毒素基因及其使用方法
【专利说明】毒轰基因及其使用方法
[0001] 本申请是申请人于2009年6月25日提交的题为"毒素基因及其使用方法"的中 国专利申请200980122563. 5号的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及分子生物学领域。所提供的是编码杀虫蛋白的新基因。运些蛋白质和 编码它们的核酸序列用于制备杀虫制剂和用于产生转基因抗害虫植物。
【背景技术】
[0003] 苏云金芽抱杆菌度acillus thuringiensis)是革兰氏阳性的产芽抱±壤细菌，其 特征在于其产生晶状包含体的能力，该晶状包含体特异性地对某些目和种的昆虫有毒，但 对植物和其他非祀标生物体无害。由于此原因，包含苏云金芽抱杆菌菌株或它们的杀虫蛋 白的组合物可W用作环境可接受的杀虫剂来控制农业昆虫害虫或各种人或动物疾病的昆 虫媒介。
[0004] 源自苏云金芽抱杆菌的晶体（化y)蛋白质（5-内毒素）具有主要针对鱗翅目 (Lepidopteran)、双翅目（Dipteran)和銷翅目（Coleopteran)幼虫的有效杀虫活性。运些 蛋白质还已显示针对膜翅目（Hymenoptera)、同翅目（Homoptera)、風目任hthiraptera)、 食毛目（Mallo地aga)和婢蛾亚纲（Acari)害虫目，W及其他无脊椎动物目如线形动物口 (化mathelminthes)、扁形动物（Platyhelminthes)和肉鞭虫口（Sarcomastigo巧hora) 的活性（Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc. , New York, N.Y.中的 FeitelsonQggS^he Bacillus Hiuringiensis family tree)。最初主要根据运些蛋白质 的杀虫活性将它们分类为化W至化八。主要的种类是鱗翅目（Lepidoptera)特异的（I)、 鱗翅目和双翅目值iptera)特异的（II)、銷翅目（Coleoptera)特异的（III)、双翅目特异 的（IV)和线虫类特异的（V)和（VI)。进一步将运些蛋白质分类进入亚家族；为各家族内 更高度相关的蛋白质指定各字母如化714、化718、化71(：等。各分部内还更接近地相关的蛋 白质命名为如化ylCl、化ylC2等。
[0005] 最近描述了基于氨基酸序列同源性而非昆虫祀特异性的化y基因的新命名法 (Crickmore 等（1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813)。在此新分类中，为各毒素指 定合并了初级等级（阿拉伯数字）、二级等级（大写字母）、=级等级（小写字母）和四级 等级（另一个阿拉伯数字）的唯一的名称。在此新分类中，在初级等级中已将罗马数字调 换为阿拉伯数字。序列同一性低于45%的蛋白质具有不同的初级等级，二级等级和=级等 级的标准分别是78 %和95%。
[0006] 晶体蛋白质直到被摄入并在昆虫中肠中溶解时才显示杀虫活性。昆虫消化道中 的蛋白酶将摄入的前毒素水解为活性毒性分子。（H6化e和Whitel巧（1989)Microbiol. Rev. 53:242-255)。该毒素与祀标幼虫中肠中的顶刷状缘受体结合并插入顶膜（apical membrane)产生离子通道或管孔，导致幼虫死亡。
[0007] 5 -内毒素一般具有5个保守序列域（sequence domain)和3个保守结构域（见 例如 de Maagd 等（2001)Trends Genetics 17:193-199)。第一个保守结构域由 7 个 a 螺 旋组成并设及膜插入和管孔形成。结构域II由W希腊钥匙构型排列的3个P片层组成， 而结构域III由"薄卷饼"型的2个反平行P片层组成（de Maagd等，2001，上文）。结构 域II和III设及受体识别和结合，因此认为它们是毒素特异性决定子。
[0008] 基于苏云金芽抱杆菌的杀虫剂的密集使用已经在菜蛾（Plutella x^ostella)田 间群体中引起了抗性（Ferr6 和 Van Rie(2002)Annu. Rev. Entomol.47:501-533)。最常见的 抗性机制是毒素与其一种或多种特异性中肠受体结合的减弱。运还可W赋予对共用同一受 体的其他毒素的交叉抗性（Ferr6和Van Rie(2002))。
[000引发明概述
[0010] 本发明提供用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子害虫抗性的组合物和方 法。组合物包含编码5-内毒素多肤序列的核酸分子、包含那些核酸分子的载体和包含载 体的宿主细胞。组合物还包含该内毒素的多肤序列和那些多肤的抗体。该核巧酸序列可W 用于用来在生物体（包含微生物和植物）中转化和表达的DNA构建体或表达盒中。核巧酸 或氨基酸序列可W是设计用于在包含但不限于微生物或植物的生物体中表达的合成序列。 组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。
[0011] 具体而言，提供对应于5-内毒素核酸序列的分离的核酸分子。此外，涵盖对应 于该多核巧酸的氨基酸序列。具体而言，本发明提供编码包含编码SEQ ID N0:61-121和 133-141中任一项所示的氨基酸序列的核巧酸序列的分离的核酸分子，或SEQ ID N0:l-60 和124-132中任一所示的核巧酸序列，W及其变体和片段。还涵盖与本发明的核巧酸序列 互补的核巧酸序列，或与本发明的序列杂交的核巧酸序列。
[0012] 本发明的组合物和方法用于产生具有杀虫剂抗性的生物体，尤其是细菌和植物。 运些生物体和从它们衍生的组合物是为了农业目的而希望得到的。本发明的组合物还用于 产生改变的或改进的具有杀虫活性的5-内毒素蛋白质，或用于检测5-内毒素蛋白质或 核酸在产物或生物体中的存在。
[001引发明详述
[0014] 本发明设及用于在生物体，尤其是植物或植物细胞中调节害虫抗性的组合物和方 法。该方法设及用编码本发明的5-内毒素蛋白质的核巧酸序列转化生物体。具体而言， 本发明的核巧酸序列可用于制备具有杀虫活性的植物和微生物。因此，提供转化的细菌、植 物、植物细胞、植物组织和种子。组合物是苏云金芽抱杆菌5-内毒素的核酸和蛋白质。运 些序列用于构建表达载体用于随后转化进入目的生物体，作为用于分离其他5-内毒素基 因的探针，和用于通过本领域已知的方法，如结构域交换或DNA改组产生改变的杀虫蛋白。 运些蛋白质用于控制或杀死鱗翅目、銷翅目和线虫类害虫群体，并用于产生具有杀虫活性 的组合物。
[0015] " 5 -内毒素"指具有针对一种或多种害虫的毒性活性的源自苏云金芽抱杆菌的毒 素，或与运种蛋白质具有同源性的蛋白质，所述一种或多种害虫包含但不限于鱗翅目、双翅 目和銷翅目的成员或线虫动物口（Nematoda地如11111)的成员。在一些情况下，已从包含双 酶梭菌（Clostridium bifermentans)和日本甲虫类芽抱杆菌（Paenibacillus popilliae) 的其他生物体分离了 5-内毒素蛋白质。5-内毒素蛋白质包含从本文公开的全长核巧酸 序列推断的氨基酸序列，和由于使用其他下游起始位点或由于产生具有杀虫活性的较短蛋 白质的加工而比全长序列短的氨基酸序列。加工可w发生在表达该蛋白质的生物体中，或 该蛋白质被摄入后发生在害虫体内。
[0016] 5 -内毒素包含鉴定为cryl至cry43、巧tl和巧t2和切t-样毒素的蛋白质。目 前已知超过250种具有大范围的特异性和毒性的5-内毒素。全面的列表见化ickmore等 (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813,定期更新见 WWW. biols. SUSX. ac. uk/Home/ Neil_Crickmore/Bt/index 上的 Crickmore 等（2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomencl曰ture"〇
[0017] 本文所提供的是赋予杀虫活性的新的分离的核巧酸序列。还提供5 -内毒素蛋白 质的氨基酸序列。从该基因翻译产生的蛋白质允许细胞控制或杀死将其摄入的害虫。
[001引 分离的核酸分子及其巧体巧片段
[0019] 本发明的一个方面设及包含编码5-内毒素蛋白质和多肤或其生物学活性部分 的核巧酸序列的分离的或重组的核酸分子，W及能够用作杂交探针来鉴定5 -内毒素编码 核酸的核酸分子。本文所用的术语"核酸分子"旨在包含DNA分子（例如重组DNA、cDNA或 基因组DNA)和RNA分子（例如mRNA) W及用核巧酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核 酸分子可W是单链的或双链的，但优选是双链DNA。
[0020] "分离的"或"纯化的"核酸分子或蛋白质或其生物学活性部分基本上游离于其他 细胞物质或培养基（通过重组技术产生时），或基本上游离于化学品前体或其他化学品（化 学合成时）。优选地，"分离的"核酸游离于衍生该核酸的生物体的基因组DNA中天然位于 该核酸侧翼（即位于该核酸的5'和3'端的序列）的序列（优选蛋白质编码序列）。为 了本发明的目的，当用来指核酸分子时，"分离的"排除了分离的染色体。例如，在各种实施 方案中，分离的5 -内毒素编码核酸分子可W包含少于约5化、地b、3化、2化、化b、0. 5化或 0. 1化在衍生该核酸的细胞基因组DNA中天然位于该核酸分子侧翼的核巧酸序列。基本上 游离于细胞物质的5-内毒素蛋白质包含具有少于约30%、20%、10%或5% (按干重计） 的非5-内毒素蛋白质（本文还称之为"污染蛋白质"）的蛋白质制剂。
[002。 编码本发明的蛋白质的核巧酸序列包含SEQ ID NO: 1-60和124-132中所示的序 列及其变体、片段和互补序列。"互补序列"是指与给定的核巧酸序列充分互补，使得其可W 与该给定的核巧酸序列杂交从而形成稳定的双链体的核巧酸序列。由该核巧酸序列编码的 5 -内毒素蛋白质的对应的氨基酸序列示于SEQ ID N0:61-121和133-141。
[0022] 本发明还涵盖是运些5-内毒素编码核巧酸序列的片段的核酸分子。"片段"是 指编码5-内毒素蛋白质的核巧酸序列的部分。核巧酸序列的片段可W编码5-内毒素 蛋白质的生物学活性部分，或者它可W是用下文所公开的方法可W用作杂交探针或PCR引 物的片段。取决于预期的用途，是5-内毒素核巧酸序列的片段的核酸分子包含至少50、 100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、 1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、 2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、 2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350 个邮连核巧酸，或高达存在于本 文所公开的全长5-内毒素编码核巧酸序列中的核巧酸的数目。"邮连"核巧酸是指彼此 相邻的核巧酸残基。本发明的核巧酸序列的片段可编码保留5-内毒素蛋白质的生物学 活性并因此保留杀虫活性的蛋白质片段。"保留活性"是指该片段可具有至少约30%、至少 约50%、至少约70%、80%、90%、95%或更高的5-内毒素蛋白质的杀虫活性。测量杀虫 活性的方法为本领域熟知。见例如Czapla和Lang (1990) J. Econ.化tomol. 83:2480-2485 ; An化ews 等（1988) Biochem. J. 252:199-206 sMarrone 等（198f5)J. of Economic Elntomology 78:290-293 ;和美国专利号5, 743, 477,所有文献在此完整引入作为参考。
[0023] 编码本发明的蛋白质的生物学活性部分的5 -内毒素编码核巧酸序列的片段可 编码至少约 15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、 650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100个邮连氨基酸，或高达存在于本发明的全 长5-内毒素蛋白质中的氨基酸的总数。
[0024] 本发明优选的5 -内毒素蛋白质由与SEQ ID NO: 1-60和124-132的核巧酸序列 几乎相同的核巧酸序列编码。"几乎相同的"是指使用标准参数用本文所述的比对程序之一 与参考序列相比，具有至少约60 %或65 %序列同一性、约70 %或75 %序列同一性、约80% 或85%序列同一性、约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序 列同一性的氨基酸或核巧酸序列。本领域技术人员可知，通过考虑密码子简并性、氨基酸相 似性、阅读框定位等，可W适当调节运些值来测定由两条核巧酸序列编码的蛋白质的对应 的同一性。
[0025] 为了测定两条氨基酸序列或两个核酸的百分比同一性，比对序列用于最佳比较的 目的。两条序列间的百分比同一性是序列所共有的相同位置数的函数（即百分比同一性 =相同位置数/位置（例如重叠位置）总数xlOO)。在一个实施方案中，两条序列具有相 同的长度。在另一个实施方案中，比较跨越参考序列的整体（例如跨越SEQ ID NO: 1-60和 124-132之一的整体，或跨越SEQ ID N0:61-121和133-141之一的整体）。可W用与下文 所述技术类似的允许或不允许缺口的技术来测定两条序列间的百分比同一性。在计算百分 比同一性中，通常计数精确匹配。
[0026] 可W用数学算法完成两条序列间百分比同一性的测定。用来进行两条序列的比 较的数学算法的非限制性实例是按Karlin和Altschul (1993)Proc.化tl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 中修改的 Karl in 和 Altschul (1990) Proc.化tl. Acad. Sci. USA 87:2264 的 算法。运种算法已被并入 Altschul 等（1990)J.Mol.Biol. 215:403 的 BLASTN 和 BLASTX 程 序。可W用BLASTN程序，得分=100,字长=12进行BLAST核巧酸捜索，W获得与本发明 的5-内毒素样核酸分子同源的核巧酸序列。可W用BLASTX程序，得分=50,字长=3进 行BLAST蛋白质捜索，W获得与本发明的5-内毒素蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了 获得用于比较目的的缺口比对，可W按Altschul等（1997) Nucleic Acids Res. 25:3389中 所述使用缺口 BLAST (在BLAST 2. 0中）。备选地，可W用PSI-Blast进行检测分子间距离 关系的迭代捜索。见Altschul等（1997)上文。当利用BLAST、缺口 BLAST和PSI-Blast程 序时，可W使用各程序（例如BLASTX和BLASTN)的默认参数。还可W通过目检进行手工比 对。
[0027] 用于进行序列比较的数学算法的另一个非限制性实例是ClustalW算法化iggins 等（1994)Nucleic Acids Res. 22:4673-4680)。ClustalW 比较序列并比对氨基酸或 DM 序列的整体，从而可W提供关于整个氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法 用于几种市售DNA/氨基酸分析软件包中，如Vector NTI Program SuiteQnvitrogen Co巧oration, Carlsbad, CA)的ALIGNX模块。用ClustalW比对氨基酸序列后，可W评估 百分比氨基酸同一性。用于ClustalW比对分析的软件程序的非限制性实例是GE肥DOC?。 GE肥DOC?化arl Nicholas)允