鬼臼毒素靛红类衍生物在抗白血病药物中的应用及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鬼白毒素靛红类衍生物及其合成方法，以及用于制备抗白血病药物。
【背景技术】
[0002] 鬼白毒素是一类具有木质素结构的天然产物，主要从小蘖科鬼白属植物的根、茎 中分离得到，具有抗肿瘤等活性。鬼白毒素虽然具有较强的抗肿瘤活性，但是由于其毒副作 用较强，因此在临床上鬼白毒素主要作为外用治疗尖锐湿疣等疾病。自从上个世纪50年代 开始，人们就开始了对鬼白毒素的结构修饰，得到了大量的结构类似物，并发现了一些具有 较低毒副作用，同时保持了较强抗肿瘤活性的衍生物，如目前临床上使用的抗肿瘤药物依 托泊苷和替尼泊苷等，同时还有一些鬼白毒素衍生物正处于临床和临床前研究阶段。例如， 依托泊苷主要用于治疗急性白血病、小细胞肺癌等症。虽然，针对鬼臼毒素的结构修饰和改 造取得了较大的进展，但是目前临床上使用的鬼白毒素类药物仍然存在一定的缺陷，如多 药耐药性、骨髓抑制等。
【发明内容】
[0003]本发明目的是提供鬼白毒素靛红类衍生物及其制备方法，以及用于制备抗白血病 药物，本发明鬼白毒素靛红类衍生物对人白血病细胞K562和人白血病阿霉素耐药株K562/ ADR均有较强的抗增殖作用。
[0004]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是： 一种式（I)所示的鬼白毒素靛红类衍生物：
其中R为单取代，取代位置任意，R表示H、卤素或CH3。
[0005]所述卤素为氟、氯或溴。
[0006]-种式（I)所示的鬼白毒素靛红类衍生物的制备方法，所述的制备方法为：①化 合物（b)氯乙酸酯鬼白毒素的制备：冰浴条件下依次加入鬼白毒素（a)、二氯甲烷和三乙 胺，缓慢滴加氯乙酰氯，升至室温搅拌反应至反应结束；②鬼白毒素靛红类衍生物（I)的制 备：加入氯乙酸酯鬼臼毒素（b)、N，N-二甲基甲酰胺、碳酸钾、靛红或靛红衍生物，在80°C下 搅拌反应至反应结束。
[0007] 本发明的鬼白毒素靛红类衍生物可用于制备抗白血病药物。
[0008] 药理活性试验证明，本发明的通式（I)化合物能够有效的抑制K562和K562/ADR细 胞的增殖。通过AnnexinV-APC/7-AAD双染法和PI单染法证实，本发明的通式（I)化合物 抗肿瘤的分子机制包括：（1)诱导凋亡；（2)阻滞细胞周期。
[0009] 以下是本发明部分化合物的药理活性测试方法及结果 一、体外抗增殖活性 CCK-8(CellCountingKit-8)染色法 将细胞消化、计数，配制细胞悬浮液3. 0X104个/毫升，96孔细胞培养板中每孔加入 100μL细胞悬液，37°C，5%C02培养箱中培养24小时。每孔加入相应的含药培养基，同时 设立阴性对照组，阳性对照组和溶媒组。96孔板置于37°C，5%C02培养箱中培养72小时， 每孔加入100μLCCK-8溶液，继续培养2小时。λ=450,酶标仪读出每孔的0D值，计算抑 制率。以浓度-抑制率曲线得出回归方程，求出半数抑制浓度（IC5。）。
[0010] 本实验按照CCK-8方法，以依托泊苷为阳性对照药，进行了通式（I)化合物对K562 和K562/ADR细胞株的抑制活性测试，结果如表1 : 表1本发明部分鬼白毒素靛红类衍生物（I)的化学结构以及其体外抗增殖活性
以上实验结果显示，本发明如通式（I)所示化合物对K562和K562/ADR均具有较强的抗 增殖活性，并且活性均强于阳性对照药依托泊苷。其中1-3的活性最强，对K562的IC5。值 为 0. 019±0. 007μΜ，对K562/ADR的IC5。值为 0. 067±0. 010μΜ，分别是依托泊苷的 21 和30倍。
[0011] 二、双染法检测细胞凋亡 将对数生长期的K562/ADR细胞消化接种到六孔板中，次日，待细胞贴壁后，根据组别 设置加入相应的含药培养基，同时设立阴性对照组。药物作用48小时后，用0. 25%胰酶(不 含EDTA)消化收集细胞。用PBS洗涤细胞二次，收集5X105细胞。加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞。加入5yLAnnexinV-APC混匀后，加入5yL7-AAD，混匀。室温、避 光、反应10分钟；用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况，测试结果如表2。 表2Annexin-VAPC/7-AAD双染法检测细胞凋亡
以上实验结果表明，化合物1-3能够显著诱导K562/ADR细胞发生凋亡。
[0012] 三、单染法检测细胞周期 将对数生长期的K562/ADR细胞消化接种到六孔板中，次日，待细胞贴壁后，根据组别 设置加入相应的含药培养基，同时设立阴性对照组。药物作用48小时后，用0. 25%胰酶(不 含EDTA)消化收集细胞。用PBS洗涤细胞一次，收集5X105细胞。制备的单细胞悬液用体 积分数为70%乙醇固定2小时，4°C保存，染色前用PBS洗去固定液。加100yLRNaseA 37°C水浴30分钟，再加入400μLPI染色混匀，4°C避光30分钟。流式细胞仪记录激发波 长488nm处红色荧光，测试结果如表3。
[0013] 表3PI单染法检测细胞周期
上述实验结果表明，1-3化合物能够显著阻滞K562/ADR细胞停滞在G2期。
【具体实施方式】
[0014] 下面通过具体实施例对本发明进行进一步的描述，但本发明的保护并不限于此。
[0015] 实施例1 4-α-[2-氯-乙酸酯]-鬼臼毒素（b)的制备 在50ml圆底烧瓶中加入鬼白毒素（a)(2. 4mmol)、三乙胺（9. 6mmol)和二氯甲烧（20ml)，搅拌，冰浴下滴加氯乙酰氯（6mmol)，滴毕，反应液升至室温搅拌反应。反应完毕，饱和 氯化铵溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，有机层用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，柱 层析得到淡黄色固体4-α-[2-氯-乙酸酯]-鬼臼毒素（b) 0. 95g，收率81%。
[0016]4NMR(400MHz,CDC13)δ6. 77 (s，1H)，6. 55 (s，1H)，6. 37 (s，2H)， 5.99 (d, /= 4. 8Hz, 2H), 5.96 (d, / = 8. 4Hz, 1H), 4.61 (d, / = 2. 6Hz, 1H), 4.38-4.42 (m, 1H), 4.13-4.24 (m, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.75 (s, 6H), 2.84-2.97 (m，2H);13CNMR(100MHz,CDC13)δ173.41，167.94，152.65，148.41，147. 70， 137.11, 134.53, 132.55, 127.21, 109.78, 107.97, 106.92, 101.71, 75.64, 71.13, 60. 75, 56. 13, 45. 52, 43. 64, 40. 69, 40. 48, 38. 46。
[0017] 实施例2 4-α-[2-(1H-吲哚-2, 3-二酮-1-基）_乙酸酯]-鬼臼毒素（1-1)的制备 在10ml圆底烧瓶中加入氯乙酸酯鬼臼毒素（0.2mmol)、碳酸钾（0.2mmol)、靛红 (0.19mmol)和N，N-二甲基甲酰胺（2ml)，油浴加热至80°C搅拌反应。反应完毕，加入水 (20ml)猝灭反应，二氯甲烷萃取三次，有机层用饱和氯化铵和饱和食盐水洗涤，无水硫酸 钠干燥，减压除去溶剂，柱层析得橘红色固体4-a-[2- (1H-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸 酯]-鬼臼毒素（1-1) 〇. 〇87g，收率73%。
实施例3 4-a-[2-(4-氯-1H-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-2)的制备 用4-氯靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2,得橘 红色固体4-α-[2- (4-氯-1H-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-2)，收率 70% 〇
实施例4 4-α-[2- (4-溴-1Η-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-3)的制备 用4-溴靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2,得橘 红色固体4-α-[2-(4-溴-1Η-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-3)，收率 63%〇
实施例5 4-α-[2-(5-甲基-1H-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-4)的制备 用5-甲基靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2,得橘 红色固体4-α-[2-(5_甲基-1H-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-4)，收 率 46%。
实施例6 4-α-[2- (5-氯-1Η-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-5)的制备 用5-氯靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2,得橘 红色固体4-α-[2- (5-氯-1Η-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-5)，收率 67%〇
实施例7
4-α-[2- (5-溴-1H-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-6)的制备 用5-溴靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2,得橘 红色固体4-a-[2-(5-溴-1H-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-6)，收率 71%〇
实施例8 4-α-[2- (6-溴-1H-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-7)的制备 用6-溴靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2,得橘 红色固体4-α-[2-(6-溴-1Η-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-7)，收率 48% 〇
实施例9 4-α-[2- (5-氟-1H-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-8)的制备 用5-氟靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2,得橘 红色固体4-α-[2-(5-氟-1Η-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-8)，收率 50% 〇
实施例10 4-α-[2- (6-氯-1H-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-9)的制备 用6-氯靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2,得橘 红色固体4-α-[2- (6-氯-1H-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-9)，收率 39% 〇
实施例11 4-α-[2-(7-氟-1Η-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-10)的制备 用7-氟靛红代替靛红，按实施例2所述的方法，其余所需原料、试剂同实施例2,得橘 红色固体4-α-[2- (7-氟-1H-吲哚-2, 3-二酮-1-基）-乙酸酯]-鬼臼毒素（1-10)，收率 63%〇
【主权项】
1. 鬼白毒素靛红类衍生物在抗白血病药物中的应用及制备方法，其特征在于： 以结构式（I)所示的鬼白毒素靛红类衍生物：其中R为单取代，取代位置任意，R表示H、卤素或CH3; 所述的卤素为氟、氯或溴。2. 如权利要求1所述的鬼白毒素靛红类衍生物的制备方法，其特征在于所述的制备方 法为： ① 化合物（b)氯乙酸酯鬼白毒素的制备：冰浴条件下依次加入鬼白毒素（a)、二氯甲烷 和三乙胺，缓慢滴加氯乙酰氯，升至室温搅拌反应至反应结束； ② 鬼臼毒素靛红类衍生物（I)的制备：加入氯乙酸酯鬼臼毒素（b)、N，N-二甲基甲酰 胺、碳酸钾、靛红或靛红衍生物，在80°C下搅拌反应至反应结束；3. 如权利要求1所述的化合物用于制备抗白血病药物。
【专利摘要】发明公开了一种式（I）所示的鬼臼毒素靛红类衍生物。本发明还公开了这类衍生物的制备方法及其用于制备抗白血病药物。
【IPC分类】C07D493/04, A61K31/404, A61P35/02
【公开号】CN105250265
【申请号】CN201510534472
【发明人】张磊, 王京
【申请人】遵义医学院
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年8月27日