆菌(Photorhabdusluminescens)W-14的杀昆虫蛋白(Guo等，1999，丄Biol.Chem.274，9836-9842);WO00/26378中的CryET70蛋白；WO97/40162中所描述的Bt菌林PS80JJ1，PS149B1和PS167H2产生的杀昆虫蛋白，特别是Bt菌林PS149B1的约14kD和约44kD蛋白；美国专利6,023,013中的Cry3Bb蛋白；蛋白酶抑制剂，例如大豆N2和Rl半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Zhao等，1996，PlantPhysiol.111，1299-1306)，或oryzastatine如水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Genbank登录号S49967),玉米半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Genbank登录号D38130，D10622,D63342)例如Irie等(1996，PlantMol.Biol.30，149-157)描述的在植物中表达的玉米半胱氨酸蛋白酶抑制剂。上述蛋白的所有等价物和变异体，如保持杀昆虫活性的截短蛋白也包括在此中。这种组合表达可以通过如下方式实现对经转化已表达玉米根虫毒素蛋白或蛋白复合物的植物进行转化，或使经转化表达不同玉米根虫毒素蛋白的植物杂交。或者，可以在玉米根虫幼虫摄食根组织时诱导本发明的ISP蛋白在根中表达，例如用损伤诱导型启动子区域，优选损伤诱导型根优先的启动子区域来进行诱导。可以将从本发明isp基因的总DNA制备的5到10，优选7到10Kb的片段与合适的表达载体相连然后转化到大肠杆菌中，再用针对ISP蛋白的单克隆或多克隆抗体通过常规的菌落免疫探测方法(French等，1986，Anal.Biochem.156，417-423)篩选表达所述毒素的克隆。还可以将由本发明的细菌菌林的总DNA制备的5到10Kb的片段与合适的Bt穿梭栽体(Lereclus等，1992，Bio/Technology10,418)相连接，然后转化无晶体Bt突变体。之后筛选产生ISP蛋白的克隆(通过SDS-PAGE，Western印迹和/或昆虫实验)。编码本发明的ISP蛋白的基因可以通过常规的方法测序(Maxam和Gilbert,1980,MethodsinEnzymol,65，499-560;Sanger,1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467)以获得其DNA序列。序列比较显示所述的基因与以前描述的芽孢杆菌或其它细菌菌种在营养生长阶段分泌的蛋白的编码基因以及具有抗鞘翅目昆虫活性的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)晶体蛋白的编码基因均不同(Crickmore,等，1998，MicrobiologyandMolecularBiologyReviewsVol62:807-813;WO98/44137，WO94/21795,WO96/10083，WO00/09697，WO9957282和WO9746105)。为了在大肠杆菌、其它细菌菌林或植物中表达编码本发明ISP蛋白的DNA序列的全部或有杀昆虫活性的部分，可以在所述DNA序列的两侧引入合适的限制性位点。这可以通过已知的方法(例如，Stanssens等，1989，NucleicAcidsResearch12，4441-4454;White等，1989，同上)由定点诱变完成。为能在植物中表达，本发明的j^DNA或其等价物通常包含于两测带有5'和3'调节序列的嵌合基因中，所述的调节序列包括在植物中可表达的启动子区域和在植物细胞中有活性的3'转录终止以及多腺苦酸化序列。为增强在植物中的表达，可对本发明的j^DNA或其等价物的密码子使用进行修饰以形成等价的、修饰的或人工的基因或部分基因，或者，可以将所述的DNA或其有杀昆虫作用的部分插入到叶绿体基因组中并利用在叶绿体中有活性的启动子使之在其中表达(例如，McBride等，1995，Bio/Technology13，362)。为了增强在单子叶植物，如玉米中的表达，也可以向嵌合基因中加入单子叶植物内含子，并且i5EDNA或其有杀昆虫作用的部分可以进一步以翻译上中性的方式改变，通过定点内含子插入和/性DNA序列，例如在不明显改变所编码的M酸序列的情况下调整密码24子使用使之对特定的植物而言是最优选的(Murray等，1989，见上)。编码ISP蛋白的有杀昆虫作用的kfiDNA或其等价物，优选l^fi嵌合基因可以通过常规的方法稳定地插入到单一植物细胞的核基因组中，由此转化的植物细胞可通过常规的方法用于产生抗昆虫的转化植物。在这一方面，根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)中含有具杀昆虫作用的isp基因部分的卸曱(disarmed)Ti质粒可以用于转化植物细胞，其后可以用下述文献中描述的方法从该转化的植物细胞再生转化植物，所述文献例如EPO116718，EP0270822，PCT出版物WO84/02913和已7〉开的欧洲专利申请("EP")0242246和Gould等(1991，PlantPhysiol.95，426-434)。优选的Ti-质粒栽体均包含位于Ti-质粒的T-DNA边界序列之间或至少定位于右边界序列的左侧的有杀昆虫活性的J5￡嵌合基因序列。当然，应用下述方法，其它类型的栽体也可以用于转化植物细胞，所述的方法如直接基因转移(如EP0233247中所描述)，花粉介导的转化(如EP0270356,PCT出版物WO85/01856,和美国专利4，684，611中的描述)，植物RNA病毒介导的转化(如EPO067553和美国专利4,407,956中所描述的)，脂质体介导的转化(如美国专利4,536,475中所描述的)，以及其它的方法例如用于转化某些玉米林系(Fromm等，1990，Bio/Technology8，833-839;Gordon-Kamm等，1990，ThePlantCell2，603-618,US专利5，767，367)和水稻林系的方法(Shimamoto等，1989，Nature338，274-276;Datta等，1990，Bio/Technology8，736-740)和最近公开的一般用于转化单子叶植物的方法(PCT出版物WO92/09696)。为实现两种ISP蛋白在转基因植物中的组合表达可以应用不同的常规方法，小结如下I.通过嵌合基因构建体^f吏两个ISPDNA序列和标记基因作为单一的一段DNA转移到植物基因组中，并且插入到基因组的单一位点中。la.改造所述的基因使之处于受不同启动子控制的不同转录单元中。为使两个ISP蛋白和标记蛋白作为分离的转录单元表达，如上所述可以应用在植物细胞中指导表达的几个启动子片段。对于一个ISP基因的嵌合构建体，上述启动子均可以组合在其中。在本发明的每一嵌合基因中的ISP编码区可以是完整的基因，或优选是完整ie基因中具有杀昆虫活性的部分。依照标准的方法(例如，EP0193259)将各个嵌合基因克隆到同一质粒载体中。Ib.可以将两个基因(例如，和标记基因或两个j^E基因)或更多个基因组合在同一个转录单元中。为在相同的转录单元中表达两个基因，能够区分出下述的情况在第一种情况中，可以将其中一个基因的编码区按符合读框的方式与另一基因的编码区融合的杂合基因置于单一启动子的控制之下。可以使j^基因和标记基因融合，也可以使两个isp基因融合。而且，在两个编码ISP或其具有杀昆虫活性的片段的基因之间可以包含一段编码对蛋白酶(例如，胰蛋白酶，半胱氨酸或丝氨酸蛋白酶)敏感的蛋白部分的基因片段，例如编码可通过靶昆虫中肠酶的激活作用而去除或裂开的ISP蛋白部分的基因片段。或者，在两个编码ISP或其具有杀昆虫活性的片段的基因之间可以包含一段编码具有约16到20个氛基酸、无须酶反应即能介导在自身C末端裂解的肽的基因片段(Halpin等，1999，PlantJ.17,453-459，US专利5,846,767),或编码接头肽序列的基因片段，所述的接头肽使得可以产生对靶昆虫具有显著毒性的重组细胞。在第二种情况下，可以将两个isp基因的相应编码区组合于一个启动子控制下的双顺反子单元中。两个isP基因的编码区彼此前后排列，中间有规定长度的基因间序列。产生单一的信使RNA分子，而翻译成两个分离的基因产物。基于经修饰的扫描模型(Kozak，1987,Mol.Cell.Biol.7，3438-3445)，翻译再起始的概念已被接受，条件是具有上游ATG的框内的终止密码子在下游的ATG之前。实验数据也显示植物的翻译机器能由多顺反子mRNA合成几个多肽(Angenon等，1989,Mol.CellBiol.9，5676-5684)。基于翻译的内部起始机制(Jackson和Kaminski，1995，RNA1，985-1000)，第二个基因翻译的起始是通过43S前起始复合物与特定的基因间序列(内部核糖体ii^序列；IRES)结合而出现的。实验数据也显示植物的翻译机器能由含基因间IRES元件的多顺反子mRNA合成几个多肽(Hefferon等，1997，JGenVirol78，3051-3059;Skulachev等，1999，Virology263，139-154;PCT专利出版物WO98/54342)。II.将带有一个1§￡_基因的嵌合构建体转移到已有一个1^_基因转化到其中的植物的基因組中可在连续转化步骤(再转化)过程中将几个基因引入到植物细胞中，条件是对于第二轮转化有可供选择的篩选转化体的系统，或者选择标记基因可通过DNA重组技术从植物基因组中切除(例如，已^Hf的PCT申请WO94/17176和WO91/09957中所描述的)。这种再转化导致被引入到基因组中多个位点的isp基因的组合表达。优选地，在两个连续的转化步骤中使用两个不同的选择标记基因。第一个选择标记用于在第一次转化中选择转化细胞，笫二个选择标记用于在第二轮转化中选择转化体。利用卡那霉素和潮霉素的连续转化步骤已有报道，例如Sandler等(1988，PlantMol.Biol.11，301-310)和Delauney等(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，4300-4304)的描述。in.带有^基因的嵌合构建体通过独立的转化事件分别转移到不同的植物核基因组中，然后通过杂交结合到单一的植物基因组中。第一植物应当是用第一isP基因转化的植物或通过自花授粉从该植物衍生的Fl植物(优选具有纯合isp基因的Fl植物)。第二植物应当是用第二isP基因转化的植物或通过自花授粉从该植物衍生的Fl植物(优选具有纯合的第二j^基因的Fl植物)。筛选由此杂交获得的植物以获得在其基因组中存在这两个isp基因(如，Southern印迹)并表达这两个ISP(例如，对免疫学上不同的ISP的单独的ELISA检测)的植物。这是从用不同的i^基因转化的两亲本林系产生杂交变体的有用策略，并是通过来自相同近交系的两个独立转化体(或它们的Fl自花授粉子代)的杂交产生包含两个不同i^基因的近交系的有用策略。IV.将带有一个或多个j^基因的嵌合构建体通过同一个转化实验分别单独地转移到一个植物的基因組中，由此导致各个嵌合基因插在相同或不同的位点。共转化涉及用两个不同的表达载体同时转化一^^t物，所述的表达载体一个包含第一i^基因，另一个包含第二1基因。伴随每个|^_基因使用不同的标记基因，这样可以利用两个标记同时筛选。或者，可以使用一个标记，然后可以筛选足够大量的备选植物以获得具有两个i^基因(例如，通过Southern印迹)并表达两个蛋白(例如，通过ELISA的方式)的植物。用不只一个T-DNA进行的共转染可以同时用各带有不同的Ti质粒的两个不同的农杆菌菌林来完成(Depicker等，1985，Mol.Gen.Genet.201，477-484)，或用包含两个位于不同的质粒上的T-DNA的一个农杆菌来完成(deFramond等，1986，Mol.Gen.Genet.202,125-131)。用两种质粒或其片段的混合物进行的直接基因转移也可以用于可选择的基因和不可选择的基因向植物细胞的共转化(Schocher等，1986，Bio/technology4，1093-1096)。所得的转化植物可以在常规的植物育种方案中应用，以产生更多具有相同特征的转化植物或将具有杀昆虫活性的isP基因引入到相同或相关植物种的其它变体中。从所述转化植物收获的种子包含稳定地插入到其基因组中的杀昆虫性isp基因。可以用常规的方法培养转化植物的细胞以产生具有杀昆虫活性的ISP蛋白部分，可以回收该部分，将其用于常规的杀昆虫组合物中。当然，上述在植物中组合产生ISP蛋白的可能方案对本发明的ISP蛋白活性片段和ISP等价物同样适用。将具有杀昆虫活性的i^基因插入到植物细胞基因组中，使所插入的基因可操作地连接到可指导所述基因在植物细胞中表达的启动子的下游(即3，端)。优选地这通过向植物细胞基因组，特别是细胞核或叶绿体基因组中插入嵌合的isp基因来完成。优选的启动子包括隔离群CM1841(Gardner等，1981，Nucl.AcidsRes.9,2871-2887)，CabbB-S(Franck等，1980,Cell21，285-294)和CabbB-JI(Hull和Howell,1987，Virology86，482-493)的花椰菜花叶病毒(CaMV)强组成型35S启动子("35S启动子")；遍在蛋白家族的启动子(例如，Christensen等，1992，PlantMol.Biol.18，675-689中描述的玉米遍在蛋白启动子；也可参见Cornejo等，1993，PlantMol.Biol.23，567-581)，gos2启动子(dePater等，1992，PlantJ.2，837-844)，emu启动子(Last等，1990，Theor.Appl.Genet.81，581-588)，水稻肌动蛋白启动子，例如Zhang等(1991，ThePlantCell3，1155-1165)描述的启动子；和分别驱动T-DNA中l，和2'基因表达的TR1'启动子以及TR2，启动子(分别为"TRl'启动子"和"TR2，启动子")(Velten等，1984，EMBOJ3，2723-2730)。或者，可以使用非组成型但对植物的一个或多个组织或器官(例如叶和/或根)具有特异性的启动子，由此使所插入的1^2基因仅在特定的组织或器官的细胞中表达。在本发明的一个优选实施方案中，通过将具有杀昆虫活性的i^基因部分置于才艮优先的启动子(即，在植物的根组织中最活跃的启动子，优选在非根组织，例如花粉、叶和茎中不或几乎不转录的启动子，更优选只在根中进行可检测的转录的启动子)的控制之下，使具有杀昆虫活性的isp基因在植物，优选玉米的根中选择性地表达。根优先的启动子并不需，在根中具有活性。本发明的根优先的启动子包括但不限于紧M于相应于根特异的cDNA的DNA序列上游的启动子，优选来自玉米；美国专利5,837,876，已公开的PCT专利申请WO00/29594，WO00〃3474，WO01/00833,或美国专利6,008,436中的启动子；美国专利5,633,363和Held等(1997，PlantMol.Biol.35，367-375，Genbank登录号U38790)中的ZRP2启动子；美国专利5，817，502中的启动子；deFramond(1991，FEBS290:103-106;EP0452269)描述的启动子，来自小麦的过氧化物酶基因POX1的根特异性启动子(Hertig等，1991,PlantMolec.Biol.16,171-174)，美国专利5,837,848中的启动子，PCT出版物WO015662中的启动子，Goddemeier等(1998，PlantMol.Biol.36，799-802)所述的启动子。可动子Hirel等，1992,PlantMol.Biol.20，207;Keller和Baumgartner，1991，ThePlantCell3，1051-1061;Sanger等，1990，PlantMol.Biol.14,433-443;Miao等，1991，ThePlantCell3，11-22;Bogusz等，1990，ThePlantCell,2，633-641;Leach和Aoyagi，1991，PlantScience79，69-76;Teeri等，1989，EMBOJournal8，343-350，所有这些引入本文作为参考。如美国专利5,254,799中所述可以通过利用植物本身或其它植物例如豌豆的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基基因的启动子来实现在植物叶中的表达。另一可供选择的方案是使用可诱导(例如，通过温度或化学因子)表达的启动子。而且，对于玉米，特别当玉米根虫成虫出现在带玉米根虫的地里时，利用可在玉米花粉中表达的启动子区，如在已公开的PCT申请WO93/25695和WO01/12799中描述的启动子在花粉中进行表达是优选的。将具有杀昆虫活性的isp基因插入到植物基因组中，使所述的插入基因位于合适的3'端转录调节信号(即，转录本形成和多腺苷酸化信号)的上游(即，5，)。这优选通过将i^嵌合基因插入到植物细胞基因組中而完成。在本发明嵌合基因中3'调节序列的选择并不是关键性的。有些情况下，嵌合基因中不存在这样的区域也可以获得很好的表达，这是因为插入位点处的DNA序列可以充当3'调节序列。优选的多腺苷酸化和转录本形成信号包括CaMV35S(Mogen等，1990，ThePlantCell2，1261-1272)，章鱼肉碱合酶基因(Gielen等，1984，EMBOJ3，835-845),胭脂碱合酶基因(Depicker等，1982,J.Mol.Appl.Genet.1，p.561),和T-DNA基因7(Velten和Schdl，1985，NucleicAcidsResearch13，6981-6998)的这些信号，其可在转化的植物细胞中充当3，-非翻译DNA序列。任选地，具有杀昆虫活性的i^基因可作为与标记基因，如编码卡那霉素抗性的nco.基因(EP0242236)共用同一个启动子的杂合基因(US专利5,254,799;Vaeck等，1987，Nature327，33-37)选择性地插入到植物基因组中，以使所述植物表达融合蛋白。还可用全部或部分isp基因转化其它细菌，如对鞘翅目或鳞翅目昆虫具有杀昆虫活性的苏云金芽孢杆菌、或定居于根的细菌如定居于根的恶臭30假单孢菌(Pseudomonasputida)(Vilchez等，J.Bacteriol.182，91-99)。由此可产生对杀灭昆虫有用的并可影响多种鞘翅目和鳞翅目昆虫害虫的转化细菌。可以用整合到合适的克隆载体上的全部或部分isp基因进行细菌转化，所述的细菌:^口土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)或埃希氏菌属(Escherichia)细菌，所述的转化可以通过常规的方式如热激转化(Bergmans等，1981，J.Bacteriol146，564-570)或如Mahillon等(1989，FEMSMicrobiol.Letters60,205-210)和PCT专利出版物WO90/06999中所描迷的电穿孔技术来进行。含有本发明kEL基因的转化细菌菌林如芽孢杆菌属种菌林，优选苏云金芽孢杆菌可以通过常规的方法发酵(Dulmage，1981，"制备用于生物控制昆虫的细菌，，，BiologicalControlinCropProduction,编者Paparizas，D.C.，OsmunPublishers,Totowa,N.J.，USA,pp.129-141;Bernhard和Utz，1993，"制备实验用和商用的苏云金芽孢杆菌杀昆虫剂"，Bacillusthuringiensis,AnEnvironmentalBiopesticide:TheoryandPractice,pp.255-267，编者Entwistle，P.F.，Cory,J.S.，Bailey,M丄和Higgs，S.，JohnWileyandSons,纽约)以提供高产量的细胞。本发明的杀昆虫剂，特别是抗鞘翅目(优选抗玉米根虫)组合物可按常规的方式利用经isp基因转化的微生物或优选地它们各自的ISP蛋白或其具有杀昆虫活性的部分作为活性成份，与合适的载体、稀释剂、乳化剂和/或分歉剂一起配制(例如，参见Bernhard和Utz,1993，同上)。这种杀昆虫组合物可以配制成可湿性粉末、小球、颗粒或粉剂，或者用水性或非水性的溶剂配制的成液体制剂，泡沫，凝胶，悬液或浓缩液等。已知的微生物包括假单孢菌(Pse油mo腿)或其它细菌细胞，这些细胞使蛋白在用于昆虫之前被包封在稳定的环境中。包含本发明的ISP1A和ISP2A蛋白作为組合制剂用以同时、分开或连续使用以保护玉米不受玉米根虫侵害的的产品也包括在本发明的范围之内，具体说来，所述的产品是杀昆虫组合物或转基因玉米。本发明的控制昆虫，特别是鞘翅目昆虫的方法包括向待保护的场所(区域)施用(例如，喷洒)杀昆虫量的ISP蛋白或用本发明的i^E基因转化的宿主细胞。待保护的场所包括例如昆虫害虫栖息地或生长中的植物或将种植植物的区域。为获得ISP蛋白，可以按常规的方式在合适的培养基上培养表达ISP蛋白的重组宿主细胞，再通过常规的方式从培养基中收获蛋白。然后通过标准的技术如层析，抽提，电泳等分离纯化ISP蛋白。再用如半胱氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶消化所得的蛋白以获得抗蛋白酶形式的毒素。检测杀昆虫活性的生物试验是本领域熟知的。在Marrone等(1985，J.Econ.Entomol.78，2卯-293)中描述了一种玉米根虫试验方法，许多其它利用人工食物或转基因植物检测昆虫的方法也是已知的，例如美国专利5，9卯，383。在适宜的生物试验中包括适当的对照以检测背景死亡率。下面所给出的实施例用以举例说明本发明，但不作为对本发明或其保护范围的限制。这些实施例的许多改变形式和等价形式均是本领域的普通技术人员基于本发明的教导和公知常识所能作到或设想出的。本申请中提及的序列表(其作为本发明的一部分，附于其后)如下序列表SEQIDNo.1-ISP1A蛋白和DNA的^i^断列和DNA序列SEQIDNo.2-ISP1A蛋白的^J^,列SEQIDNo.3—ISP2A蛋白和DNA的氨基断列和DNA序列SEQIDNo.4—ISP2A蛋白的氨基^列SEQIDNo.5-短zrp2启动子片段的DNA序列(11=4壬意核苦酸)SEQIDNo.6-长zrp2启动子片段的DNA序列(n=任意核苦酸)SEQIDNo.7—编码ISP2A-1蛋白的DNA序列SEQIDNo.8画ISP2A-1蛋白的^J^断列SEQIDNo.9-编码ISP1A-1蛋白片段的DNA序列SEQIDNo.10-ISP1A-1蛋白的^J^^^列在实施例中如不另外指出，所有产生和操作重组DNA的步骤均依照如Sambrook等，MolecularCloning-ALaboratoryManual,SecondEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY(1989)，和Ausubel等(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols,USA第1、2巻中所述的标准方法进行。植物分子生物学操作的标准材料和方法参见PlantMolecularBiologyLabfax(1993),R.R.D.Croy编，BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications(UK)联合出版。PCR技术的操作见M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky和T.J.White等编写的"PCRprotocols:aguidetomethodsandapplications"(AcademicPress,Inc.,1990)中所述。实施例实施例1:菌林IB120-A的特征此处命名为IB120-A的细菌菌林是在墨西哥Morelos洲的田地里发现的。将该菌林在LB琼脂平板(添加1.5%琼脂的LB培养基；LB培养基:IOg/1胰蛋白胨，10g/1NaCl，5g/I酵母抽提物，pH7.3)上于28。C下培养过夜。为进行小规模的培养，接种20mlTB培养基(Terrific液体培养基12g/1胰蛋白胨，24g/1酵母抽提物，3.8g/1KH2P04,12.5g/1K2HP04，5ml/1甘油，pH7.1)并在约70转每分钟的旋转平台上于28。C下培养65小时。65小时后，向培养物中添加蛋白酶抑制剂混合物。此鸡尾酒混合物具有如下成分(所给体积为需要加入一份20ml的培养物中的体积)20(Hi1PMSF(100mM)，200^1苯甲脒.HCl(lOOmM)和s-i^-正-己酸(500mM)的混合物，400nlEGTA(0.5M),40^1抗蛋白酶(0.5mg/ml)/亮抑蛋白酶肽(0.5mg/ml)和20plP-巯基乙醇(14M)。将已加入蛋白酶抑制剂混合物的培养物3000rpm离心20分钟。某些情况下，将上清液用CentriprepYM-10离心过滤装置(MilliporeCat,No.4305)浓缩4倍。为长期保存，将一环产孢子的细胞加到0.5ml25%或50%甘油中，涡悬振荡后于-70。C下恭萍。产孢子的细胞是通过将所述菌株于LB琼脂平板上培养直到形成孢子(在光学显微镜下清晰可见)而获得的。将单细胞菌落在LB琼脂平板上培养后，对EB120-A菌沐涪养物的显微镜分析结果显示存在杆状可移动的单个营养细胞和含有卵形孢子的膨胀孢子嚢。在IB120-A菌抹培养物中没有检测到伴孢晶体。在人工食物(Sutter等(1971，J.Econ.Entomol.64，65-67)描述的食物)上进行的表面污染分析中，IB120-A菌林的上清液表现出对玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)幼虫(此后称作"Dv")的强烈毒性。上述分析是在24孔0^31"板中于24。((+/-1。(:)下进行的，50微升毒素溶液每孔(2cm2)，对每个样品用6个孔(每孔4个Ll(一龄)幼虫)进行分析(7天后作评价)。筛选在起始培养后7，24，30，48和120小时收获的上清液，显示在48小时对Dv有最强的毒性，在第7小时的时候没有发现明显的毒性。在第48小时，将上清液(总蛋白浓度214ng/ml)以1/1024稀释后仍可观察到50-60%的死亡率。在开始培养后48,65和144小时收获的IB120-A上清液(稀释比例为1/1到1/8)经热处理后丧失活性，但经疏酸铵沉淀后活性仍保留，M明所述的毒性化合物可能是一种蛋白质。利用旋转酶B基因(Yamada等，1999，Appl.Environm.Microbiol.65，1483-1490)的PCR引物对IB120-A菌林的初步表征提示其不是苏云金、炭疽(Bacillusanthracis)或蜡状芽孢杆菌亚种。用特异表征Paenibacillus属16SRNA序列的引物所进行的PCR也没有得到扩增产物，上述引物也识别緩病芽孢杆菌(Bacilluslentimorbus)和日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus。opilliae)(Pettersson等，1999，IntJSystBacteriol.49(2),531-540)。在NB(营养肉汤3g/l细菌培养用牛肉膏，5g/1细菌培养用蛋白胨，pH6.8)培养基中的生长表明该新菌林不是幼虫芽孢杆菌(Bacilluslarvae)种。因此这一IB120-A菌抹看来不同于目前已分离的已知产生不包含于晶体中的分泌型杀昆虫蛋白的芽M菌(Bacillus)菌林。基于杆状形状和需氧生长，该菌林可能是芽孢杆菌属(Bacillus)种的菌林。在用一组针对苏云金芽孢杆菌cry3基因的一般和特异引物分析菌株IB-120A时没有发现扩增产物。用标准的微生物鉴定技术对IB120-A菌林进行详细地分析，包括脂肪酸分析和结合API20E试验的API50CHB试验，表明这一菌林是侧孢短小芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)种的菌林实施例2.ispl和isp2DNA/蛋白的分离和表征为分离IB120-A中与毒性相关的基因，提取该菌林的总DNA并用Sau3A进行部分酶切。经消化的DNA用蔗糖梯度按大小分级分离，将在7kb到10kb范围的片段连接到用BamHI-消化及TsAP(热敏感的碱性磷酸酶)处理的克隆载体pUC19(Yannisch-Perron等，1985，Gene33，103-119.)上。将连接混合物通过电穿孔转化到大肠杆菌XL1-Blue细胞中。将转化体涂布在含Xgal和IPTG的LB-triacillin平板上，选择白色克隆用于滤膜杂交实验。用如下制备的DIG标记探针篩选含有所述载体的重组大肠杆菌克隆。首先，以IB120-A菌林细胞为模板进行PCR。所得的扩增产物经凝胶纯化后用作二次PCR反应的模板，所述的二次PCR使用DIG标记的dNTP和与第一次PCR反应相同的引物。将适当量的扩增产物用于杂^A应。鉴定了含带有全长1^_基因的质粒的阳性菌落后，利用染料末端标记方法和PerkinElmerAB1Prism-377DNA测序仪确定这些基因的序列。在阳性菌落中的克隆DNA片段上的两个开放阅读框的序列如SEQIDNo.1和3所示。发现这些DNA序列祐:组织在一个操纵子中并编码新蛋白ISP1A(SEQIDNo.2)和ISP2A(SEQIDNo.4),正是由于这两个蛋白的原因使我们观察到高杀昆虫活性。含带有毒性有关基因的pUC-衍生质粒(质粒pUCIB120/ISP)的阳性菌落已按布达佩斯条约的规定于2000年l月11日提交了保藏，作为保藏号为LMBP4009的大肠杆菌XLlBlue。从阳性菌^^取质粒，用和Ec"RI酶切(得到约7Kb的片段)，再将其连接到经同样限制性酶切的穿梭载体pSL40上。获得质粒pSLIB120/ISP。将该pSLIB120/ISP质粒转入不产生晶体的苏云金芽孢杆菌菌林中。这一重组Bt菌林的上清液依如下方式获得。将所述菌林在含红霉素(20jug/ml)的LB琼脂平板上于28。C下培养过夜。为进行小规模的培养，接种20ml含红霉素(20照/ml)的TB培养基并在约70转每分钟的旋转平台上于28。C下生长65小时。65小时后，向培养物中添加蛋白酶抑制剂混合物。此鸡尾酒混合物具有如下成分(所给体积为需要加入一份20ml培养物中的体积)200^1PMSF(100mM)，200jlU苯甲脒.HCI(100mM)和s-氨基-正-己酸(500mM)的混合物，40(VilEGTA(0.5M),40jil抗蛋白酶(0.5mg/ml)/亮抑蛋白酶肽(0.5mg/ml)和(3-巯基乙醇(14M)。将已加入蛋白酶抑制剂混合物的培养物3000rpm离心20分钟。某些情况下，将上清液用Centripr印YM-10离心过滤装置(MilliporeCat.No.4305)浓缩约4倍。在上述的Dv表面污染分析中，含pSLIB120/ISP质粒的重组Bt菌林的培养物上清液在起始培养后第48小时经1/1024稀释后仍表现出明显死亡率，在60%范围内，而对照(对照包含未经转化的Bt菌林的上清液)的死亡率为0%。it^明此分离的DNA编码IB120-A菌林中的杀昆虫组分，当其转移到其它细菌中后，该杀昆虫组分也可以表达并分泌到培养基中。使用以pSLIB120/ISP质粒转化的另一个独立的不产生晶体的Bt菌抹进行的毒性分析也确证了，与未经转化的对照相比转化菌林的上清液表现出高杀昆虫活性。通过上述用Dv幼虫进行的表面污染分析，发现表达两种ISP蛋白的Bt菌林的上清液的LC50值在4天后为3.5ng/cm2(基于上清液中的总蛋白浓度)。关于表达ISP1A和ISP2A蛋白的重组Bt菌林的上清液对所选择的鞘翅目昆虫的毒性的详细分析结果列于下表l中。本发明的ISP蛋白对西、北和南部玉米根虫幼虫以及马铃薯甲虫和棉铃象甲幼虫均具有显著的杀昆虫活性。成熟的ISP1和ISP2蛋白经硫酸铵沉淀再经过不同的色i瞽柱純化到近似均质。色镨分析表明ISP1A和ISP2A蛋白以等克分子比例存在于上清液中。发现ISP1A蛋白相当疏水而ISP2A相当亲水。对不产生晶体的重组Bt菌抹中产生的成熟ISP1A和ISP2A蛋白进行的M末端序列测定结果表明对于ISP1ASEQIDNo.2的第38位氨基酸和对于ISP2ASEQIDNo.4的第51位M^^存在于转化的Bt菌林上清液中的活性蛋白的N-末端氨基酸。ISP1A的N末端为IATTTQASKD,ISP2A的N末端为LVKTTNNTED，其与所分离的DNA序列的^J^酸序列完全匹配。用37，50，75，100和150kD分子量标记，通过8%SDS-PAGE凝胶电泳确定，纯的成熟ISP1A蛋白的表观分子量为约100kD，通过10%SDS-PAGE皿电泳确定，纯的成熟ISP2A蛋白的^J见分子量为约45kD。由重组菌林产生的成熟ISP1A和ISP2A蛋白的活性针对几种昆虫进行了评估，对于所选择的鞘翅目昆虫的结果列于下表l。表1:ISP1A-ISP2A对鞘翅目昆虫的活性<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>对表1的注释Dv:玉米才艮叶甲(Diabroticavirgifera)，西部玉米才艮虫；Db:Diabroticabarberi，北部玉米根虫；Du:黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabroticaundecimpunctatahowardi)，西部玉米+艮虫；Ld:马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata)，马铃著甲虫；Ag:墨西哥棉铃象(Anthoiiomusgrandis)，棉铃象甲；Ll:第一幼虫阶段；L2:第二幼虫阶段；L3:第三幼虫阶段;Ll+2d:孵4匕2天后；*:^%CL(CI^置信界限，LC50:杀死50%昆虫的上清液中的总蛋白浓度)。所用的生物测定Dv，Db，Du:以25pi/cm2的比例利用人工食物进行表面污染分析(参见上述)，7天后作评价；Ld:用马铃薯叶进行浸泡试验(切下马铃薯的叶，浸于毒性溶液中，晾干后置于盛有IO条幼虫的平皿(直径9cm)中；1天后，向平皿中加入未经处理的叶，5天后作评价)；Ag:人工食物捧入试验如Moore和Whisnant,HandbookofInsectRearing,Vol.I，PritahSingh和R.F.Moore;Elsevier,Amsterdam,1985，p.217中描述的食物;测定每25ml食物中掺入2ml毒素溶液，在24多孔Costar平板中(约1ml/孑L)进行，每孔1个卵，每个样品20个孔，14U作评价)。在表1报道的测定结果中，对照(未处理的食物，在此食物中添加了未经转化的无晶体Bt菌林的上清液或水)导致上述所有昆虫的死亡率不高于20%(根据幼虫阶段和昆虫种类的不同，对照死亡率在5到20%之间变化(20。/。值对应于Dv的第三幼虫阶段))。当从重组的Bt菌林上清液中纯化出ISP1A和ISP2A蛋白后，在联合施用等摩尔的上述蛋白时，通过上述的生物试验获得的针对玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)幼虫的LC50值与上述所得值没有显著的区别。在标准表面污染试验中生物测定成熟的1SP1A和ISP2A蛋白的混合物对选择的鳞翅目昆虫(欧洲玉米螟(Ostrinianubilialis),烟芽^M(Heliothisvirescens)，美洲棉铃虫(Helkoverpaze3)，草地粘虫(Spodopterafrugiperda),Sesamianonagrioides,海灰翅^M(Spodopteralittoralis)，棉铃虫(Helicoverpaarmigera)，和烟草天蛾(Manducasexta))的作用，结果表明与对照相比本发明的ISP蛋白在这些昆虫中并没有引起较高死亡率。这证实了本发明蛋白的鞘翅目昆虫特异性性质。用两蚜虫种所进行的初步生物试验也表明ISP1A和ISP2A蛋白的混合物并不在这些昆虫中引起明显的死亡率。为确定是i^E基因的哪个片WL以编码对叶甲(Diabrotica)幼虫具有毒性的ISP蛋白复合物，通过向i§2基因的ORF中的不同位置插入终止密码子(由此形成不同的3，基因截短)以获得一系列的C-末端截短ISP蛋白。所述的终止密码子通过GenomePrimingSystem(GPS，NewEnglandBiolabs，catalog#7100)插入在随机的位置。利用这一系统，1.7kb转座子(在全部三个开放阅读框和2个与特异引物支助的序列中均包含终止密码子)被随机地插入到"耙，，DNA中，但只插入一次。这样可以通过基因特异性的引物和转座子特异性的引物由PCR筛选估计，或通过测序精确地确定插入的位置和由此造成的截短。然后用一组在一个j^基因的不同位置带有转座子的构建体分别单独转化无晶体的股菌林，并通过上述的试验测定西部玉米根虫幼虫对这些重组Bt菌林上清液的敏感性。为使亟基因截短，用必WBI和切下质粒pSLIB120/ISP上含所述基因的片段。在GPS反应之后，将这一片段连接到经同样酶切的pSLlB120/ISP栽体上。通过PCR筛选重组的^M杆菌菌落以估计转座子的插入位点。选出一组在M基因的第二半部分(3，半部分)中的不同位置带有转座子的10个克隆。将这些克隆中的质粒转4^到dcm和dam曱基化酶阴性的大肠杆菌菌林GM2163中。再将从这一菌林中分离出的质粒转化到无晶体的Bt菌林中。制备上清液进行生物分析，以用pSLIB120/ISP转化的Bt菌林的上清液作为阳性对照，用无晶体的Bt菌林的上清液作为阴性对照。为截短i^i基因用P附A和￡V:oRI从pSLIB120/ISP上切下一个片段。所用的方法与截短M基因所用的方法类似。转座子插入分析的结果表明在isp2A基因3，末端相对大片段的截短会使毒性遭到破坏，这表明在ISP2A蛋白中不允许C-末端截短或只允许相对短的C-末端截短。测序后，发现在本研究中在与ISP1A蛋白组合测定时仍保留毒性的最短C-末端截短ISP2A毒素片段截止到SEQIDNo.4中第449这些分析的结果表明，在ISP1A蛋白3，末端进行大片段的截短是可能的序列测定显示带有最大的C-末端截短的毒性片段截止到SEQIDNo.2中的第768位氨基酸。这样，在不丧失毒性的前提下ISP1A编码区可在3，端缺失约300bp。上述研究#明在没有功能性的ISP1A蛋白产生时，杀昆虫活性下降到背景水平，这确证了本发明的ISP蛋白的二元本质。因此，SEQIDNo.4中第51位到449位^J^酸的ISP2A蛋白和SEQIDNo.2中第38位到第768位M酸的ISP1A蛋白是ISP蛋白的有用杀昆虫片段。而且，我们使含融合了ISP1A和ISP2A基因的DNA的嵌合基因在无晶体的苏云金芽孢杆菌berliner1715菌林中表达。在编码ISP2A和ISP1A蛋白(ISP2A仍保留其N端信号肽，而ISPIA的信号肽缺失)的开放阅读框之间有编码Arg-Lys接头(RKRKRK)的DNA序列或编码Gly接头(GGGGGG)的DNA序列，因此可以产生可翻译的融合蛋白，即其中有指定的接头将ISP2A蛋白(作为N-末端融^分)连接到ISP1A蛋白(作为C-末端融合部分)上的融合蛋白。已证明重组Bt菌林可使玉米根叶曱(Diabroticavirgifera)的死亡率明显高于未转〗t的对照菌林(即无晶体的Bt1715菌林)引起的死亡率。it^明可用单嵌合基因使本发明的ISP蛋白作为融合蛋白在重组的宿主细胞中产生。显然，如本说明书中所描述的，可以用多种不同的方法在重组细胞，如才直物细胞中产生融合蛋白。实施例3:在植物中生产ISP蛋白为在植物中获得理想的表达，可修饰天然的isplA和isp2A基因以产生编码ISP1A和ISP2A蛋白的1务饰DNA序列。编码其信号狀:陂曱石克氨酸和丙氨酸替换的ISP1A-1和ISP2A-1蛋白的理想DNA序列分别如SEQIDNo.9和7所示。通过标准的技术插入到嵌合基因中的编码区与适宜的调节序列(如基于SEQIDNo.5或6的长或短zrp2启动子序列的启动子、适当的3，转录终止和苦酸化序列)可操作地连接。在一些构建体中，上述的嵌合基因包含编码导致靶向质体的如美国专利5,510,471(或再颁布的美国专利RE036449)中所描述的优化的叶绿体转运肽(代替N-末端的细菌信号肽)、或者导致耙向细胞壁的信号肽的DNA序列。类似地，也可以使用其它在植物细胞中有效的信号肽，优选由7jc稻a-淀粉酶3基因编码的信号肽(Sutliff等，1991，PlantMolec.Biol.16,579-591)、由菠菜纟失氧还原蛋白NADP+氧化还原酶基因编码的信号肽(OelmueHer等，1993，Mol.Gen.Genet.237,261-272)、或由马铃薯蛋白酶抑制剂基因II编码的信号肽(Keil等，1986，Nucl.AcidsRes.14，5641-5650)。通过农杆菌介导的转化(Ishida等，1996，NatureBiotechnology14，745-750;和U.S.专利No.5,591,616)、如美国专利5,792,936所述的原生质体转化、或如WO92/09696或美国专利5,641,664中所述的用损伤的并经酶降解的成胚愈伤组织进行的电穿孔，使上述的isplA和isp2A嵌合基因稳定转化玉米细胞(所有这些文献在此处引入作为参考)。由转化的细胞再生玉米植抹，再根椐在根中的最佳表达水平和综合农艺性状进行选择。由此获得产生上述ISP蛋白的转基因玉米植林，其对试图以此种植物为食的玉米根叶甲(Diabroticavirgifera)可引起显著的死亡率。依照本发明，也可以获得含有几种DNA构建体的稳定转化的玉米植林，或两种本发明的ISP蛋白以及合适的标记基因，优选除草剂抗性基因。在这些DNA构建体中，优选的3'转录终止和多fJ^苷酸化序列是含有由花椰菜花叶病毒中获得的3'转录终止和多聚腺苷酸化序列的215bp片段(Oka等，1981，J.Mol.Biol.147，217-226)。在一些构建体中可以加入5，非翻译前导序列，优选那些来自碧冬茄属(Petunia)cab22基因(Harpster等，1988，Mol.GenGenetics212，182-190)或zrp2基因(Held等，1997，PlantMolecularBiology35,367-375，Genbank登录号U38790)的前导序列。在这些构建体中优选的启动子是35S启动子(例如，Odell等，1985,Nature313，810-812)或zrp2启动子(Held等，1997,PlantMolecularBiology35,367-375，Genbank登录号U387卯)的有效启动子部分。除了上述优化的叶绿体转运狀之外，所述的构建体还可以包含在植物细胞中有效的信号肽，即水稻a-淀粉酶3基因信号肽(Sutliff等，1991，PlantMolec.Biol.16，579-591)、来自菠菜的4失氧还原蛋白NADP+氧化还原酶信号肽(Oelmudler等，1993，Mol.Gen.Genet.237，261-272)、或来自马铃薯的蛋白酶抑制剂II的信号肽(Keil等，1986，Nucl.AddsRes.14，5641-5650)。选择以上的优选元件用ISP嵌合基因以本领域普通技术人员所掌握的技术转化植物即可用于实现本发明的目的。优选地，所述植物还包括编码赋予草胺膦(glufosinate)或草甘膦抗性的蛋白的基因，其可应用不同的启动子和/或前导序列，例如gos2启动子和/或gos2前导序列(dePater等，1992，PlantJ.2，837-844)。显然，本发明并不仅仅局限于上述使用的玉米植物、转化方法及特定的ISP蛋白或DNA序列。相反，本发明还包括保留杀昆虫活性的ISP蛋白的变异体或等价物，如基本上具有本发明的ISP蛋白的M酸序列并基本上具有ISP蛋白的杀昆虫活性的蛋白。另外，任何易受下述昆虫损害的植物均包含在本发明的范围内作为编码ISP蛋白的DNA所转化的优选乾植物，所述的昆虫为鞘翅目的昆虫，尤其是玉米根虫，象甲或马铃薯甲虫，特别是玉米才艮叶甲(Diabroticavirgifera)或马铃薯叶曱(Leptinotarsadecemlineata)，优选的昆虫选自杨树莹叶曱(Agelasticaalni)，紫苜蓿叶象(Hyperapostica)，埃及苜蓿叶象(Hyperabruimeipennis)，Halticatombacina，墨西哥冲帛铃象(Anthonomusgrandis),黄粉虫(Tencbriomolitor),赤4以谷盗(Triboleumcastaneum)，水稻铁甲(Dkladispaarmigera)，Trichispaseries,7K稻负泥虫(Oulcmaoryz狄)，葡萄肖叶甲(Colaspisbru画a),稻水象曱(Lissorhorptrusoryzophaus),萝卜菜浪匕甲Phvllotretacmciferae,黄曲条菜i^甲(Phyllotretastriolata)，忽布贞匕曱(Psylliodespunctulata),美洲油菜叶甲(Entomoscelisamericana)，油菜露尾虫(Meligethesaeneus),龟象属种(Ceutorynchus)，油菜金头淑^甲(Psylliodeschrysoc印hala)2豌豆细玟浪l甲(Phyllotretaundulata)，马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata)，黄瓜十一星叶曱亚种(Diabroticaundecimminctataundecimpunctata),黄瓜十~-'星叶甲食根亚种(Diabroticaundecimpunctatahowardi)，Diabroticabarberi和玉米才艮叶甲(Diabroticavirgifera)。序列表<rio〉拜尔生物科学股份有限公司<120>细菌杀昆虫蛋白<130〉C認SPWOl<150〉US09/573,872<151〉2000-05-18<160>10<170>Patentln版本3.0<210>1〈211〉2616<212>DNA〈213>侧孢短小芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)<220><221>CDS〈222>(1)..(2613)<400>1atgaaatatatgaaaMetLysTyrMetLys15ttcgettctatgtttPheAlaSerMetPhe20agtaaaacaaatcagSerLysThrAsnGin35caaatagatcgagaaGinI]eAspArgGlu50tttaatgatcttaccPheAsnAspLeuThr65aaaggattatctagtgttgtaataggtacgttg48LysGlyLeuSerSerValVallieGlyThrLeu1015ttgaatgggaatgtaaatgetgtttacgcgaac96LeuAsnGlyAsnValAsnAlaValTyrAlaAsn2530attgetacaacaactcaggcaageaaagacaac144lieAlaThrThrThrGinAlaSerLysAspAsn4045ggaetacttggttattactttaaaggaaaagat192GlyLeuLeuGlyTyrTyrPheLysGlyLysAsp5560ttgtttgcaccgacacgtgataatactcttatt240LeuPheAlaProThrArgAspAsnThrLeulie707580tatgaccaacaaacagcaaatacaetagtagatcaaaagcatcaagaet288丁yrAspGinGinThrAlaAsnThrLeuValAspGinLysHisGinGlu859095tatcattctattcgctggattggattgattcagagtagtgcaacagga336TyrHisSerlieArgTrplieGlyLeulieGinSerSerAlaThrGly100105110gatttcacatttaaattgteagatgatgaaaatgccateattgaattg384AspPheThrPheLysLeuSerAspAspGluAsnAlalielieGluLeu115120125gatgggaaagttatttctgaaaaaggtaacaataaacaaagtgttcat432AspGlyLysVallieSerGluLysGlyAsnAsnLysGinSerValHis130135140gaaaaaggacagttggtgcaaataaaaattgagtaccaateagac480LeuGluLysGlyGinLeuValGinT]eLyslieGluTyrGinSerAspM5150155160gatgcattacatatagataataeiaatttttaaagagcttaagetattc528AspAlaLeuHislieAspAsnLysliePheLysGluLeuLysLeuPhe165170175aagatagatagtcasaatcactctcaacaagttcaacaagatgaactg576LyslieAspSerGinAsnHisSerGinGinValGinGinAspGluLeu180185190agaaaccctgagtttaataagaaagaaacgcaagtattcttaaagaaa624ArgAsnProGluPheAsnLysLysGluThrGinValPheLeuLysLys195200205gcatcgaaaacaaatctttttacacaaaaaacaaaaagagacattgat672AlaSerLysThrAsnLeuPheThrGinLysThrLysArgAsplieAsp210215220gaagatacggatacagatggagattctatecctgatgtttgggaagaa720GluAspThrAspThrAspGlyAspSerlieProAspValTrpGluGlu225230235240aacgggtataccattcaaaacaaagtcgcagtcaaatgggatgattcg768AsnGlyTyrThrlieGinAsnLysValAlaValLysTrpAspAspSer245250255ttagcaagtaaagggtatcaaaaatttacttctaatccaetagaagca81644LeuAlaSerLysGlyTyrGinLysPheThrSerAsnProLeuGluAla260265270cacacagttggagatccctatagtgattatgaaaaagetgcaagagat864HisThrValGlyAspProTyrSerAspTyrGluLysAlaAlaArgAsp275280285atgcccttatcgaatgcaaaagaaacttttaatcctctggttgccgcc912MetProLeuSerAsnAlaLysGluThrPheAsnProLeuValAlaAla290295300tttccateagtaaatgttagtttagaaaaggtgattttatecaaaaat960PheProSerValAsnValSerLeuGluLysVallieLeuSerLysAsn305310315320gaagaccttteccatagegttgaaageagtcaatctaccaattggtct1008Gl.uAspLeuSerHisSerValGluSerSerGinSerThrAsnTrpSer325330335tataccaatactgaaggcgttaacgtcaatgccggatggteaggctta1056TyrThrAsnThrGluGlyValAsnValAsnAlaGlyTrpSerGlyLeu340345350ggacctagttttggagtttctgttaactatcaacatagtgaaactgta1104GlyProSerPheGlyValSerValAsnTyrGinHisSerGluThrVal355360365gcaaatgaatggggttctgcgacgaatgatggcacacatataaatgga1152AlaAsnGluTrpGlySerAlaThrAsnAspGlyThrHislieAsnGly370375380gcggaatctgettatttaaacgcaaatgttcgctataataacgttggg1200AlaGluSerAlaTyrLeuAsnAlaAsnValArgTyrAsnAsnValGly385390395400acaggagcaatttatgaaacgaaaccaacaacgagttttattcttgat1248ThrGlyAlalieTyrGluThrLysProThrThrSerPhelieLeuAsp405410415ggaacaacaattggaacgattaaagcaaaagaaaatacaacagett"ta1296GlyThrThrlieGlyThrlieLysAlaLysGluAsnThrThrAlaLeu420425430actattttaccggaccaaagetatccagag犯agggaaaaacggaate1344ThrlieLeuProAspGinSerTyrProGluLysGlyLysAsnGlylie435440445gcaattaacacaatggatgattttaactctcgcccaattccattaaat1392AlalieAsnThrMetAspAspPheAsnSerArgProlieProLeuAsn450455460aaagagcaaetaaatacttatttatctaataaaaaaccaateetactt1440I,ysGluGinLeuAsnThrTyrLeuSerAsnLys)LysProlieLeuLeu465470475480gaaacagatcaagtagaaggaaaatacgccataaaggataccaatggg1488GluThrAspGinValGluGlyLysTyrAlalieLysAspThrAsnGly485490495aatattacaatagetggagattggaatggtataacagatgaaatttct1536AsnlieThrlieAlaGlyAspTrpAsnGlylieThrAspGlulieSer500505510getaaaacggcctctattattgtagataatggaaatcaaatgteagaa1584AlaLysThrAlaSerlielieValAspAsnGlyAsnGinMetSerGlu515520525aagagagttgcagcgaaggattatacaaatccagaggataaaactcct1632LysArgValAlaAlaLysAspTyrThrAsnProGluAspLysThrPro530535540aatttatctgtaaaagaagetetaaagttagettatccagatgaaatt1680AsnLeuSerValLysGluAlaLeuLysLeuAlaTyrProAspGlulie545550555560gagg犯aaagatggtttattattttataatgacc犯cctatttttgaa1728GluGl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pTyrTyrThr595600605TyrValValAsnGlyGlyAsnThrGlyLysLysGinTyrArgSerAla610615620AsnLysGlyAlaPheThrGluLeuSerThrGluSerLysAsnLysLeu625630635640LysLysAsnlieAspTyrTyrValSerLeuTyrMetLysAlaAspSer645650655」ysValSerValAsplieGlulieAspGlyLysGinGluSerlieVal660665670ThrAspAsnr]eThrLeuAspHisValGlyTyrGinArglieAsnlie675680685LeuValProAsnLeuGluGlyAsnGlulieAsnThrlieSerlieLys690695700GlyAspGlyGinThrAsnValTyrTrpAspAspValSerPheValGlu705710715720Val.GlyAlaGluGlulieGluTyrLysAspProValProGinPheAsp725730735lielieGluGlyAspPheAspPhePheGlyAspProLeuAlaValLys740745750TyrHisAspAlaThrTyrPhelieAspSerProLeulieThrGinThr755760765ProGlyThrPheSerPheThrTyrLysVallieGlyGluGinThrLys770775780ThrVa]LeuAspSerGlySerGlyLysAsnAlaAsnArglieAsnLeu785790795800AspPheLysAsnValLysSerAspArgSerPheLeuTyrThrLeuSer805810815CysLysAspAspLeuTrpGlySerThrArgThrAlaValValArglie820825830PheAlaValAsp83579权利要求1.由SEQIDNo.4的氨基酸序列组成的蛋白质、或通过在所述序列中添加、缺失或置换一个或几个氨基酸而自其衍生的蛋白质、或由在严谨杂交条件下与SEQIDNo.3或7的DNA序列杂交的DNA编码的蛋白质，其中所述蛋白质或所述衍生的蛋白质当与SEQIDNo.2中氨基酸位置38至氨基酸位置871所示的蛋白组合被玉米根叶甲幼虫摄入后能够将所述昆虫杀死。2.权利要求1的蛋白质，其由SEQIDNo.4中从第51位到449或457位的氨基酸序列组成。3.如权利要求1所述的蛋白质，其由SEQIDNo.4或SEQIDNo.8的氨基酸序列组成。4.编码权利要求1至3中任意一项的蛋白质的DNA序列，或在严谨杂交条件下与所述DNA序列中任一项杂交的DNA，其中所述杂交的DMA编码当与SEQIDNo.2中氨基酸位置38至氨基酸位置871所示的蛋白组合被玉米根叶甲幼虫摄入后对所述幼虫具有杀昆虫作用的蛋白质。5.如权利要求4所述的DNA，其包含人工的DNA序列，该人工DNA6.嵌合基因，其包含权利要求4或5所述的DNA和可在植物中表达的启动子区域。7.如权利要求6所述的嵌合基因，其中所述的启动子区域优先在根组织中具有活性。8.如权利要求7所述的嵌合基因，其中所述的启动子包括SEQIDNo.5或6的DNA序列或能在严谨条件下与其杂交的DNA。9.如权利要求6所述的嵌合基因，其中所述的嵌合基因还包含用于向细胞外分泌或靶向细胞器的信号肽。10.如权利要求9所述的嵌合基因，其中所述的信号肽是叶绿体转运肽。11.植物细胞，其包含嵌合基因，所述的嵌合基因选自权利要求6至10中任意一项所述的嵌合基因。12.植物细胞，其经转化而含有选自权利要求6至10中任意一项所述的嵌合基因的嵌合基因和下迷嵌合基因所述嵌合基因包含编码下述蛋白质的DNA，所述蛋白质为由SEQIDNo.2的#^酸序列组成的蛋白质、或通过在所述序列中添加、缺失或置换一个或几个氨基酸而自其衍生的蛋白质、或由在严谨杂交条件下与SEQIDNo.1或9的DNA序列杂交的DNA编码的蛋白质，并且其中所述蛋白质当与SEQIDNo.4中氨基酸位置51至氨基酸位置457所示蛋白组合被玉米根叶甲幼虫摄入后能够将所述昆虫杀死。13.植物细胞，其经转化而产生权利要求1至3中任意一项所述的蛋白和下述蛋白质，其中所述蛋白质为由SEQIDNo.2的>#^酸序列组成的蛋白质、或通过在所述序列中添加、缺失或置换一个或几个氨基酸而自其衍生的蛋白质、或由在严谨杂交条件下与SEQIDNo.1或9的DNA序列杂交的DNA编码的蛋白质，并且其中所述蛋白质当与SEQIDNo.4中氨基酸位置51至氨基酸位置457所示蛋白组合被玉米根叶曱幼虫摄入后能够将所述昆虫杀死。14.植物或种子在控制玉米根叶甲中的用途，其中所述植物或种子包含整合到其细胞中的嵌合基因，其中所述的嵌合基因选自权利要求6至10中任意一项所述的嵌合基因。15.如权利要求14所述的用途，其中所述植物或种子是玉米植物或种子。16.微生物，其经转化而含有权利要求4或5所述的DNA。17.赋予植物鞘翅目昆虫抗性的方法，其包括用第一嵌合基因和第二嵌合基因转化植物细胞，和由所述的抗昆虫性细胞再生转化植物，其中所述的第一嵌合基因选自权利要求6至10中任意一项所述的嵌合基因；并且所述的第二嵌合基因是包含编码下述蛋白质的DNA的嵌合基因，其中所述蛋白质为由SEQIDNo.2的氨基酸序列组成的蛋白质、或通过在所述序列中添加、缺失或置换一个或几个氨基酸而自其衍生的蛋白质、或由在严谨杂交条件下与SEQIDNo.1或9的DNA序列杂交的DNA编码的蛋白质，并且其中所述蛋白质当与SEQIDNo.4中氨基酸位置51至M酸位置457所示蛋白组合被玉米根叶甲幼虫才聂入后能够将所述昆虫杀死。18.控制鞘翅目昆虫病虫害的方法，其包括在田地里种植、播种或栽培经第一嵌合基因和第二嵌合基因转化的植物，其中所述的第一嵌合基因选自权利要求6至10中任意一项所述的嵌合基因；并且所述的第二嵌合基因是包含编码下述蛋白质的DNA的嵌合基因，其中所述蛋白质为由SEQIDNo.2的氨基酸序列组成的蛋白质、或通过在所述序列中添加、缺失或置换一个或几个氨基酸而自其衍生的蛋白质、或由在严谨杂交条件下与SEQIDNo.1或9的DNA序列杂交的DNA编码的蛋白质，并且其中所述蛋白质当与SEQIDNo.4中氨基^列51至^J^酸位置457所示蛋白组合被玉米根叶甲幼虫摄入后能够将所述昆虫杀死。19.如权利要求18所述的方法，其中所述的植物是玉米。20.如权利要求17至19中任意一项所述的方法，其中所述的昆虫选自根虫，象甲，马铃薯甲虫，叶曱，花象属种，马铃薯叶甲属种，杨树莹叶曱，紫苜蓿叶象，埃及苜蓿叶象，Haltkatombacina，墨西哥棉铃象，黄粉虫，赤拟谷盗，水稻铁曱，Trichispaserica，水稻负泥虫，葡萄肖叶曱，稻水象甲，萝卜茱跳曱，黄曲条茱跳甲，忽布跳甲，美洲油菜叶甲，油菜露尾甲，龟象属种，油菜金头跳曱，豌豆细紋跳甲，马铃薯叶甲，黄瓜十一星叶甲亚种，黄瓜十一星叶甲食根亚种，Diabroticabarberi和玉米才艮叶曱。21.杀昆虫组合物，其包含作为组合制剂用以同时、分开或连续使用以保护玉米植物不受玉米根虫侵害的权利要求1至3中任意一项所述的蛋白和另一下述蛋白质，其中所述另一蛋白质为由SEQIDNo.2的氨基^列组成的蛋白质、或通过在所述序列中添加、缺失或置换一个或几个氨基酸而自其f汴生的蛋白质、或由在严谨杂交条件下与SEQIDNo.l或9的l)NA序列杂交的DNA编码的蛋白质，并且其中所述蛋白质当与SEQIDNo.4中氨基酸位置51至氨基酸位置457所示蛋白组合被玉米根叶甲幼虫摄入后能够将所述昆虫杀死。全文摘要本发明分离了细菌杀昆虫蛋白及其等价物。这些蛋白和编码所述蛋白的DNA序列可用于制备杀昆虫组合物或转基因植物，以保护植物不受昆虫尤其是鞘翅目昆虫的损害。文档编号A01H5/00GK101591380SQ20091013827公开日2009年12月2日申请日期2001年5月17日优先权日2000年5月18日发明者A·伯特斯,G·阿尔诺,J·万瑞,N·达默申请人:拜尔生物科学公司