专利名称：将鬼臼毒素转化为鬼臼酸和鬼臼苦素的方法
技术领域：
本发明涉及鬼臼类木脂素的制备方法，尤其涉及一种将鬼臼毒素转化为鬼臼酸 和鬼臼苦素的方法，本发明还涉及从生物转化基质中分离鬼臼酸和鬼臼苦素的方 法，属于生物制药领域。
背景技术：
鬼臼毒素(Pod叩hyllotoxin)是从鬼臼类植物中分离得到的一种具有抗肿瘤作用 的天然活性先导化合物，分子结构独特，具有四个手性中心、 一个反式内酯环和C-1 位轴向相接的芳基取代基团。鬼臼毒素通过破坏正在进行有丝分裂细胞中的微管蛋 白集结及微管的形成，使细胞有丝分裂停止在M期，抑制肺瘤细胞正常分裂，发挥 抗肿瘤作用，但其具有强烈的毒副作用，如水溶性差、生物利用度低等，限制了其 在临床上的应用。
鬼臼毒素(Podophy llotoxin)
国内外学者从上世纪三十年代开始陆续开展了鬼臼毒素的化学转化研究，部分 学者利用化学方法修饰鬼臼毒素得到鬼臼酸和鬼臼苦素，其方法如下
1、 Borsche于1932年以鬼臼毒素为底物，分别合成鬼臼酸和鬼臼苦素，反应 路线见图1。
42、 德国蒂宾根大学Auterhoff于1958年以鬼臼毒素为底物，化学合成鬼臼酸和 鬼臼苦素，反应路线见图2。
3、 Sandoz公司(NL 6405480)于1964年以鬼臼毒素为底物，化学合成了鬼臼酸 和鬼臼苦素，收率分别为3.93%和3.87%,反应^各线见图3。
化学转化反应存在产物收率较低、易造成环境污染等缺点。与化学转化相比， 生物转化具有高选择性、高效性、环境友好等优点， 一方面降低了过程的复杂性， 同时提高产物收率，减少对环境的污染。
国内外学者对鬼臼毒素的生物转化作了初步探索。英国诺丁汉大学Broomhead 等发现美国金钟连翘悬浮培养细胞具有将鬼臼毒素氧化为鬼臼毒酮的能力，同时产 生少量的鬼臼苦酮。澳大利亚墨尔本大学Teng等以大麦悬浮培养细胞转化鬼臼毒 素得到异鬼臼苦酮。北京大学果德安教授分别于1998年和2005年利用青霉菌和掌 叶大黄细胞转化鬼臼毒素，得到鬼臼苦素，反应路线见图4。迄今为止，国内外尚 没有利用生物转化方法制备鬼臼酸的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有制备鬼臼类木脂素化合物方法中所存 在的产物收率低、易污染环境等问题，提供一种新的制备鬼臼酸和鬼臼苦素的生物 转化及分离方法，该方法以鬼臼毒素作为反应底物，通过生物转化得到鬼臼酸和鬼 臼苦素，本发明方法操作简便、产物得率高、环境友好、生产成本低。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的
一种将鬼臼毒素转化为鬼臼酸和鬼臼苦素的方法，包括
在微生物铜绿假单胞菌(尸wwctomo"M flen^/"asa)、芽孢杆菌CSac〃/w ^.)、红串 红球菌(7 /zoc/occ)ccwj1 e^^/zrapofe)、氺麦状芽孑包杆菌(5ac/〃w yks7》m^)、 北京才奉杆菌 (Cor_yweZ>fl"en'wm / eh'"e"ese)、 4古草才干菌C6ac/〃ws sw6"fo)、 p笪夏孑包欧文氏菌CEnWm'a wefifovora)或弯曲假单胞菌(尸wwctowowas ge"/cw/a加)的发酵过程中，将底物鬼臼毒素 溶液加入到任何一种微生物发酵体系中进行生物转化反应，得到含有鬼臼酸和鬼臼 苦素的生物转化基质。
所述的铜绿假单胞菌、芽孢杆菌、红串红球菌、梭状芽孢杆菌、北京棒杆菌、 枯草杆菌、噬夏孢欧文氏菌、弯曲假单胞菌可以通过各种商业途径购买得到，例如 铜绿假单胞菌可以购自于中国典型培养物保藏中心，其编号为CCTCC AB93066;所述的铜绿假单胞菌、芽孢杆菌、红串红球菌、梭状芽孢杆菌、北京棒杆菌、 枯草杆菌、噬夏孢欧文氏菌或弯曲假单胞菌的培养过程可以参照各种常规培养方 法，包括斜面菌种培养、液体种子培养、发酵培养，其中，所用到各种培养基以及 培养条件都是本领域的常规培养基和培养条件，这些都为本领域技术人员所通晓。
优选的，所述的铜绿假单胞菌培养过程如下
(1) 斜面菌种培养培养基葡萄糖2%,牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%,氯化 钠0.5%,琼脂2%, pH值为7 (各组分的含量均为重量体积百分比，即克/100毫升， 下同)，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、制成斜面，接种铜绿假单胞菌菌种， 37摄氏度培养4小时；
(2) 液体种子培养培养基酵母粉0.5%,蛋白胨0.5%,氯化钠0.5%，蔗 糖1%, pH值为7，装液量50毫升/250毫升摇并瓦，115 4聂氏度灭菌30分钟，灭菌 后冷却、接种斜面菌种，37摄氏度，200转/分钟培养3小时，作为液体种子；
(3) 发酵培养培养基酵母粉0.5%,蛋白胨0.5%,氯化钠0.5%，蔗糖1%， pH值为7，装液量50毫升/250毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却， 接种液体种子，接种量10%, 37摄氏度，200转/分钟培养3小时。
优选的，所述的红串红J求菌培养过程如下
(1) 斜面菌种培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，琼 月旨1.5%， pH值为7， 115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、制成斜面，接种红串 红球菌菌种，30摄氏度培养12小时；
(2) 液体种子培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨1.0%,氯化钠0.5%, pH 值为7,装液量50毫升/250毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却，接 种斜面菌种，30摄氏度，180转/分钟培养10小时，作为液体种子；
(3) 发酵培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%, pH值为 7，装液量50毫升/250毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却，接种液体 种子，接种量10%, 30 4聂氏度，180转/分钟培养10小时。
优选的，所述的北京棒杆菌培养过程如下
(1) 斜面菌种培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5%,氯化钠0.5%,琼 月旨2.0%， pH值为7， 115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、制成斜面，接种北京 棒杆菌菌种，28摄氏度培养12小时;
(2) 液体种子培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5%,氯化钠0.5%， pH 值为7,装液量200毫升/500毫升摇瓶，U5摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接
6种斜面菌种，28摄氏度、140转/分钟培养12小时，作为液体种子；
(3)发酵培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5°/。，氯化钠0.5%, pH值为 7,装液量200毫升/500毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接种液 体种子，接种量10%, 28摄氏度、140转/分钟培养12小时。
所述的鬼臼毒素溶液用无水乙醇配制，其浓度优选为每毫升无水乙醇含有 2.5-20毫克的鬼臼毒素，更优选为每毫升无水乙醇含有5.0毫克的鬼臼毒素。
为了达到更好的生物转化效果，所述的生物转化反应优选按照以下条件进行 将底物鬼臼毒素溶液添加到微生物发酵体系中至其终浓度为20-1000微克/毫升，生 物转化反应温度为20-45摄氏度，转化反应时间为3-200小时，转速为50-350转/ 分钟。
本发明一个特别优选的技术方案将鬼臼毒素溶液添加到微生物发酵体系中至 其终浓度为卯微克/毫升，生物转化反应温度为37摄氏度，转速为200转/分钟， 生物转化时间为20小时。
本发明首次利用铜绿假单胞菌、芽孢杆菌、红串红球菌、梭状芽孢杆菌、北京 棒杆菌、枯草杆菌、噬夏孢欧文氏菌或弯曲假单胞菌转化鬼臼毒素，制备分离得到 鬼臼酸和鬼臼苦素，产物收率高、反应条件温和、操作简单。
将上述所得的生物转化基质进行高效液相色谙(HPLC)分析及薄层层析(TLC)测 定，结果表明，所得到的生物转化产物为鬼臼酸和鬼臼苦素的混合物。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种将鬼臼酸和鬼臼苦素从上述生
物转化基质中分离出来的方法。
本发明所要解决的另 一个技术问题是通过以下技术方案来实现的 一种从上述生物转化基质中分离鬼臼酸和鬼臼苦素的方法，包括 (1 )将生物转化基质离心后的上清液用大孔吸附树脂柱进行初分离，用乙醇
水溶液进行梯度洗脱，分段收集洗脱液；
(2) 将所收集的30%-40%乙醇洗脱液，以凝胶柱层析进行细分离，得到鬼臼
酸；
(3) 将所收集的60%-80%乙醇洗脱液，浓缩、过滤除去不溶性杂质，结晶得 鬼臼苦素。
优选的步骤(1)中所述的离心，优选的方法是将生物转化基质在5500转/ 分钟的转速下离心30分钟；所述的乙醇水溶液为10%-90%的乙醇水溶液；所述的大孔吸附树脂型号优选为D312， AB-8, S-8， ADS-7, YWD04C, YWDBC, DM130, MCA, 860021, DM-18;更优选为D312 (购自于山东鲁抗医药股份有限公司树脂 分厂，非极性，粒径0.315-1.25毫米，比表面积500-650平方米/克，平均孔径 10-20纳米)。
步骤(2 )中所述的凝胶柱优选为Sephadex LH-20凝胶柱。
本发明建立了一种由微生物转化制备鬼臼类木脂素化合物的新方法，本发明的 生物转化方法可以直接在铜绿假单胞菌、芽孢杆菌、红串红球菌、梭状芽孢杆菌、 北京棒杆菌、枯草杆菌、噬夏孢欧文氏菌或弯曲假单胞菌的发酵过程中添加鬼臼毒 素溶液进行生物转化，产物收率高，对底物鬼臼毒素的摩尔转化率可达70.2%。
本方法利用微生物转化对鬼臼毒素结构进行修饰，得到鬼臼酸和鬼臼苦素，底 物转化率高、操作简单；生物转化反应条件温和、产生的废弃物较少；生物转化产 物分离过程简单，且回收率高。
总之，本发明微生物转化法相对于传统的化学合成法具有以下优点1、操作 简便、产物得率高；2、反应条件温和、环境友好；3、分离方法简单，所用试剂毒 性低、费用低、节省成本。
图1 鬼臼酸和鬼臼苦素的化学转化路线图2鬼臼酸和鬼臼苦素的化学合成路线图3 鬼臼酸和鬼臼苦素的化学反应路线图4青霉菌、掌叶大黄细胞对鬼臼毒素的生物转化；
图5本发明鬼臼酸和鬼臼苦素的制备和分离流程图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本 领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方 案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
一、试验材料
铜绿假单胞菌，购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，其编号为CCTCC
8AB93066;芽孢杆菌，购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，其编号为CCTCC AB95018;红串红球菌，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其编号为CGMCC 1.2362;梭状芽孢杆菌，购自中国工业微生物菌种保藏中心，其编号为CICC 20463; 北京棒杆菌，购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，其编号为CCTCC AB97005;枯草杆菌，购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，其编号为CCTCC AB93174;噬夏孢欧文氏菌，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其编号为 CGMCC 1.1215;弯曲假单胞菌，购自中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，其编 号为CCTCCAB93074。
二、；险测方法
(1 )鬼臼毒素、鬼臼酸与鬼臼苦素的HPLC分析柱型号为Akasil C18 column (5微米，4.6毫米x250毫米)；流动相为0.05摩尔/升磷酸二氢钾-甲醇-乙腈 (52:32:16), pH值为3.00;流速为0.8毫升/分钟，紫外检测波长为230纳米，柱温 为40摄氏度。
(2)鬼臼毒素、鬼臼酸与鬼臼苦素的TLC分析硅胶G层析板(青岛海洋化工 有限公司)，将待测生物转化基质用乙酸乙酯萃取后静置分层，乙酸乙酯层浓缩挥干， 无水乙醇复溶，用毛细管在干燥的硅胶G层析板上点样，将层析板放入层析缸中层 析。展开剂为氯仿-乙酸乙酯-甲醇-冰乙酸(7:3:2:0.5)。石典蒸汽显色，呈现黄褐色 斑点。
实施例1
1、铜绿假单胞菌的培养
斜面菌种培养培养基葡萄糖2%,牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5%,氯化钠0.5%, 琼脂2%, pH值为7， 115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、制成斜面，接种铜绿 假单胞菌菌种，37摄氏度培养4小时；
液体种子培养培养基酵母粉0.5%,蛋白胨0.5%,氯化钠0.5%，蔗糖1%, pH值为7，装液量50毫升/250毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、 接种斜面菌种，37摄氏度，200转/分钟培养3小时，作为液体种子；
发酵培养培养基酵母粉0.5%,蛋白胨0.5%,氯化钠0.5%,蔗糖1%, pH 值为7，装液量50毫升/250毫升摇瓶，115摄氏逸灭菌30分钟，灭菌后冷却，接 种液体种子，接种量10%， 37摄氏度，200转/分钟培养3小时。
92、 生物转化
将鬼臼毒素用无水乙醇配制成浓度为每毫升乙醇含有5.0毫克鬼臼毒素的鬼臼
毒素溶液，将鬼臼毒素溶液加入到铜绿假单胞菌发酵体系中至其终浓度为90微克/ 毫升，在以下条件下进行生物转化反应温度37摄氏度，转速为200转/分钟，生 物转化时间为20小时，得到含有鬼臼苦素和鬼臼酸的生物转化基质，从该生物转 化基质中取样，HPLC测定得鬼臼毒素起始浓度为90微克/毫升，转化20小时后 生物转化基质中鬼臼毒素浓度为27微克/毫升，鬼臼毒素转化率为70%。
3、 生物转化基质中产物的分离纯化与结构鉴定
将上述生物转化基质5500转/分钟离心30分钟，弃去沉淀，上清液直接以D312 大孔吸附树脂柱(购自于山东鲁抗医药股份有限公司树脂分厂，非极性，粒径 0.315-1.25毫米，比表面积500-650平方米/克，平均孔径10-20纳米)吸附，以乙 醇-水(1:9至9:1)梯度洗脱，将60%-80%乙醇洗脱组分浓缩，过滤，得粗结晶，以无 水乙醇重结晶，得白色针状晶体，通过核磁共振(NMR)和质谱(ESI-MS)确定为鬼臼 苦素(C22H2208;丄H而R(300 MHz, CDC13): 57.12(1H， H-5), 6.57(2H， H-2', H-6) 6.19(1H, H-8), 5.91(2H， H-13), 4.63(1H， H-ll)， 4.49(1H， H國4)， 4.45(1H， H-ll)， 3.98(1H, H-l)， 3.84(9H, MeO-3', MeO-4', MeO-5')， 3.28(1H, H-2), 2.65(1H, H-3)。 13CNMR(300 MHz, CDC13): S178.92 (C-12), 153.07 (C-3，， C-5，)， 146.45 (C-6, C-7), 139.28 (C-l，), 136.37 CC-10), 133.50 (C-9)， 130.45 CC-4，)， 107.68 (C-8), 105.86 CC陽2'， C-6，)， 104.16 (C-5), 100.63 (C-13), 69.62 (C-4)， 67.62 (C-ll), 59.89 (MeO-4')， 55.30 (MeO-3', MeO-5'), 44.98 (C-2), 43.74 (C-l), 42.57 (C-3)。 ESI陽MS (m/z) 485.1(M'+H), 442.9, 292.7。元素分析(:22112208.1120:计算值C, 61.11。/。， H， 5.59%,实测值C, 61.85; H， 5.747 )。
将30%-40%乙醇洗脱组分浓縮挥干，曱醇复溶，过滤除去不溶性杂质，Sephadex LH-20凝胶(购自于北京慧德易科技有限责任公司，粒径20-150微米)柱层析分 离，曱醇洗脱，得白色不定形粉末，通过核^f兹共振(NMR)和质谱(ESI-MS)确定为鬼 臼酸(C22H2409, 顧R (300 MHz, CD3OD): S6.83(1H, H隱5), 6.54(2H， H-2'， H-6')， 6.24(1H， H-8)， 5.85(2H， H-13), 4.86(1H， H-4), 4.20(1H, H-l)， 3.76(6H, MeO-3'， MeO-5')， 3.73(3H， MeO-4')， 3.41(1H, H-11), 3.38(1H, H-11), 3.30(1H， H-2), 2.45(1H, H-3)。 13C NMR(300 MHz, CD3OD): S172.35 (C-12), 153.03 (C扁3'， C-5，)， 147.74 (C-6)， 146.60 (C-7)， 142.00 (C-l，)， 136.21 (C-IO)， 132.20 (C-9)， 129.93 (C-4，)， 109.18 (C-8)， 108.82 (C-5), 106.69 (C-2，， C-6，)， 101.08 (C-13)， 68.29 (C-4), 60.21 (C-ll), 59.90
10(MeO-4')， 55.35 (MeO-3', MeO-5'), 46.98 (C-2)， 45.34 (C-l)， 45.06 (C-3)。 ESI-MS (m/z) 431.1 (M、H)， 421.1， 387.1， 324.9, 283.0， 255.0 )。
实施例2
1、 芽孢杆菌的培养
斜面菌种培养培养基牛肉膏0.3%,酵母膏0.5%,蛋白胨0.5%,琼脂1.5%, pH值为7， 115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、制成斜面，接种芽孢杆菌菌种， 28摄氏度培养12小时;
液体种子培养培养基牛肉膏0.3%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%， pH值为7， 装液量50毫升/250毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接种斜面菌 种，28摄氏度、180转/分钟培养10小时，作为液体种子；
发酵培养培养基牛肉膏0.3%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%， pH值为7，装 液量50毫升/250毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接种液体种子， 接种量10%, 28摄氏度、180转/分钟培养10小时。
2、 生物转化
将鬼臼毒素用无水乙醇配制成浓度为每毫升乙醇含有5.0毫克鬼臼毒素的鬼臼 毒素溶液；将鬼臼毒素溶液加入到芽孢杆菌发酵体系中至其终浓度为172微克/毫 升，在以下条件下进行生物转化反应温度28摄氏度，转速为180转/分钟，生物 转化时间为20小时，得到含有鬼臼苦素和鬼臼酸的生物转化基质，从该生物转化 基质中取样，HPLC测定得鬼臼毒素起始浓度为172微克/毫升，转化20小时后 生物转化基质中鬼臼毒素浓度为75微克/毫升，鬼臼毒素转化率为56%。
3、 生物转化基质中产物的分离纯化与结构鉴定
采用与实施例l相同的分离纯化方法，从生物转化基质中得到白色针状晶体和 白色不定形粉末，通过核磁共振(NMR)和质谱(ESI-MS),白色针状晶体被确定为鬼 臼苦素；白色不定形粉末被确定为鬼臼酸(结构鉴定参数同实施例1 )。
实施例3
1、红串红球菌的培养
斜面菌种培养培养基牛肉青0.3%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%,琼脂1.5%, pH值为7, 115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、制成斜面，接种红串红球菌菌种， 30摄氏度培养12小时；
ii液体种子培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨1.0%,氯化钠0.5%, pH值为7， 装液量50毫升/250毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接种斜面菌 种，30摄氏度，180转/分钟培养10小时，作为液体种子；
发酵培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%, pH值为7，装 液量50毫升/250毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接种液体种子， 接种量10%, 30摄氏度，180转/分钟培养10小时。
2、 生物转化
将鬼臼毒素用无水乙醇配制成浓度为每毫升乙醇含有2.5毫克鬼臼毒素的鬼臼 毒素溶液，将鬼臼毒素溶液加入到红串红球菌发酵体系中至其终浓度为50微克/毫 升，在以下条件下进行生物转化反应温度30摄氏度，转速为180转/分钟，转化 反应时间为20小时，得到含有鬼臼苦素和鬼臼酸的生物转化基质，从该生物转化 基质中取样，HPLC测定得鬼臼毒素起始浓度为50微克/毫升，转化20小时后生 物转化基质中鬼臼毒素浓度为22微克/毫升，鬼臼毒素转化率为56.0%。
3、 生物转化基质中产物的分离纯化与结构鉴定
采用与实施例l相同的分离纯化方法，从生物转化基质中得到白色针状晶体和 白色不定形粉末，通过核磁共振(NMR)和质谱(ESI-MS),白色针状晶体被确定为鬼 臼苦素；白色不定形粉末被确定为鬼臼酸(结构鉴定参数同实施例1)。
实施例4
1、 梭状芽孢杆菌的培养
斜面菌种培养培养基牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%,琼脂2%, pH值为7， 115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、制成斜面，接种4炎状芽孢杆菌菌 种，37摄氏度培养12小时；
液体种子培养培养基牛肉膏0.30/0，蛋白胨0.5%,氯化钠0.5%, pH值为7， 装液量50毫升/250毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接种斜面菌 种，37摄氏度、180转/分钟培养6小时，作为液体种子；
发酵培养培养基牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%, pH值为7，装 液量50毫升/250毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接种液体种子， 接种量10%, 37摄氏度、180转/分钟培养6小时。
2、 生物转化
将鬼臼毒素用无水乙醇配制成浓度为每毫升乙醇含有5.0毫克鬼臼毒素的鬼臼
12毒素溶液；将鬼臼毒素溶液加入到梭状芽孢杆菌发酵体系中至其终浓度为46微克/ 毫升，在以下条件下进行生物转化反应温度37摄氏度，转速为180转/分钟，生 物转化时间为20小时，得到含有鬼臼苦素和鬼臼酸的生物转化基质，从该生物转 化基质中取样，HPLC测定得鬼臼毒素起始浓度为46微克/毫升，转化20小时后 生物转化基质中鬼臼毒素浓度为20微克/毫升，鬼臼毒素转化率为56%。 3、生物转化基质中产物的分离纯化与结构鉴定
采用与实施例l相同的分离纯化工艺，从生物转化基质中得到白色针状晶体和 白色不定形粉末，通过核磁共振(NMR)和质谱(ESI-MS),白色针状晶体被确定为鬼 臼苦素；白色不定形粉末被确定为鬼臼酸(结构鉴定参数同实施例1)。
实施例5
1、 北京棒杆菌的培养
斜面菌种培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨0.50/0，氯化钠0.5%,琼脂2.0%， pH值为7， 115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、制成斜面，接种北京棒杆菌菌种， 28摄氏度培养12小时;
液体种子培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5%,氯化钠0.5%, pH值为7， 装液量200毫升/500毫升摇瓶，U5摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接种斜面菌 种，28摄氏度、140转/分钟培养12小时，作为液体种子；
发酵培养牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%, pH值为7，装液量200 毫升/500毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接种液体种子，接种量 10%, 28摄氏度、140转/分钟培养12小时。
2、 生物转化
将鬼臼毒素用无水乙醇配制成浓度为每毫升乙醇含有10毫克鬼臼毒素的鬼臼 毒素溶液，将鬼臼毒素溶液加入到北京棒杆菌发酵体系中至其终浓度为100微克/ 毫升，在以下条件下进行生物转化反应温度28摄氏度，转速为140转/分钟，转 化反应时间为10小时，得到含有鬼臼苦素和鬼臼酸的生物转化基质，从该生物转 化基质中取样，HPLC测定得鬼臼毒素起始浓度为100微克/毫升，转化10小时 后生物转化基质中鬼臼毒素浓度为54微克/毫升，鬼臼毒素转化率为46%。
3、 生物转化基质中产物的分离纯化与结构鉴定
采用与实施例l相同的分离纯化工艺，从生物转化基质中得到白色针状晶体和 白色不定形粉末，通过核》兹共振(NMR)和质谦(ESI-MS),白色针状晶体被确定为鬼
13臼苦素；白色不定形粉末被确定为鬼臼酸(结构鉴定参数同实施例1)。 实施例6
1、 枯草杆菌的培养
斜面菌种培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5%,氯化钠0.5%，琼脂2.0%, pH值为7， 115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、制成斜面，接种枯草杆菌菌种， 30摄氏度培养12小时；
液体种子培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%, pH值为7， 装液量200毫升/500毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接种斜面菌 种，30摄氏度、180转/分钟培养6小时，作为液体种子；
发酵培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5%,氯化钠0.5%, pH值为7，装 液量200毫升/500毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接种液体种子， 接种量10%, 30摄氏度、180转/分钟培养6小时。
2、 生物转化
将鬼臼毒素用无水乙醇配制成浓度为每毫升乙醇含有10.0毫克鬼臼毒素的鬼 臼毒素溶液，将鬼臼毒素溶液加入到枯草杆菌发酵体系中至其终浓度为127微克/ 毫升，在以下条件下进行生物转化反应温度30摄氏度，转速为180转/分钟，生 物转化时间为12小时，得到含有鬼臼苦素和鬼臼酸的生物转化基质，从该生物转 化基质中取样，HPLC测定得鬼臼毒素起始浓度为127微克/毫升，转化20小时 后生物转化基质中鬼臼毒素浓度为80微克/毫升，鬼臼毒素转化率为37%。
3、 生物转化基质中产物的分离纯化与结构鉴定
采用与实施例l相同的分离纯化工艺，从生物转化基质中得到白色针状晶体和 白色不定形粉末，通过核磁共振(NMR)和质谱(ESI-MS),白色针状晶体被确定为鬼 臼苦素；白色不定形粉末被确定为鬼臼酸(结构鉴定参数同实施例1)。
实施例7
1、噬夏孢欧文氏菌的培养
斜面菌种培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨1.0%,氯化钠0.5%,琼脂1.5%， pH值为7， 115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、制成斜面，接种噬夏孢欧文氏菌 菌种，30摄氏度培养12小时；
液体种子培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨1.0%,氯化钠0.5%， pH值为7，
14装液量50毫升/250毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接种斜面菌 种，30摄氏度、180转/分钟培养10小时，作为液体种子；
发酵培养培养基牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%,氯化钠0.5%， pH值为7,装 液量50毫升/250毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接种液体种子， 接种量10%, 30摄氏度、180转/分钟培养10小时。
2、 生物转化
将鬼臼毒素用无水乙醇配制成浓度为每毫升乙醇含有5.0毫克鬼臼毒素的鬼臼 毒素溶液，将鬼臼毒素溶液加入到噬夏孢欧文氏菌发酵体系中至其终浓度为62微 克/毫升，在以下条件下进行生物转化反应温度30摄氏度，转速为180转/分钟， 生物转化时间为20小时，得到含有鬼臼苦素和鬼臼酸的生物转化基质，从该生物 转化基质中取样，HPLC测定得鬼臼毒素起始浓度为62微克/毫升，转化20小时 后生物转化基质中鬼臼毒素浓度为42微克/毫升，鬼臼毒素转化率为32%。
3、 生物转化基质中产物的分离纯化与结构鉴定
采用与实施例1相同的分离纯化工艺，从生物转化基质中得到白色针状晶体和 白色不定形粉末，通过核^磁共振(NMR)和质谱(ESI-MS),白色针状晶体被确定为鬼 臼苦素；白色不定形粉末被确定为鬼臼酸(结构鉴定参数同实施例1 )。
实施例8
1、 弯曲假单胞菌的培养
斜面菌种培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%，琼脂2.0%， pH值为7， 115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、制成斜面，接种弯曲假单胞菌菌 种，25摄氏度培养12小时;
液体种子培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5%,氯化钠0.5%, pH值为7， 装液量200毫升/500毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接种斜面菌 种，25摄氏度、180转/分钟培养10小时，作为液体种子；
发酵培养培养基牛肉膏0.3%,蛋白胨0.5%,氯化钠0.5%, pH值为7，装 液量200毫升/500毫升摇瓶，115摄氏度灭菌30分钟，灭菌后冷却、接种液体种子， 接种量10%, 25摄氏度、180转/分钟培养10小时。
2、 生物转化
将鬼臼毒素用无水乙醇配制成浓度为每毫升乙醇含有10.0毫克鬼臼毒素的鬼 臼毒素溶液，将鬼臼毒素溶液加入到弯曲假单胞菌发酵体系中至其终浓度为109微
15克/毫升，在以下条件下进行生物转化反应温度25摄氏度，转速为180转/分钟， 生物转化时间为20小时，得到含有鬼臼苦素和鬼臼酸的生物转化基质，从该生物 转化基质中取样，HPLC测定得鬼臼毒素起始浓度为109微克/毫升，转化20小 时后生物转化基质中鬼臼毒素浓度为78微克/毫升，鬼臼毒素转化率为28%。 3、生物转化基质中产物的分离純化与结构鉴定
采用与实施例l相同的分离纯化工艺，从生物转化基质中得到白色针状晶体和 白色不定形粉末，通过核磁共振(NMR)和质谱(ESI-MS),白色针状晶体被确定为鬼 臼苦素；白色不定形粉末被确定为鬼臼酸(结构鉴定参数同实施例1 )。
权利要求
1、一种将鬼臼毒素转化为鬼臼酸和鬼臼苦素的方法，包括在微生物铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、梭状芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinenese)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、噬夏孢欧文氏菌(Erwiniauredovora)或弯曲假单胞菌(Pseudomonas geniculata)的发酵过程中，将底物鬼臼毒素溶液加入到上述任何一种微生物发酵体系中进行生物转化反应，得到含有鬼臼酸和鬼臼苦素的生物转化基质。
2、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的底物鬼臼毒素溶液用无 水乙醇配制，其浓度为每毫升无水乙醇含有2.5-20毫克的鬼臼毒素。
3、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于将鬼臼毒素溶液加入到微生物 发酵体系中至其终浓度为20-1000微克/毫升。
4、 按照权利要求3所述的方法，其特征在于，将鬼臼毒素溶液加入到微生物 发酵体系中至其终浓度为90微克/毫升。
5、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物转化反应按照以下 条件进行生物转化反应温度为20-45摄氏度，转化反应时间为3-200小时，转速 为50-350转/分钟。
6、 按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的生物转化反应按照以下 条件进行生物转化反应温度为37摄氏度，生物转化时间为20小时，转速为200 转/分钟。
7、 由权利要求l-6任何一项方法制备得到含有鬼臼酸和鬼臼苦素的生物转化基质。
8、 一种从权利要求7所述的生物转化基质中分离出鬼臼酸和鬼臼苦素的方法， 包括(1)将生物转化基质离心后的上清液用大孔吸附树脂柱进行初分离，用乙醇水溶液进行梯度洗脱，分段收集洗脱液；(2 )将所收集的30%-40%乙醇洗脱液以凝胶柱层析进行细分离，得到鬼臼酸； (3)将所收集的60%-80%乙醇洗脱液，浓缩、过滤除去不溶性杂质，结晶，得鬼臼苦素。
9、 按照权利要求8所述的方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂选自大孔吸附树脂D312, AB-8， S-8, ADS國7， YWD04C， YWDBC, DM130， MCA, 860021 或函隱18。
10、按照权利要求8所述的方法，其特征在于所述的凝胶柱为SephadexLH-20凝胶柱。
全文摘要
本发明公开了一种将鬼臼毒素转化为鬼臼酸和鬼臼苦素的方法，包括在微生物铜绿假单胞菌、芽孢杆菌、红串红球菌、梭状芽孢杆菌、北京棒杆菌、枯草杆菌、噬夏孢欧文氏菌或弯曲假单胞菌的发酵过程中加入底物鬼臼毒素溶液，进行生物转化反应，得到含有鬼臼酸和鬼臼苦素的生物转化基质。本发明还公开了一种将鬼臼酸和鬼臼苦素从所得到的生物转化基质中分离出来的方法，包括将生物转化基质用大孔吸附树脂柱进行初分离，并以凝胶柱层析细分离，分别得到鬼臼苦素和鬼臼酸。本发明利用微生物转化对鬼臼毒素结构进行修饰，得到鬼臼酸和鬼臼苦素，底物转化率高，操作简单，反应条件温和，产生的废弃物少，分离过程简单。
文档编号C12P17/04GK101492704SQ20081000277
公开日2009年7月29日 申请日期2008年1月21日 优先权日2008年1月21日
发明者艳 李, 李冬生, 汤亚杰 申请人:湖北工业大学