许评估多个蛋白质间的氨基酸（或DM)相似性和同一性。 用于进行序列比较的数学算法的另一个非限制性实例是Myers和Miller (1988)CABI0S 4:11-17的算法。运种算法已并入ALIGN程序（2.0版），其是GCG Wisconsin Genetics Software F*ackage,版本 10 (可从 Accelrys, Inc. ,9685Scranton Rd., San Diego, CA, USA 获得）的部分。当用ALIGN程序进行氨基酸序列比较时，可W使用PAM120权重余数表 (wei曲t residue t油le)，缺口长度罚分12和缺口罚分4。
[002引除非另作说明，将使用W下参数，用GAP版本10 (其使用化edleman和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3) : 443-453的算法）来测定序列同一性或相似性：核巧酸 序列的％同一性和％相似性使用缺口权重（GAP Wei曲t) 50和长度权重3和nwsgap化a. cmp 评分矩阵；氨基酸序列的％同一性或％相似性使用缺口权重8和长度权重3和化0SUM62评 分程序。还可W使用等同的程序。"等同的程序"指任意序列比较程序，其为所讨论的任意 两条序列产生运样的比对，当与由GAP Version 10产生的对应的比对相比时，该比对具有 相同的核巧酸残基匹配和相同的百分比序列同一性。本发明还包含变体核酸分子。5-内 毒素编码核巧酸序列的"变体"包含编码本文所公开的5-内毒素蛋白质，但由于遗传密码 的简并性而保守地不同的那些序列，W及如上文所讨论的几乎相同的那些序列。可W用熟 知的分子生物学技术，如下文概述的聚合酶链反应（PCR)和杂交技术来鉴定天然存在的等 位变体。变体核巧酸序列还包含合成衍生的核巧酸序列，其通过例如使用位点定向诱变产 生，但其仍按下文所讨论编码本发明中公开的5-内毒素蛋白质。本发明所包含的变体蛋 白质是有生物学活性的，即它们继续保持所希望的天然蛋白质的生物学活性，即保留杀虫 活性。"保留活性"是指变体可具有至少约30%、至少约50%、至少约70%或至少约80%天 然蛋白质的杀虫活性。测量杀虫活性的方法为本领域熟知。见例如Czapla和Lang(1990) J. Econ. Elntomol. 83:2480-2485 ;An化ews 等（1988) Biochem. J. 252:199-206 sMarrone 等 (1985) J. of Economic 化tomology78:290-293 ;和美国专利号5, 743, 477,所有文献在此完 整引入作为参考。
[0029] 熟练的技术人员可进一步理解，可W通过本发明的核巧酸序列的突变来引入改 变，从而在不改变蛋白质生物学活性的情况下导致所编码的5-内毒素蛋白质氨基酸序列 中的改变。因此，可W通过将一个或多个核巧酸取代、添加或缺失引入本文所公开的对应核 巧酸序列来产生分离变体的核酸分子，W便将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入所 编码的蛋白质。可W通过标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变引入突变。运类变 体核巧酸序列也包含于本发明。
[0030] 例如，可W在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处产生保守氨基酸取代。"非必 需"氨基酸残基是可W在不改变生物学活性的情况下从5-内毒素蛋白质的野生型序列 改变的残基，而"必需"氨基酸残基为生物学活性所需。"保守氨基酸取代"是用具有相似侧 链的氨基酸残基取代该氨基酸残基的取代。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残 基的家族。运些家族包含具有碱性侧链（例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如 天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（例如甘氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、丝氨酸、苏氨 酸、酪氨酸、半脫氨酸）、非极性侧链（例如丙氨酸、鄉氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙 氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、P分支（P-branched)侧链（例如苏氨酸、鄉氨酸、异亮氨酸） 和芳香族侧链（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。
[0031] 5-内毒素一般具有5个保守序列域和3个保守结构域（见例如de Maagd等 (2001)Trends Genetics 17:193-199)。第一个保守结构域由7个a螺旋组成并设及膜插 入和管孔形成。结构域II由W希腊钥匙构型排列的3个P-片层组成，而结构域III由" 薄卷饼"型的两个反平行P -片层组成（de Maagd等，2001，上文）。结构域II和III设 及受体识别和结合，并因此认为它们是毒素特异性决定子。
[0032] 可W在保留功能的非保守区域中进行氨基酸取代。一般，不对保守氨基酸残基或 处于保守基序内的氨基酸残基进行运类取代，其中运类残基是蛋白质活性必需的。保守且 可W为蛋白质活性必需的残基实例包含，例如，包含于本发明的氨基酸序列比对中的所有 蛋白质和已知的5-内毒素序列间相同的残基。保守但可W允许保守氨基酸取代且仍保留 活性的残基的实例包含，例如，在包含于本发明的氨基酸序列比对中的所有蛋白质和已知 的5-内毒素序列间仅具有保守取代的残基。但是，本领域技术人员应理解，功能性变体可 W在保守残基中具有较少的保守或非保守改变。
[0033] 备选地，可W通过沿全部或部分编码序列随机引入突变，如通过饱和诱变来产生 变体核巧酸序列，并可W针对赋予5-内毒素活性的能力筛选产生的突变体来鉴定保留活 性的突变体。诱变后，可W重组表达所编码的蛋白质，并可W用标准测定技术测定蛋白质的 活性。
[0034] 可W用如PCR、杂交等的方法鉴定对应的5-内毒素序列，运类序列与本发明 的序列具有基本的同一性。见例如Sambrook和Russell (2001)Molecula;r Cloning:A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY) 和 Innis 等(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press, NY) 〇
[0035] 在杂交法中，可W用全部或部分5-内毒素核巧酸序列来筛选cDNA或基因组 文库。构建运类cDNA和基因组文库的方法一般为本领域已知并公开于Sambrook和 Russell, 2001，上文中。所谓的杂交探针可W是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其 他寡核巧酸，并可W用可检测基团如 3中或任意其他可检测标记，如其他放射性同位素、巧 光化合物、酶或酶辅因子标记。可W根据本文所公开的已知的5-内毒素编码核巧酸序列， 通过标记合成的寡核巧酸来产生用于杂交的探针。此外，可W使用根据核巧酸序列或所编 码的氨基酸序列中的保守核巧酸或氨基酸残基设计的简并引物。探针通常包含在严格条件 下与本发明的5 -内毒素编码核巧酸序列或其片段或变体的至少约12、至少约25、至少约 50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400个相邻核巧酸杂交的核巧酸序列区域。 用于制备杂交探针的方法一般为本领域已知并公开于Sambrook和Russell, 2001,上文中， 其在此引用作为参考。
[0036]例如，可W将本文所公开的整个5 -内毒素序列或其一个或多个部分用作能够特 异性地与对应的5-内毒素样序列和信使RNA杂交的探针。为了在各种条件下达到特异性 杂交，运类探针包含独特且优选长度为至少约10个核巧酸或长度为至少约20个核巧酸的 序列。可W用运类探针通过PCR从所选择的生物体扩增对应的5-内毒素序列。该技术可 W用来从所希望的生物体分离其他编码序列或作为诊断测定来测定编码序列在生物体中 的存在。杂交技术包含涂布DNA文库的杂交筛选（隧斑或菌落；见例如Sambrook等（1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第二片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。
[0037] 运类序列的杂交可W在严格条件下进行。"严格条件"或"严格杂交条件"是指运样 的条件，在该条件下，探针可与其祀序列杂交至高于与其他序列的杂交的可检测程度（例 如超过背景至少2倍）。严格条件是序列依赖性的且在不同环境中可不同。通过控制杂交 和/或洗涂条件的严格性，可W鉴定与探针100 %互补的祀序列（同源探测）。备选地，可W 将严格性条件调整为允许序列中的一些错配，W便于检测较低程度的相似性（异源探测）。 一般，探针长度小于约1000个核巧酸，优选长度小于500个核巧酸。
[0038] 通常，严格条件可W是运样的条件：在抑7. 0至8. 3,盐浓度低于约1. 5M钢离子， 通常为约0. 01至1. 0M钢离子浓度（或其他盐类），溫度对短探针（例如10至50个核巧 酸）为至少约30°C，对长探针（例如大于50个核巧酸）为至少约60°C。还可W用去稳定剂 如甲酯胺的加入达到严格条件。示例性低严格性条件包含在37°C下用30-35%甲酯胺、1M 化C1、1%SDS (十二烷基硫酸钢）的缓冲液杂交，并在50-55°C下在IX至2X SSC(20X SSC =3. 0M化C1/0. 3M巧樣酸S钢）中洗涂。示例性中等严格性条件包含在37°C下在40-45% 甲酯胺、1.0M NaCl、l%SDS中杂交，并在55-60°C下在0. 5X至IX SSC中洗涂。示例性高 严格性条件包含在37°C下在50%甲酯胺、1M化Cl、l% SDS中杂交，并在60-65°C下在0.1 X SSC中洗涂。可选地，洗涂缓冲液可W包含约0. 1 %至约1% SDS。杂交时间一般少于约24 小时，通常为约4至约12小时。
[0039] 特异性通常是杂交后洗涂的函数，临界因子是最终洗涂溶液的离子强度和溫度。 对于 DNA-DNA 杂种，可 W从 Meinkoth 和 W址 1 (1984) Anal. Biochem. 138:267-284 的方程得 出近似1"值：1'。=81.51：+16.6(1〇邑1)+0.41(%0〇-0.61(%甲酯胺）-500/1;其中1是单 价盐离子的体积摩尔浓度，％ GC是DNA中鸟巧和胞喀晚核巧酸的百分比，％甲酯胺是杂 交溶液中甲酯胺的百分比，L是W碱基对计的杂化物的长度。Tm是在该溫度下50%互补祀 序列与完全匹配的探针杂交的溫度。对每1 %的错配，Tm降低约rC ;因此，可W调节Tm、杂 交和/或洗涂条件来与具有所希望的同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有> 90%同一 性的序列，可W将Tm降低10°C。一般，在给定的离子强度和抑下，选择严格条件为比特定 序列和它的互补序列的热烙点（thermal melting point，Tm)低约5°C。但是，极严格条件 可W利用比热烙点（Tm)低1、2、3或4°C下的杂交和/或洗涂；中等严格条件可W利用比热 烙点（Tm)低6、7、8、9或10°C下的杂交和/或洗涂；低严格性条件可W利用比热烙点（Tm)低 11、12、13、14、15或20°(：下的杂交和/或洗涂。普通技术人员可理解，利用该方程、杂交和 洗涂组合物和所希望的Tm，隐喻了杂交和/洗涂溶液的严格性中的变化。如果所希望的错 配程度导致低于45°C (水性溶液）或32°C (甲酯胺溶液）的Tm，则优选提高SSC浓度，使 得可W使用较高的溫度。核酸杂交的大量指导见于Tijssen(1993)L油oratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, 第 I 部分，第 2 章巧Isevier,纽约）；和 Ausubel 等，编辑（1995)Qi;rrent Protocols in Molecular Biology,第 2 章（Greene Publishing and Wiley-Interscience,纽约）中。见 Sambrook等（1989)Molecular Cloning:A L油oratory Manual(第 2 版，冷泉港实验室出 版社，冷泉港，纽约（Cold Spring 化rbor L油oratory Press, Cold Spring 化rbor,化W York))〇
[0040] 分离的帝白质及其巧体巧片段
[0041] 5-内毒素蛋白质也包含于本发明内。"5-内毒素蛋白质"是指具有SEQ ID N0:61-121和133-141中所示的氨基酸序列的蛋白质。还提供其片段、生物学活性部分和变 体，且其可W用来实施本发明的方法。
[0042]"片段"或"生物学活性部分"包含含有与SEQ ID N0:61-121和133-141的任一项中 所示的氨基酸序列几乎相同的氨基酸序列并显示杀虫活性的多肤片段。5-内毒素蛋白质 的生物学活性部分可W是长度为例如1〇、25、50、100或更多个氨基酸的多肤。可W通过重 组技术制备运类生物学活性部分并评估其杀虫活性。测量杀虫活性的方法为本领域熟知。 见例如 Czapla 和 Lang (1990) J. Econ. Elntomol. 83:2480-2485 ;An化ews 等（1988) Biochem. J. 252:199-206 ;Marrone 等（1985) J. of Economic 化tomology 78:290-293;和美国专利 号5, 743, 477,所有文献在此完整引入作为参考。如此处所用，片段包含SEQ ID NO:61-121 和133-141的至少8个邮连氨基酸。但是，本发明包含其他片段，如大于约10、20、30、50、 100、150、200、250、300、350、400、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、 1000、1050、1100、1150、1200、1250或1300个氨基酸的蛋白质中的任意片段。
[0043]"变体"是指与SEQ ID N0:61-121和133-141中任一项的氨基酸序列具有至少约 60%、65%、约70%、75%、约80%、85%、约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%相同的氨基酸序列的蛋白质或多肤。变体还包含由在严格条件下与SEQ ID NO: 1-60 和124-132的核酸分子杂交的核酸分子或其互补分子编码的多肤。变体包含由于诱变而 在氨基酸序列中不同的多肤。本发明所包含的变体蛋白质是有生物学活性的，即它们继续 保持所希望的天然蛋白质的生物学活性，即保留杀虫活性。测量杀虫活性的方法为本领域 熟知。见例如 Czapla 和 Lang (1990) J. Econ. Elntomol. 83:2480-2485 ;An化ews 等（1988) Biochem. J. 252:199-206 sMarrone 等（1985) J. of Economic Elntomology 78:290-293 ;和 美国专利号5, 743, 477,所有文献在此完整引入作为参考。
[0044] 细菌基因，如本发明的axmi基因常在靠近可读框起点处具有多个甲硫氨酸起始 密码子。通常，在一个或多个运些起始密码子处的翻译起始可导致功能性蛋白质的产生。运 些起始密码子可W包含ATG密码子。但是，细菌如芽抱杆菌属物种度acillusSP.)还将密 码子GTG识别为起始密码子，在GTG密码子处起始翻译的蛋白质在第一个氨基酸处包含甲 硫氨酸。此外，通常不确定运些密码子中的哪一个是细菌中天然优先使用的。因此，据理解， 备选甲硫氨酸密码子之一的使用也可W导致编码杀虫活性的5-内毒素蛋白质的产生。运 些5-内毒素蛋白质包含于本发明中并可W用于本发明的方法。
[0045] 针对本发明的多肤或针对其变体或片段的抗体也涵盖于本发明。产生抗体的方法 为本领域熟知（见例如 Harlow 和 Lane (1988) Antibodies:A L油oratory Ma