专利名称：一种从桃儿七中制备高纯度鬼臼毒素的方法
技术领域：
本发明涉及从植物中提取鬼臼毒素的方法，特别是一种从桃儿七中制备高 纯度鬼臼毒素的方法。
鬼臼毒素(podophyllotoxin)又叫鬼臼素、鬼臼毒、鬼臼脂素，是一种 具抗肿瘤活性的天然产物，属木脂素类化合物中的环木脂内酯。其化学名为 [5R- (5 a ， 5 a 0 ， 8a a ， 9 a ) ]， 5， 8， 8 a ， 9-四氢-9-羟-5- (3， 4， 5-三甲氧苯基) 呋喃(3'，4': 6,7)萘并-[2，3-d]-l,3-间二氧杂环烯-6(5a H)-酮。分子式 C22H2208， 分子量414.41，结构式为通式I :
鬼臼毒素可用于治疗尖锐湿疣、抑制疱疹病毒。同时自50年代鬼臼毒素 被证实对肿瘤细胞有治疗效果以后，人们加强了对鬼臼毒素的研究并合成了 大量的鬼臼毒素衍生物，筛选出了SP-G (鬼臼毒素葡萄糖与苯甲醛的縮合产 物)、SP-1 (鬼臼酸乙基酰肼)、依托泊甙(VP-16)和替尼泊甙(VM-26)等几 种高活性抗肿瘤药物。
目前，鬼臼毒素主要从小檗科的八角莲属、桃儿七属和山荷叶属等属植 物中分离得到。杉UL七(Podophyllum emodi Wall. var. chi膽se Sprague) 又名大黄鬼臼、华鬼臼、桃耳七、小叶莲，为小檗科植物，生长于山中林下阴 湿的地方，在我国资源十分丰富，主要分布在甘肃、陕西、西藏、青海等省。
背景技术：
3地下部分或果实入药，其性温味苦，有和血、止血、除风湿、解毒、消肿之功 效。
目前从桃儿七中提取纯化鬼臼毒素的生产方法大致可分为化学溶剂提取 分离法和常压柱层析分离法两类，传统的化学溶剂提取分离方法具有操作简 单，产量大的优点，但提取纯化过程中都需要用到苯或甲苯等毒性较大的溶剂， 给操作者造成危害较大，对环境污染严重，且所得产品纯度低。常压柱层析分 离法虽然能得到高纯度的产品，但操作繁琐，且产量低，分离效率差，生产周 期长，需消耗大量的洗脱剂，硅胶利用率低。
中国专利CN1253456C公告的一种从桃儿七中制备鬼臼毒素的方法，其是 将桃儿七根茎粉碎后，加入90%乙醇溶液，在70。C回流提取3次，合并提取液， 减压浓縮，得棕红色浆状物；在棕红色浆状物，加入石油醚，搅拌使其充分萃 取，静置分层，弃去下层棕红色液体，将上层淡黄色液体静置结晶，离心过滤， 得白色至淡黄色针状晶体，此即为鬼臼毒素粗品，继而用柱层析分离与纯化， 得到鬼臼毒素精品。
在柱层析分离与纯化时，先用氯仿溶解鬼臼毒素粗品，再流过装有硅胶 的减压层析柱；用醇类或酮类与氯仿的混合液进行洗脱，收集部分洗脱液，减 压浓縮至干，得白色提取物，即为纯度91.1-98.75%的鬼臼毒素精品。
但是上述方法得到的鬼臼毒素精品纯度略低且不太稳定。
发明内容
为了避免以往工艺的缺点，节约资源，简化工序，縮短生产周期，直接 分离得到高纯度的鬼臼毒素，并减少对操作者的危害，本发明提供了一种新的 从桃儿七中制备高纯度鬼臼毒素的方法，该方法得到的鬼臼毒素纯度大于99%。 对于保护日趋减少的鬼臼毒素资源，降低生产成本，促进鬼臼毒素应用，具有 极为重要的意义。
为了实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案是
一种从桃儿七中制备高纯度鬼臼毒素的方法，分为原料用醇类提取得浸 膏再经萃取得鬼臼毒素粗品和鬼臼毒素粗品高压柱层析两部分组成，具体步骤
为将桃儿七根茎经超微粉碎后，在超声波条件下用醇类溶剂加热50-6CTC提 取三次，合并三次提取液，合并提取液浓縮醇类溶剂，得到比重为1.0-1.2的红褐色浸膏；再加入1-2倍浸膏体积量的水得到鬼臼毒素醇水相；鬼臼毒素醇 水相用等体积的二氯甲垸萃取三次，合并三次的二氯甲垸相，浓縮得到纯度为 40%-50%的淡黄色鬼臼毒素粗品；淡黄色鬼臼毒素粗品用二氯甲垸溶解，上样 至硅胶为300-400目的高压柱，用丙酮+二氯甲烷溶剂的混合洗脱液洗脱，收集 产品段洗脱液，过滤浓縮后，烘干即得到纯度大于99%的鬼臼毒素精品。
为了使植物细胞中有效组分全部释放出来，将桃儿七根茎经超微粉碎至 粒径IO y m以下，使其小于植物细胞的平均直径15-25 ix m。
所用超声波的功率为1000-10000W。
在本发明中，所述二氯甲垸相用无水硫酸钠干燥过滤后浓縮干，6(TC干
燥，得到纯度为40%-50%的淡黄色鬼臼毒素粗品。
在本发明中，所述醇类溶剂为甲醇或乙醇，优选为甲醇。 所述高压柱的柱压为2. 5 3. 5MPa。内径为100-250mm，层析柱层径高比为
1 : 10-20。
所述洗脱液中丙酮与氯仿的体积比为i: 20。
在本发明中，洗脱液过滤浓縮后，采用6(TC进行鼓风干燥。 本发明的方法克服了以前工艺的提取效率低，所用溶剂毒性大，产品颜 色差，纯度低的缺点，具有如下优点
1、 不采用传统的加热浸泡并浓縮干的方法，而是原料经超微粉碎，在超 声波条件下加热浸泡，浓縮后到一定比重再萃取浸膏的醇水相，操作简便，提 取完全彻底，提取效率高，直接得到的产品纯度高。
2、 去除了过去用苯等毒性较大的溶剂化学结晶的方法，而采用毒性相对 低的丙酮和二氯甲垸溶剂进行柱层析，对人体危害更小，对环境污染低。
3、 使用特制高压柱进行层析，上样量大，周期短，分离度好，产品纯度 高，硅胶可重复利用。
4、 避免了过去高温加热高温烘干工序，而采用6(TC进行鼓风干燥，产品 质量好。
本发明得到的鬼臼毒素纯度大于99% 。
具体实施例方式
本发明内容通过以下的实施例作进一步的阐述，但并不限制本发明的范围。
实施例1
5 kg超微粉碎粒径10"m以下的桃儿七根茎用30 L甲醇50'C浸泡，用功 率为1000W超声波提取3次，3小时每次，合并3次提取液浓縮得到4.8 L比重为 l.l的红褐色浸膏，转入萃取罐并加入9.6L 7jC，共用15L二氯甲垸分3次萃取， 合并3次二氯甲烷相，用无水硫酸钠干燥过滤后浓縮干，并采用6(TC烘干得640 g淡黄色鬼臼毒素粗品粉末。淡黄色鬼臼毒素粗品粉末3L二氯甲烷溶解，湿法 上样至填料为300-400目硅胶高压柱，其中高压柱的柱压为2. 5 3.5MPa，高压 柱内径为100咖，层析柱层径高比为1 : 12，用比例为l: 20的丙酮和二氯甲烷的
混合洗脱液洗脱，收集鬼臼毒素产品部分，浓缩至大量产品析出，过滤，采用 6(TC鼓风干燥得到鬼臼毒素精品白色粉末150 g， HPLC检测纯度为99. 22%。
实施例2
50 kg超微粉碎粒径10ixm以下的桃儿七根茎用300 L甲醇50'C浸泡，用 功率为5000W超声波提取3次，3小时每次，合并3次提取液浓缩得到48. 6 L比重 为l.l的红褐色浸膏，转入萃取罐并加入IOO L水，共用150 L二氯甲垸分3次 萃取，合并3次二氯甲垸相，无水硫酸钠干燥过滤后浓縮干，并采用6(TC烘干 得6240 g淡黄色鬼臼毒素粗品粉末。淡黄色鬼臼毒素粗品粉末20 L二氯甲烷溶 解，湿法上样至填料为300-400目硅胶高压柱，其中高压柱的柱压为2.5 3.5MPa，高压柱内径为200mm，层析柱层径高比为l : 12.5,用比例为l: 20的丙 酮和二氯甲垸混合液洗脱，收集鬼臼毒素产品部分，浓縮至大量产品析出，过 滤，采用60。C鼓风干燥烘干得到白色粉末1534 g， HPLC检测纯度为99. 37%。
实施例3
5 kg超微粉碎粒径10um以下的桃儿七根茎用30 L乙醇6(TC浸泡，用功 率为1000W超声波提取3次，3小时每次，合并3次提取液浓縮得到4. 82 L比重为 1.08的红褐色浸膏，转入萃取罐并加入10L水，共用15L二氯甲垸分3次萃取， 合并3次二氯甲烷相，无水硫酸钠干燥过滤后浓縮干，并采用60'C烘干得624g 淡黄色鬼臼毒素粗品粉末。淡黄色鬼臼毒素粗品粉末3L二氯甲烷溶解，湿法上 样至填料为300-400目硅胶高压柱，其中高压柱的柱压为压力2. 5 3. 5MPa,高
6压柱内径为100mm，层析柱层径高比为l : 12，用比例为h 20的丙酮和二氯甲烷 混合液洗脱，收集鬼臼毒素产品部分，浓縮至大量产品析出，过滤，采用60 。C鼓风干燥烘干得到白色粉末148 g， HPLC检测纯度为99. 47%。
实施例4
50 kg超微粉碎粒径10um以下的桃儿七根茎用300 L乙醇60。C浸泡，用 功率为5000W超声波提取3次，3小时每次，合并3次提取液浓縮得到47. 7 L比重 为1.12的红褐色浸膏，转入萃取罐并加入IOO L水，共用150 L二氯甲烷分3 次萃取，合并3次二氯甲烷相，无水硫酸钠干燥过滤后浓縮干，并采用6(TC烘 干得6212 g淡黄色鬼臼毒素粗品粉末。淡黄色鬼臼毒素粗品粉末20 L二氯甲烷 溶解，湿法上样至填料为300-400目硅胶高压柱，其中高压柱的柱压为2.5 3.5MPa，高压柱内径为200隱,层析柱层径高比为1 : 12.5，用比例为l: 20的丙 酮和二氯甲垸混合液洗脱，收集鬼臼毒素产品部分，浓縮至大量产品析出，过 滤，采用60。C鼓风干燥烘干得到白色粉末1516 g， HPLC检测纯度为99. 48%。
权利要求
1. 一种从桃儿七中制备高纯度鬼臼毒素的方法，分为原料用醇类提取得浸膏再经萃取得鬼臼毒素粗品和鬼臼毒素粗品高压柱层析两部分组成，具体步骤为将桃儿七根茎经超微粉碎后，在超声波条件下用醇类溶剂加热50-60℃提取三次，合并三次提取液，合并提取液浓缩醇类溶剂，得到比重为1.0-1.2的红褐色浸膏；再加入1-2倍浸膏体积量的水得到鬼臼毒素醇水相；鬼臼毒素醇水相用等体积的二氯甲烷萃取三次，合并三次的二氯甲烷相，浓缩得到纯度为40％-50％的淡黄色鬼臼毒素粗品；淡黄色鬼臼毒素粗品用二氯甲烷溶解，上样至硅胶为300-400目的高压柱，用丙酮+二氯甲烷溶剂的混合洗脱液洗脱，收集产品段洗脱液，过滤浓缩后，烘干即得到纯度大于99％的鬼臼毒素精品。
2. 如权利要求l所述的方法，其中将桃儿七根茎经超微粉碎至粒径10um 以下。
3. 如权利要求l所述的方法，其中所用超声波的功率为1000-10000W。
4. 如权利要求l所述的方法，其中所述二氯甲垸相用无水硫酸钠干燥过 滤后浓缩干，6(TC干燥，得到纯度为40%-50%的淡黄色鬼臼毒素粗品。
5. 如权利要求l所述的方法，其中所述醇类溶剂为甲醇或乙醇。
6. 如权利要求l所述的方法，其中所述高压柱的柱压为2. 5 3. 5MPa。
7. 如权利要求6所述的方法，其中所述高压柱内径为100-250mm,层析柱 层径高比为l : 10-20。
8. 如权利要求l所述的方法，其中所述洗脱液中丙酮与氯仿的体积比为i: 20。
9. 如权利要求l所述的方法，其中洗脱液浓縮过滤后，采用60'C进行鼓 风千燥。
全文摘要
一种从桃儿七中制备高纯度鬼臼毒素的方法，分为原料用醇类提取得浸膏再经萃取得鬼臼毒素粗品和鬼臼毒素粗品高压柱层析两部分组成，具体步骤为将桃儿七根茎经超微粉碎后，在超声波条件下用醇类溶剂加热提取三次，合并三次提取液，合并提取液浓缩醇类溶剂，得到比重为1.0-1.2的红褐色浸膏；再加入1-2倍浸膏体积量的水得到鬼臼毒素醇水相；鬼臼毒素醇水相用等体积的二氯甲烷萃取三次，合并三次的二氯甲烷相，浓缩得到纯度为40％-50％的淡黄色鬼臼毒素粗品；淡黄色鬼臼毒素粗品用溶解，上样至硅胶为300-400目的高压柱，用丙酮+二氯甲烷溶剂的混合洗脱液洗脱，收集产品段洗脱液，浓缩过滤后，烘干即得到纯度大于99％的鬼臼毒素精品。
文档编号A61P35/00GK101503410SQ20091004769
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月17日 优先权日2009年3月17日
发明者仝泽彬, 张伟中, 张爱平, 王权勇, 蔡志香, 卅 高 申请人:上海金和生物技术有限公司