一种抑制survivin基因表达的siRNA分子及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明公开一种抑制survivin基因表达的双链siRNA分子，同时还提供了 siRNA 分子的医用用途，属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤严重威胁着人类的生命健康，其死亡率仅次于屯、脑血管疾病；尽管各种 的治疗方法不断出现，但目前还没有找到真正有效的根治方法，肿瘤的治疗一直是长期困 扰医学界的世界性难题。逃避调亡是所有肿瘤的特征，它使得肿瘤细胞在异常生长刺激下 存活，并抵抗化疗和放疗。抗调亡蛋白survivin通过与调亡信号作用成为新的最有潜能的 治疗祀标来抑制肿瘤细胞的生长。
[0003] RNA干扰（RNA interference, RNAi)现象是一种在进化上保守的抵御转基因或外 来病毒侵犯的防御机制，是一种序列特异性的转录后基因沉默。具体是指双链RNA(double strand RNA, dsRNA)指导的，在特定酶参与下，W外源或内源mRNA为降解目标，在转录后水 平上使特异性祀基因发生的沉默现象，即基因沉默。该项技术的发现为疾病治疗尤其是癌 症的治疗开辟了全新的途径，为科研工作者提供了一个全新的基因治疗理念。应用RNA干 扰技术，用祀向至是survivin基因的SiRNA作为祀向药物，在基因的转录后进行干扰，从而 诱导肿瘤细胞调亡，抑制肿瘤细胞的有丝分裂，抑制肿瘤转移时的血管形成和降低肿瘤细 胞放化疗的耐受性，对肿瘤进行抑制，在不久的将来可能成为一种新的肿瘤治疗方法。
【发明内容】
阳004] 本发明公开一种抑制survivin基因表达的双链siRNA分子及其医用用途，是一种 新的SiRNA序列，可W抑制肿瘤细胞的增殖和转移。 阳0化]本发明所述的双链siRNA分子，其特征在于一种高效祀向survivin基因的广谱双 链的小分子干扰RNA (SiRNA)，由下述核巧酸序列的正义链的和反义链组成：
[0006] 正义链 5 ' -CGGCUGUUCCUGAGAAAUATT-3 '(沈Q ID N0:1)
[0007] 反义链 5 ' -UAUUUCUCAGGAAGAGCCGAG-3 ' (SEQ ID N0:2)
[000引根据本发明的另一方面，本发明还提出了一种双链SiRNA分子，由下述核巧酸序 列的正义链的和反义链组成：
[0009] 正义链 5 ' -CGGCUGUUCCUGAGAAAUATTXX-3 '(沈Q ID N0:3)
[0010] 反义链 5 ' -UAUUUCUCAGGAAGAGCCGAGYY-3 '(沈Q ID N0:4) W11] 其中，XX和YY各自独立的选自tt、TT或UU，t代表脱氧胸腺喀晚核糖核巧酸，T 代表胸腺喀晚核糖核巧酸，U代表尿喀晚核糖核巧酸。 阳〇1引优选的，XX为tt、YY为tt，即所述双链SiRNA分子，由下述核巧酸序列的正义链的 和反义链组成：
[0013] 正义链 5 ' -CGGCUGUUCCUGAGAAAUATTtt-3 '(沈Q ID N0:5)
[0014] 反义链 5 ' -UAUUUCUCAGGAAGAGCCGAGtt-3 '(沈Q ID N0:6)
[0015] 本发明所述的双链siRNA分子的主干序列即为沈Q ID NO :1和沈Q ID NO :2所示 的核巧酸序列，即前面所述的正义链和反义链分别具有SEQ ID N0:1和2所示的核巧酸序 列的双链分子。
[0016] 本发明的siRNA分子来源于针对survivin基因开放阅读框的功能保守区而制备 的siRNA分子库，其优点在于所制备的siRNA随机分布于survivin基因开放阅读框区段， 长度可控性分布于19-23bp，可W提高有效祀点的命中率。
[0017] 本发明还提出了一种SiRNA表达质粒，所述SiRNA表达质粒包含前面所述的任意 一种双链SiRNA分子的序列。由此，利用所述SiRNA表达质粒转染动物细胞，能够有效的沉 默surivivin基因，进而诱导细胞调亡、抑制肿瘤细胞分裂、抑制肿瘤血管的生成，从而能 够有效的治疗肿瘤。进一步，该SiRNA分子与SiRNA表达质粒能够有效的用于抗肿瘤药物 的制备，从而利用制备的抗肿瘤药物对患者进行给药，有效的治疗肿瘤。
[0018] 根据本发明还提出了一种survivin基因沉默试剂盒，所述试剂盒包含前面所述 的任意一种双链SiRNA分子或SiRNA表达质粒。利用本发明的试剂盒能够有效的将肿瘤患 者的细胞进行survivin基因沉默，从而能够有效的治疗肿瘤。
[0019] 本发明的SiRNA分子可W作为抗肿瘤药物的有效成分，肿瘤疾病包括乳腺癌、肺 癌、肝癌、白血病、胃癌、宫颈癌、膀脫癌、皮肤鱗癌、口腔上皮癌、结直肠癌、膜腺癌、多发性 骨髓瘤、前列腺癌、黑色素瘤或骨肉瘤。
[0020] 因而，根据本法明的又一方面，本发明还提出了前面所述的任意一种双链SiRNA 分子、或者SiRNA表达质粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0021] 本发明的药物的剂型可W为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地 保持SiRNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可W是冻干粉。
[0022] 任选地，上述药物剂型中可W包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应 的给药体系、并且恰当地保持SiRNA分子的活性。
[0023] 本发明的积极效果在于：提供了一种新的高效祀向survivin基因的广谱双链的 小分子干扰RNA(SiRNA)，同时还公开了其在制备抗肿瘤药物中的用途。
【附图说明】
[0024] 图1是化学合成的SiRNA转染两种细胞后实时定量PCR检测survivin mRNA表达 量柱形图，纵坐标表示survivin相对于GAPDH的mRNA表达水平；横坐标表示四个处理实验 组，分别为未转染的细胞组，转染阴性SiRNA对照组，转染实验包括两个SiRNA浓度，分别为 lOnM 和 20nM。 阳0巧]图2是Western Blot检测siRNA转染MDA-MB-231细胞、Hela细胞、A549细胞和 化pG2细胞后的survivin蛋白表达量。NT为NT-siRNA组，邸为实验组。
【具体实施方式】
[00%] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。运些实施例 只用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0027]实施例1:化学合成的SiRNA对survivin基因沉默效果的检测实验 [002引 1.主要仪器、试剂和材料.
[0029] 1. 1仪器：核酸合成仪师公司）、PCR仪（ABI公司）；实时定量PCR仪度io-Rad); 细胞培养箱灯hermo)等。
[0030]1. 2 材料和试剂：RNAiMAX? (invitrogen)，DMEM培养基（Gibco)，
[0031]l'u;rboCap1:ure mRNA kit (QIAGEN)，SensiMix? one-step Kit (如antace)等。其 他生化试剂均购于上海生工生物工程技术服务有限公司。
[00巧 1. 3PCR引物（百奥迈科生物技术有限公司合成）：
[0033] survivin 正向引物：5 ' -AGAACTGGCCCTTCTTGGAGG-3 '
[0034] survivin 反向引物：5 ' -CTTTTTATGTTCCTCTATGGGGTC-3 '
[0035] GAP畑正向引物；5 ' -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 '
[0036] GAPDH 反向引物：5 ' -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 '
[0037] 2.化学合成 siRNA 阳038] 根据survivin基因