八角莲人工种子的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一种八角莲人工种子的制作 方法。
【背景技术】
[0002] 八角莲Dysosmaversipellis(Hance)M.Cheng是我国传统常用中药之一，具清热 解毒，化痰散结、祛痰消肿之功效，其主要活性成分是具有抗肿瘤活性的天然产物_鬼臼毒 素，一种人工合成依托泊苷（etoposide，VP-16)和替尼泊苷（teniposide，VM-26)等药物 的前体。近年来的临床研究表明，VP-16和VM-26的临床效果优越，是治疗睾丸癌、淋巴癌、 白血病、小细胞肺癌的重要药物；且体外实验显示，VP-16能增强抗癌药物对黑色素瘤的疗 效。目前，VP-16和VM-26已获得美国FDA批准上市，具有巨大的市场潜力。另外，八角莲 叶较大，边缘4-9浅裂或深裂，花艳丽，极具观赏价值。
[0003] 随着鬼臼毒素新功能的不断开发和人类患癌率的逐年增加，八角莲的市场需求量 也日益增加，其资源问题也就成为研究的焦点。长期以来由于过度采挖，造成八角莲野生资 源亏缺，物种濒危，目前已被列为国家珍稀濒危三级保护植物。加之八角莲植株座果率低， 种子自然繁殖率极低，难以满足规模化人工种植的需要。
[0004] 传统的根茎分株和根诱导苗的繁殖方式繁殖率也很低，且生产成本很高，同时不 利于野生资源的保护。利用组织培养快速繁殖的方式，虽然能够在一定程度上解决八角莲 快速繁殖的问题，但同时也存在着，愈伤组织在继代多代后出现变异、种质退化，愈伤组织 分化苗移栽成活率低和生产成本高等瓶颈问题，很大程度上限制了八角莲的大规模化栽培 生产。
[0005] 人工种子事实上是与体细胞胚胎实际应用密切相关。体细胞胚胎具有增殖快、产 量高、遗传稳定的优点，更为重要的是，它还具有双极性结构，可以一步到位形成完整的植 株，不需要按常规分步诱导芽和根的形成。因而，人工种子的应用前景广阔。对八角莲而 言，人工种子即是将八角莲的体细胞胚胎经过包埋处理之后，直接播种到土壤中，它为八角 莲的人工栽培提供了一个新途径。
[0006] 目前国内外尚无有关八角莲人工种子的相关报道。而我们课题组在前期的研究 中，已成功诱导获得八角莲的体细胞胚胎，为八角莲人工种子的研制提供了可利用的生产 材料。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0008] 本发明的目的在于提供了一种珍稀濒危药用植物八角莲的人工种子制作方法，旨 在利用现代生物技术有效缓解八角莲野生资源濒临枯竭和规模化人工栽培中种苗短缺的 局面，满足人们生活中对八角莲的需求。
[0009] 本发明还有一个目的是利用胚性愈伤组织分化得到体细胞胚胎后，制作得到种 子，减少生产步骤，缩短生产周期。
[0010] 本发明还有一个目的是使用普鲁兰多糖溶液对人工种子喷洒后，提高种子的萌发 率。
[0011] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种八角莲人工种子的制作 方法，其中，包括：
[0012] 将八角莲胚性愈伤组织经过分化培养得到体细胞胚胎，然后将体细胞胚胎进行增 殖培养得到增殖的体细胞胚胎，将所得增殖的体细胞胚胎用包埋剂包裹即得所述八角莲人 工种子。
[0013] 优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，
[0014] 采用分化培养基进行所述分化培养；
[0015] 所述分化培养基主要由MS培养基、浓度0-1.Omg/L的6-BA以及浓度为 0? 1-2.Omg/L的NAA组成；
[0016] 分化分化培养条件为：暗培养，温度20-24°C，培养周期为15-20天。
[0017] 优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，
[0018] 采用增殖培养基进行增殖培养；
[0019] 所述增殖培养基为液体培养基，所述增殖培养基主要由MS培养基、浓度0-1.Omg/ L的 6-BA、浓度 0-1.Omg/L的NAA、浓度 0-2.Omg/L的 2,4-D以及浓度 0-0. 5mg/LABA组成；
[0020]所述增殖培养方法为：悬浮培养，暗培养，温度20-24°C，培养周期为10-20天。
[0021 ] 优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，
[0022] 使用2. 5_40g/L的普鲁兰多糖溶液对所述八角莲人工种子喷洒后贮藏。
[0023] 优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，所述体细胞胚胎为继代培养3-4 代的体细胞胚胎。
[0024] 优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，所述包埋剂通过以下方法制 得：
[0025] 步骤一、制备人工胚乳，所述胚乳中含有1/2MS培养基、浓度0. 3-0. 6mg/L的6-BA、 浓度〇? 3-0. 6mg/L的GA3、浓度0? 3-0. 6mg/L的IBA、浓度13-16g/L麦芽糖、质量百分比为 0. 3-0. 5%的多菌灵以及质量百分比为0. 3-0. 5%的活性炭；
[0026] 步骤二、将海藻酸钠粉末与所述人工胚乳以3-4 :100的质量比例混合，加热搅拌 成溶胶状态，即得到所述包埋剂。
[0027] 优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，所述包埋剂的pH= 5. 8.
[0028] 优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，用包埋剂进行所述包埋的方法 为：
[0029] 步骤一、将所述包埋剂经110-125°C灭菌15-25min得到无菌包埋剂；
[0030] 步骤二、在无菌条件下，将所述增殖的体细胞胚胎在100目滤网过滤后，均匀悬浮 于所述无菌包埋剂中，同时再加入四环素和硫酸链霉素得到悬浊液，所述四环素和硫酸链 霉素的用量均为l〇〇mg/L;
[0031] 步骤三、使用滴管吸取所述悬浊液中带胚状体的液滴；
[0032] 步骤四、将所述带胚状体的液滴滴入无菌的质量分数为2 %的氯化钙溶液中， 10-15min后去除氯化钙溶液，再使用无菌水冲洗18-20min即得到所述人工种子。
[0033] 优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，所述人工种子进行贮藏前先进 行干燥。
[0034] 优选的是，所述的八角莲人工种子的制作方法中，所述人工种子贮藏的条件为：无 菌密封，温度3-5 °C。
[0035] 本发明至少包括以下有益效果：首先，本发明中的八角莲胚性细胞具有生长速度 快、植株再生频率高、性状稳定等优点，克服了八角莲常规组织培养中易褐化、变异和生长 周期长及成本高等缺点；本发明也解决了八角莲种子量少、繁殖率低的生产问题；同时，本 发明不受季节限制、可大量生产人工种子，能够择时播种。本项发明成果为八角莲的规模化 人工栽培提供了生产所需的种子种苗，有益效果明显。通过本发明所述方法制得的种子萌 发率高达85%以上。
[0036] 其次，本发明利用普鲁兰多糖溶液对八角莲人工种子进行喷洒，有效的保持人工 种子的水分，特别针对利用了海藻酸钠和氯化钙的人工种子，能够有效解决这类人工种子 易失水的缺点，相比不适用普鲁兰多糖喷洒的种子，萌发率提高了 60%左右，效果非常显 著。
[0037] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本 发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。
[0039] 本发明的八角莲人工种子的制作方法包括以下步骤：
[0040] 一、体细胞胚胎的诱导：将八角莲胚性愈伤组织转入分化培养基MS+0-1.Omg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤）+0. 1-2.Omg/LNAA(萘乙酸）的培养基上，诱导体细胞胚胎的形成， 得到体细胞胚胎。培养条件为：暗培养，温度22°C±2°C，培养周期15-20d。
[0041] 二、体细胞胚胎液体增殖培养：将继代3-4代的体胚转接到MS+0-1.Omg/ L6-BA(6-苄氨基腺嘌呤）+0-1.Omg/LNAA(萘乙酸）+0-2.Omg/L2，4-D(2，4-二氯苯氧 乙酸）+〇-〇. 5mg/LABA(脱落酸）的液体培养基中悬浮培养。培养条件为：暗培养，温度 22°C±2°C，培养周期10-20d。该步骤中也可以使用固体培养基，但是优选使用液体培养 基，因为体细胞胚胎在液体中悬浮能够更加均匀地吸收养分，利于生长。
[0042] 三、八角莲人工种子制作：包括以下步骤：
[0043] 1)制备包埋剂：以 1/2MS+0. 5mg/L6-BA+O. 5mg/LGA3 (赤霉素）+0? 5mg/LIBA(吲 哚丁酸）+15g/L麦芽糖+0. 3-0. 5 %多菌灵+0. 3-0. 5 %活性炭为人工胚乳。并按3-4%比例 加入海藻酸钠粉末后，混合加热使之成溶胶状态，即包埋剂，所述包埋剂的pH= 5. 8。包埋 剂经121°C高压灭菌20min后，冷却备用。
[0044] 2)种子的制作：在无菌条件下，将3_5mm的八角莲体细胞胚胎在100目的镍网上 过滤后，均匀悬