Axmi440毒素基因及其使用方法
【专利说明】AXM1440毒轰基因及其使用方法 发明领域
[0001] 本发明设及分子生物学领域。提供了编码杀有害生物蛋白的新颖的基因。运些蛋 白和编码它们的核酸序列在制备杀有害生物配制品中W及在生产转基因抗有害生物植物 中是有用的。
[0002] 发明背景
[0003] 苏云金芽抱杆菌是革兰氏阳性产芽抱±壤细菌，其特征在于其产生晶状内含体的 能力，所述晶状内含体特异性地对于昆虫的某些目和种具有毒性，但对于植物和其他非祀 生物是无害的。因此，包括苏云金芽抱杆菌菌株或它们的杀昆虫蛋白质的组合物可用作环 境上可接受的杀昆虫剂W用于控制农业昆虫有害生物或者各种人或动物疾病的昆虫媒介。
[0004] 来自苏云金芽抱杆菌的晶体(化y)蛋白（S-内毒素)具有主要针对鱗翅目、半翅目、 双翅目、W及銷翅目幼虫的有效的杀昆虫活性。运些蛋白还已经显示针对膜翅目、同翅目、 風目、食毛目、W及婢蛾亚纲有害生物目（Acari pest order)、连同其他无脊椎动物目（如 线虫动物口、扁形动物口、W及原生动物口肉鞭毛虫亚口）的活性（费特逊（Feitelson) (1993)苏云金芽抱杆菌家族树(The Bacillus Hiuringiensis family tree).先进的工程 杀有害生物剂（Advanced Engineered Pesticides),马塞尔稱德克尔格式（Marcel Dekker，Inc.)，纽约，纽约州(N.Y.))。运些蛋白最初主要基于它们的杀昆虫活性而分类为 CryI至Cr^。运些主要的类别是鱗翅类特异的（I)、鱗翅类与双翅目特异的（II)、銷翅目特 异的（111)、双翅目特异的（IV)、W及线虫特异的(V)与(VI)。运些蛋白质进一步分类成亚家 族;在每个家族内更高度相关的蛋白质被指定了分组字母例如化y IAXry IB、化y IC等等。在 每个分组内更加密切相关的蛋白质被给予诸如化ylCl、化ylC2等的名称。
[000引基于氨基酸序列同源性而不是昆虫祀标特异性描述了 C巧基因的命名法(克里克 莫尔(Crickmore)等人（1998)微生物学与分子生物学评论(Microbiol .Mol .Biol .Rev. )62: 807-813)。在此分类中，每种毒素被指定了独特的名称，其中包括第一级（prima巧rank) (阿拉伯数字）、第二级（secondaiT rank)(大写字母）、第S级（tertiary rank)(小写字 母）、W及第四级(quaternary rank)(另一个阿拉伯数字）。在第一级中，罗马数字已被换成 阿拉伯数字。具有低于45%的序列一致性的蛋白质具有不同的第一级，第二和第=级的标 准分别为78 %和95 %。
[0006] 晶体蛋白不展示杀昆虫活性，直至其被摄取并溶解在昆虫中肠之中。被摄取的原 毒素在昆虫消化道中被蛋白酶水解成活性毒性分子。（H別'te和怀特利(Whiteley)(1989)微 生物学评论(Microbiol. Rev. )53:242-255)。运种毒素与祀幼虫的中肠中的顶端刷状缘受 体结合并插入顶端膜中，产生离子通道或孔，从而导致幼虫死亡。
[0007] S-内毒素通常具有五个保守的序列结构域和S个保守的结构性结构域(参见，例 如戴马格德(de Maagd)等人(2001)遗传学趋势17:193-199)。第一个保守的结构性结构域 由7个a螺旋组成并且参与膜插入和孔形成。结构域II由排列成希腊钥匙构型的=个0片层 组成并且结构域HI由"果冻卷"结构中的两个反向平行的0片层组成(de Maagd等人，2001， 上文）。结构域II和HI参与受体识别和结合，并且因此被认为是毒素特异性的决定簇。
[0008] 由于昆虫可能带来破坏、W及通过控制昆虫有害生物在产量方面的改进，对于发 现新形式的杀有害生物毒素存在着不断的需要。
[0009] 发明概述
[0010] 在此提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织W及种子杀有害生物活性的组合 物和方法。组合物包括针对杀有害生物的和杀昆虫的多肤的核酸分子编码序列、包括那些 核酸分子的载体、W及包括运些载体的宿主细胞。组合物还包括运些杀有害生物多肤序列 W及针对那些多肤的抗体。运些核巧酸序列可W用在DNA构建体或表达盒中，W用于在多种 生物(包括微生物和植物）中进行转化和表达。运些核巧酸或氨基酸序列可W是合成序列， 运些合成序列已经被设计为用于在一种生物中表达，该生物包括但不局限于：一种微生物 或一种植物。组合物还包括含有本发明的核巧酸序列的细菌、植物、植物细胞、组织、W及种 子。
[0011] 具体地说，提供了编码一种杀有害生物蛋白的分离的或重组的核酸分子。另外，涵 盖了与运些杀有害生物蛋白相应的氨基酸序列。具体地，本发明提供了一种分离或重组的 核酸分子，该核酸分子包括编码SEQ ID N0:3-6中所示的氨基酸序列的核巧酸序列、或在 SEQ ID N0:1或2中列出的核巧酸序列、W及它们的生物活性变体和片段。还涵盖了与本发 明的一个核巧酸序列互补的核巧酸序列、或与本发明的一个序列或其互补物杂交的核巧酸 序列。另外还提供了包括本发明的核巧酸序列或者编码本发明的氨基酸序列的核巧酸序列 W及它们的生物活性变体和片段的载体、宿主细胞、植物W及种子。
[0012] 提供了用于产生本发明的多肤的方法、W及用于使用运些多肤来控制或杀死鱗翅 目、半翅目、銷翅目、线虫、或双翅目有害生物的方法。还包括用于检测在样品中的本发明的 运些核酸和多肤的方法和试剂盒。
[0013] 本发明的运些组合物和方法用于产生具有增强的有害生物抗性或耐受性的生物。 运些生物W及包括运些生物的组合物对于农业目的是所希望的。本发明的组合物还用于产 生具有杀有害生物活性的改变的或改进的蛋白、或检测在产物或生物中的杀有害生物蛋白 或核酸的存在。
[0014] 详细说明
[0015] 本发明描绘了用于调节生物(特别是植物或植物细胞）中的有害生物抗性或耐受 性的组合物和方法。"抗性"是指该有害生物(例如，昆虫化摄取或W其他方式接触本发明 的多肤类之后被杀死。"耐受性"是指该有害生物的运动、摄食、繁殖、或其他功能的损害或 降低。运些方法设及用编码本发明的一种杀有害生物蛋白的核巧酸序列来转化生物。具体 地说，本发明的核巧酸序列用于制备具有杀有害生物活性的植物和微生物。因此，提供了转 化的细菌、植物、植物细胞、植物组织W及种子。组合物是杆菌或其他物种的杀有害生物核 酸和蛋白质。运些序列用于随后转化到感兴趣的生物中的表达载体的构建，作为用于其他 同源(或部分同源的）基因的分离的探针，W及用于通过本领域中已知的方法(如，结构域交 换或DNA改组)来产生改变的杀有害生物蛋白，例如内毒素的化yl、Cry2W及化y9家族成员。 运些蛋白用于控制或杀死鱗翅目、半翅目、銷翅目、双翅目、W及线虫有害生物种群、W及用 于生产具有杀有害生物活性的组合物。
[0016] 关于"杀有害生物毒素"或"杀有害生物蛋白"是指一种毒素，该毒素具有针对一种 或多种有害生物的毒性，包括但不局限于:鱗翅目、双翅目、半翅目W及銷翅目、或线虫动物 口成员、或者与运种蛋白质具有同源性的一种蛋白质。已经从生物中分离出杀有害生物蛋 白，运些生物包括例如，芽抱杆菌、双酶梭菌、W及日本甲虫类芽抱杆菌（Paenibacillus popilliae)。杀有害生物蛋白包括从在此披露的全长核巧酸序列中推导出的氨基酸序列、 W及比运些全长序列更短的氨基酸序列（或者由于使用了一个可替代的下游起始位点、或 者由于产生一个较短的具有杀有害生物活性的蛋白的加工过程）。加工可W在表达该蛋白 的生物内发生，或在该有害生物摄取该蛋白之后发生。
[0017]因此，在此提供了新颖的分离或重组的核巧酸序列，运些序列赋予了杀有害生物 活性。运些核巧酸序列编码与已知的S-内毒素或二元毒素具有同源性的多肤。还提供了杀 有害生物蛋白的氨基酸序列。由运种基因的翻译而产生的蛋白允许细胞控制或杀死摄取了 该蛋白的有害生物。
[001引分离的核酸分子、W及它们的变体和片段
[0019] 本发明的一个方面设及分离的或重组的核酸分子，运些核酸分子包括编码杀有害 生物蛋白和多肤或它们的生物活性部分的核巧酸序列；W及足W用作杂交探针来鉴定编码 具有序列同源性的区域的蛋白质的核酸分子的核酸分子。在此还涵盖了能够在如在此的其 他部分所定义的严格条件下与本发明的核巧酸序列杂交的核巧酸序列。如在此所使用的， 术语"核酸分子"旨在包括DNA分子（例如，重组DNA、CDNA或基因组DNA)和RNA分子（例如， mRNA似及使用核巧酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。运种核酸分子可W是单链或双链 的，但优选是双链DNA。
[0020] "分离的"或"重组的"核酸序列（或DNA)被用在此处是指一种核酸序列（或DNA)，该 核酸序列(或DNA)不再存在于它的自然环境中（例如，在体外或在重组细菌或植物宿主细胞 中）。在一些实施例中，一种分离的或重组的核酸是不含有在衍生出该核酸的生物的基因组 DNA中天然地位于该核酸侧翼的序列（即，位于该核酸的5'和3'末端的序列）（优选编码蛋白 质的序列）。出于本发明的目的，"分离的"当用于指核酸分子时不包括分离的染色体。例如， 在不同实施例中，编码S-内毒素的分离的核酸分子可W包含小于约化b、4kb、3kb、、化b、 0.5化或0.化b的核巧酸序列，运些核巧酸序列天然地侧翼于衍生出该核酸的细胞的基因组 DNA中的核酸分子。在不同的实施例中，基本上不含有细胞物质的一种S内毒素蛋白包括具 有少于约30%、20%、10%或5 % (按干重计）的非S内毒素蛋白（在此也被称为"污染蛋白 质"）的蛋白质制剂。在一些实施例中，本发明的重组核酸相对于SEQ ID NO: 1，或其变体或 片段包含一个或多个核巧酸置换。
[0021] 编码本发明的运些蛋白质的核巧酸序列包括SEQ ID NO: 1或2中列出的序列W及 它们的变体、片段W及互补物。关于"互补物"是指与给定的核巧酸序列足够地互补使得它 可W与该给定的核巧酸序列杂交由此形成一个稳定的双链体的核巧酸序列。对于由运些核 巧酸序列所编码的杀有害生物蛋白的相应氨基酸序列在SEQ ID NO: 3-6中列出。
[0022] 本发明还涵盖了 W下核酸分子，运些核酸分子是运些编码杀有害生物蛋白的核巧 酸序列的片段。关于"片段"是指编码一种杀有害生物蛋白的核巧酸序列的一个部分。核巧 酸序列的一个片段可W编码杀有害生物蛋白的生物活性部分，或者它可W是使用W下披露 的方法可W用作一种杂交探针或PCR引物的一个片段。作为编码杀有害生物蛋白的一个核 巧酸序列片段的核酸分子包括至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、 1100、1200、1300、1350、1400个连续核巧酸，或达到在此披露的一种全长的编码杀有害生物 蛋白的核巧酸序列中存在的核巧酸的数目，运取决于所预期的用途。关于"连续的"核巧酸 旨在指彼此邻近的核巧酸残基。本发明的核巧酸序列的片段将编码保留杀有害生物蛋白的 生物活性、并且因此保留杀有害生物活性的蛋白质片段。因此，还涵盖了在此披露的多肤的 生物活性片段。关于"保留活性"是指该片段将具有至少约30%、至少约50%、至少约70%、 80%、90%、95%或更高的该杀有害生物蛋白的杀有害生物活性。在一个实施例中，该杀有 害生物活性是杀銷翅目活性。在另一个实施例中，该杀有害生物活性是杀鱗翅目活性。在另 一个实施例中，该杀有害生物活性是杀线虫活性。在另一个实施例中，该杀有害生物活性是 杀双翅目活性。在另一个实施例中，该杀有害生物活性是杀半翅目活性。用于测量杀有害生 物活性的方法在本领域是熟知的。参见例如查普拉(Czapla)和朗化ang)(1990)经济昆虫学 杂志（J.Econ.化tomol. )83:2480-2485;安德鲁斯（Andrews)等人（1988)生物化学杂志 (Biochem.J. )252:199-206;马罗内（Marrone)等人（1985)经济昆虫学杂志（J.Of Economic 化tomology)78: 290-293; W及美国专利号5，743，477，所有运些文献都通过引用W其全文 结合在此。
[0023] 编码本发明的蛋白质的生物活性部分的编码杀有害生物蛋白的核巧酸序列片段 将编码至少约 15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450个连续氨基 酸，或达到在本发明的全长杀有害生物蛋白中存在的氨基酸的总数目。在一些实施例中，该 片段是蛋白酶切片段。例如，蛋白酶切片段可W相对于SEQ ID N0:3-6具有至少约100个氨 基酸、约120个、约130个、约140个、约150个、或约160个氨基酸的N末端或C末端截短。在一些 实施例中，在此所涵盖的运些片段是由例如通过蛋白酶解或通过在编码序列中插入终止密 码子来除去C末端结晶结构域而产生。
[0024] 本发明的优选杀有害生物蛋白是通过与SEQ ID NO: 1或2的核巧酸序列足够地一 致的核巧酸序列编码的，或者运些杀有害生物蛋白是与SEQ ID N0:3-6中所列出的氨基酸 序列足够地一致的。关于"足够地一致"是指使用标准参数、使用在此所描述的比对程序之 一，一种氨基酸或核巧酸序列与参考序列相比较具有至少约60%或65%序列一致性、约 70%或75%序列一致性、约80%或85%序列一致性、约90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或更高的序列一致性。本领域的普通技术人员将会认识到，可W对运 些数值进行适当地调整W便通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位、等等来确 定由两个核巧酸序列编码的蛋白质的相应一致性。
[0025] 为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的一致性百分比，针对最佳比较目的而比对 运些序列。运两个序列之间的一致性百分比是由运些序列共有的相同位置的数目的函数 (即，一致性百分比二相同位置的数目/位置(例如，重叠位置)的总数目X 100)。在一个实施 例中，运两个序列是相同长度的。在另一个实施例中，该一致性百分比是贯穿参考序列（即， 在此披露的如SEQ ID NO: 1-6中任一项的序列）的整体来计算的。在两个序列之间的一致性 百分比可W使用与W下说明的那些相似的技术来确定，其中允许或不允许空位。在计算一 致性百分比中，对典型地准确的匹配进行计数。空位，即，比对中在一个序列中存在残基而 在另一个序列中不存在的位置，其被视为具有不一致残基的位置。
[0026] 两个序列之间的一致性百分比的确定可W通过使用数学算法来完成。用于两个序 列的比较的数学算法的一个非限制性实例是卡尔林化arl in)和阿尔丘尔（Altschul) (1990)美国国家科学院院刊（Proc.化tl. Acad. Sci. USA)87:2264的算法，它在卡尔林和阿 尔丘尔（1993)美国国家科学院院刊90:5873-5877中进行了修改。运种算法被结合到阿尔丘 尔(Altschul)等人（1990)分子生物学杂志（J.Mol.Biol. )215:403 的 BLASTN 和 BLASTX 程序 中。BLAST核巧酸捜索可W用BLASTN程序(得分=100、字长=12)来进行，W获得与本发明的 杀有害生物样核酸分子同源的核巧酸序列。BLAST蛋白质捜索可W用化ASTX程序(得分= 50、字长=3)来进行，W获得与本发明的杀有害生物蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得 用于比较目标的有缺口的比对，可W利用如在阿尔丘尔等人（1997)核酸研究（Nucleic Acids Res. )25: 3389)中所述的有缺口的化AST(BLAST 2.0中）。可替代地，可W使用PSI-Blast进行迭代捜索，该迭代捜索检测分子之间的远近关系。参见阿尔丘尔(Altschul)等人 (1997)同上。当利用化AST、空位化AST和PSI-Blast程序时，可W使用对应的程序（例如， BLASTX和BLASTN)的默认参数。还可W通过检查，手动进行比对。
[0027]用于序列比较的一种数学算法的另一个非限制实例是ClustalW算法（希金斯 化iggins)等人（1994)核酸研究（Nucleic Acids Res.)22:4673-4680))<Xlus化IW比较了 序列并且比对了该氨基酸或DNA序列的整体，并且因此可W提供有关整个氨基酸序列的序 列保守性的数据。ClustalW算法用于几个可商购的DNA/氨基酸分析软件包，如Vector NTI Program Suite的ALIGNX模块（英杰公司（Invitrogen Corporation),卡尔斯己德 (化rlsbad)，加利福尼亚(CA))。用ClustalW进行氨基酸序列比对之后，可W估算出氨基酸 一致性百分数。用于ClustalW比对分析的软件程序的另一个非限制性实例是GE肥D0C?。 GE肥D0C?(卡尔稱尼古拉斯公司化arl Nicholas))允许在多个蛋白质之间评估氨基酸(或 DNA)相似性和一致性。用于比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是迈尔斯(Myers) 和米勒(Miller)(1988)生物科学中的计算机应用(CABI0S)4:11-17的算法。运种算法被结 合到ALIGN程序(版本2.0)中，该程序是GCG威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)(版本10)(可商购自阿塞勒德公司（Accebys , Inc.)，斯克兰顿路9685 号（9685 Scranton Rd.),圣地亚哥（San Diego),加利福尼亚州，美国）的一部分。当利用 ALIGN程序来比较多个氨基酸序列时，可W使用一个PAM120权重残基表、空位长度罚分12、 W及空位罚分4。
[002引除非另有说明，GAP版本10(它采用了尼德尔曼（Needleman)和翁施（Wunsch) (1970)分子生物学杂志(J.Mol.Biol. )48(3) :443-453的算法)将使用W下参数用于测定序 列一致性或相似性:对于核巧酸序列的一致性％ W及相似性％，使用GAP权重50和长度权重 3, W及nwsgapdna.cmp评分矩阵;对于氨基酸序列的一致性％ W及相似性％，使用GAP权重8 和长度权重2W及化0SUM62评分程序。还可W使用等效程序。关于"等效程序"是指W下任何 序列比较程序，该程序针对所研究的任何两个序列、当与由GAP版本10所产生的相应比对相 比时产生一个比对，该比对具有相同