专利名称：一种蓖麻毒素的胶体金检测试纸及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，具体涉及蓖麻毒素的检测试纸及其制备方法和在检测蓖麻毒素中的应用。
背景技术：
蓖麻毒素存在于蓖麻籽(Ricin toxin)中，由A、 B两条肽链通过二硫键连接而成。其中，A链为效应链，具有糖苷酶活性，能使核糖体失活；B链为结合链，拥有半乳糖结合位点。蓖麻毒素毒性很大小鼠的LD50为6. 38pg/kg，成年人摄入的致死剂量为5. 0jug/kg~7. OMg/kg,性质稳
定，且来源较广，提取成本低廉，已多次在恐怖袭击中使用，具有一定的潜在军事应用价值。
国内已经建立了胶体金免疫层析技术对蓖麻毒素的检测，但并未能实现半定量检测，目前国内的半定量检测蓖麻毒素的方法多以酶联免疫吸附法(Enzyme-1 inked immunosorbent assay, ELISA)为主，ELISA法孵育时间长，不适合作为现场检测。上述方法已经满足不了当代防恐需要，迫切需要可以现场、快速、定量检测蓖麻毒素的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种方便、快捷地检测蓖麻毒素的试纸，可利用金标免疫分析仪进行的半定量检测方法。该试纸的工作原理是利用特异性抗原-抗体的结合，用胶体金标记抗体，与待检抗原结合后，使与试纸结合的捕获抗体显色。本发明还涉及制备上述检测试纸的制备方法。本发明能够基于一份标本和一个试纸，快速方便地检测出标本中的蓖麻毒素，节省了大量人力物力，方便、快速、简捷。
本发明涉及一种方便、快捷地检测蓖麻毒素的检测试纸，它包含(1)反应支持物；(2 )吸水垫；(3) 硝酸纤维膜，该膜包被有兔抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体检测条带和质控羊抗鼠IgG的质控条带；
(4) 金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的鼠抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体。
其中的羊抗鼠IgG可购自鼎国生物技术有限公司。
另外，金标抗体保护膜标记的是鼠抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体。质控用的是羊抗鼠IgG,这是一种很普遍的抗体。羊抗鼠IgG是本领域常用的一种普遍的二抗。
兔抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体可以来自军科院微生物所，例如，参见郝兰群，郭胜清，郭振泉，等.抗蓖麻毒素单克隆抗体的制备及应用[J].细胞与分子免疫学杂志，2003， 19(5): 517-518。
本发明涉及的上述蓖麻毒素的检测试纸，它还包含样品垫，该样品垫的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。
本发明涉及的上述蓖麻毒素的检测试纸，其中反应支持物选用PVC板。
本发明涉及的上述蓖麻毒素的检测试纸，其中吸水垫选用滤纸。
本发明涉及的上述蓖麻毒素的检测试纸，其中金标抗体保护膜选用聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，其上均匀涂布有胶体金标记的鼠抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体。
另一方面，本发明涉及的上述蓖麻毒素的检测试纸，其中吸水垫、硝酸纤维膜、金标抗体保护膜、样品垫和反应支持物按照附图1所示方式构成；反应支持物5位于底层，硝酸纤维膜2位于反应支持物5上的中部，该膜的T处是兔抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体包被的检测条带，并且C处是羊抗鼠IgG包被的质控条带；金标抗体保护膜3位于硝酸纤维膜上部的一侧并与之部分重叠，该膜含有胶体金标记的鼠抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体；吸水垫1位于硝酸纤维膜2上部的相对于3而言的另一側并与2部分重叠；样品垫4位于2上与1相反的一侧并与3部分重叠。
又一方面，本发明涉及的上述蓖麻毒素的检测试纸，以吸水垫一側为起始端，样品垫一側为末端，兔抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体的检测条带位于接近末端，羊抗鼠IgG包被的质控条带接近于起始端。(？请申 请人给出记载该抗体的文献，至于"纯化方法，，视情况可作为优选方案 或具体方案撰写)
本发明涉及一种制备上述检测试纸的制备方法，该方法包括 (1)用隔流喷金划线机以一定喷膜速度喷涂抗蓖麻毒素抗体和质控抗体 两个条带的硝酸纤维膜；(2 )制备一种含有胶体金标记的抗重组蓖麻毒 素抗体的金标抗体保护膜，将胶体金标记的抗重组蓖麻抗体均匀涂布在 玻璃纤维膜上，并烘干或冷冻干燥，制成金标抗体保护膜。
本发明所述的制备方法，该喷涂包被膜的步骤中，喷膜速度优选是 10 - 100mm/s。所述兔抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体，其加入量为 l-5mg/ml，该多克隆抗体的稀释液可以为5mMPBS。质控羊抗鼠IgG的浓 度为0. 1-5 mg/ml。该方法将胶体金标记的兔抗重组蓖麻毒素A链多克隆 抗体均匀涂布在玻璃纤维膜上，其中pH为7 - 9。
本发明提供上述试纸在检测蓖麻毒素中的应用，其中包括将待测标 本与样品稀释液混匀，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液
体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果。
本发明再一个目的是提供制备所述检测蓖麻毒素的试纸的方法，该 方法包括以下步骤胶体金探针的制备，金标抗体保护膜的制备，硝酸 纤维膜的喷涂包被。 1、胶体金探针的制备
(1)将HAuCl4先配制为0. 01°/。水溶液。磁力搅拌下准确加入l ml 1% 的HAuCl4，同时加入l. 5-3ml 1%的柠檬酸三钠水溶液。颜色稳定后继续加 热，冷却至室温后加纯水补足至IOO ml， 4'C避光保存。
(2 )用K2C03调PH值为约7-9,优选为约7. 8 - 8. 9，更优选约8. 0-8. 2。
(3)将胶体金调至pH 8.0-8.2，，用5 mM PB (pH 7.2)稀释抗 体至O. 2 mg/ml。
(4 )保持胶体金稳定。
本发明还在于提供一种获得维持胶体金稳定的抗体最佳标记剂量的 方法，该方法包4舌
a. 取10支洁净的1，5 ml离心管，分别加入胶体金溶液lml。
b. 在l-10号管内分别加入IO pl、 20 pl、 30 pl、 40 pl、 50 pl、60 pl、 70 pl、 80 pl、 90 pl、 100 pl的5 mM PBS，再依次加入稀IW 的O. 2 mg/ml的待标记抗体90 pl、 80 pl、 70 jil、 60 pl、 50 pl、 40 pl、 30 pl、 20 pl、 10 nl、 0混匀，静置2分钟。
c.在10个管内分别加入10y。 NaCl溶液IOO pl，混匀后室温静置2小 时，观察颜色变化。
未加抗体及加入量不足以稳定胶体金的试管中的液体颜色呈现由红 变蓝的变化，而加入抗体量达到或超过最低稳定剂量的试管则保持红色 不变。与对照管(1号管)相比，颜色最接近、含抗体剂量最低的试管 所含的抗体剂量，即为l ml胶体金所必须的抗体稳定剂量，在此基础上 再加20%抗体，即为抗体最佳标记剂量。本发明经过反复试验和分析，得 出的结果表明维持胶体金溶液适宜抗体量为8-15 ug，优选抗体量IO -12 ug，更优选IO. 5-12. 0 ug，最优选为12ug。
2、 金标抗体保护膜的制备
取上述pH的胶体金以lml/管分装于1. 5 ml的离心管中。每支管中加 入12ug的抗体，轻摇混匀后放置。每管中加入10。/。的BSA100 pl，混匀放 置。将上面初步制得的胶体金探针在12000 rpm、 4。C下离心30分钟，弃 上清液。每支离心管中加入l ml重悬液悬浮沉淀后同上离心。弃上清液， 管底得到暗红色的疏松状沉淀，加入500 pl重悬液重悬后于4 。C， 1000 rpm，离心10分钟；取上清液，均匀滴加在lcm宽的玻璃纤维上，37。C干 燥。
3、 硝酸纤维膜的喷涂包被
(1) 利用隔流喷金划线机以50mm/s的喷膜速度包被兔抗重组蓖麻 毒素A链多克隆抗体和质控羊抗鼠IgG两个条带的硝酸纤维膜。
在该喷涂包被膜的步骤中，喷膜速度优选是10-100mm/s，更优选是 45 - 55mm/s，最优选是50mm/s;所述兔抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体， 其加入量为l-5mg/ml,该多克隆抗体的稀释液可以为5mM PBS;质控羊 抗鼠IgG可以购自鼎国生物技术公司，其浓度为0. 1-5 mg/ml更优选是 0. 5-2. 5 mg/ml，最优选为lmg/ml。
(2) 制备一种含有胶体金标记的的玻璃纤维膜，将胶体金标记的鼠 抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体均匀涂布在玻璃纤维膜上。抗体用5mMPBS稀释，pH为7-9,优选7. 5-9,最适PH值为8. 5。
本发明还公开了所述试纸在检测蓖麻毒素中的应用，参见附图2。 在本发明检测蓖麻毒素的方法中，先将待测标本放入装有稀释液的 小瓶内，再用移液器将样品混合液加入试纸"4"处(即末端)，样品中 的液体依靠虹吸作用上行， 一般需10-15分钟判读结果
如标本中含有蓖麻毒素，则它将与试纸上M^体金标记的鼠抗重组蓖 麻毒素A链多克隆抗体形成相应的复合物，液体展开上行并与硝酸纤维 膜上的兔抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体结合，形成红色线条，即在"T" 处形成红色条带。
无论是否含有相对应的毒素，胶体金标记多克隆抗体继续随液体继 续上行并与该膜上的羊抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在"C"处形成红色 条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸失效。
阳性结果会出现2条红色沉淀线，阴性结果出现1条红色沉淀线， 如不出现线条说明试纸失效。还可利用金标免疫分析仪进行半定量枱，测。
本发明的技术方案是采用纯化的兔抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗 体、和羊抗鼠IgG分别固相于硝酸纤维膜上，结合胶体金标记的鼠抗重 组荒麻毒素A链多克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法的原理检测标本 中的蓖麻毒素。
图1A本发明试纸的正面示意图。 图1B本发明试纸的側面示意图。
其中，图1A和1B: 1:吸水垫；2:》肖酸纤维膜(T:包^:兔抗重组 蓖麻毒素A链多克隆抗体检测条带；C:包被羊抗鼠IgG的质控条带)； 3:含有胶体金标记鼠抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体多克隆抗体的玻璃 纤维膜；4:样品垫；5:反应支持物。
图2:检测结果示意图；T、 C两条线阳性；C一条线阴性；无效。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
9实施例l、检测蓖麻毒素的胶体金试纸的制备
1、 胶体金探针的制备
(1)将HAuCl4先配制成0. 01%水溶液，取100ml纯水加热至沸腾。》兹力 搅拌下准确加入l ml l"/。的HAuCl4，同时加入1.5 ml质量分凄t为P/。的柠檬 酸三钠水溶液。颜色稳定后继续加热煮沸15分钟，冷却至室温后加纯水 补足至100ml， 4'C避光保存。
(2 ) LC03调PH值为8. 0-8. 5左右。
(3)将胶体金调至适宜的pH,优选8.0-8.5，更优选8.2，用5mM PBS (pH 7. 2)稀释抗体至O. 2 mg/ml。
2、 金标抗体保护膜的制备
取pH 8. 2的胶体金以lml/管分装于1. 5 ml的离心管中。每支管中加 入最佳标记剂量的抗体，轻摇混匀后放置5分钟或稍长，此步为抗体与月交 体金颗粒结合。每管中加入10。/。的BSA100 混匀放置15分钟或稍长， 此步为封闭。将上面初步制得的胶体金探针以12000 rpm，离心30分钟， 4 。C，弃上清液。每支离心管中加入l ml重悬液悬浮沉淀后同上离心。弃 上清液，留下管底暗红色疏;^状沉淀，加入500 nl重悬液重悬后于4 。C， 1000 rpm，离心10分钟；取上清液，均匀的滴加在lcm宽的玻璃纤维上， 37°干燥2. 5-3小时。
3、 硝酸纤维膜的喷涂包被
(1)利用隔流喷金划线机以50mm/s的喷膜速度包被兔抗重组蓖麻 毒素A链多克隆抗体(lmg/ml含有1.5。/。BSA)和质控羊抗鼠IgG (购自鼎 国生物技术公司，lmg/ml)两个条带的硝酸纤维膜；
(2 )含有胶体金标记鼠抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体12ug的玻 璃纤维膜，5mMPB稀释；最适PH值为8.2
实施例2、 蓖麻毒素检测试纸
参见图1,反应支持物为6. 2cm x 0. 4cm PCV板；吸水垫为2cm x 0. 4cm的滤油纸；1. 8cm x 0. 4cm的硝酸纤维膜依次包纟皮羊抗鼠IgG (购 自鼎国生物技术公司，lmg/ml )，兔抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体lmg/ml (含有1. 5%BSA封闭剂)，含有0. 4cm x 0. 4cm胶体金标记的鼠抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体(标金浓度12ug/ml5mM PB稀释；最适PH值 为8. 2)玻璃纤维膜；样品垫为2. 7cm x 0. 4cm的玻璃纤维膜；即形成 了蓖麻毒素检测试纸。
实施例3、检测方法
参见附图2，将待测标本与样品稀释液混匀，再用移液器将样品混合 液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判 读结果
如含有蓖麻毒素，则与试纸上胶体金标记的鼠抗重组蓖麻毒素A链 多抗形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的流兔抗重组蓖麻 毒素A链多抗结合，形成红色线条，即在"T，，处形成红色条带。
无论是否含有相对应的毒素，胶体金标记多抗继续向上流动与包被 在膜上的羊抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在"C"处形成红色条带。此线 是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸失效。
阳性结果会出现2条红色沉淀线，阴性结果出现1条红色沉淀线， 如不出现线条说明试纸失效。
实施例4、采用DJM-3定量金标免疫分析仪半定量检测
1、 可先用检测法检测蓖麻毒素试纸条20个阴性值，利用金标仪检测试 其T/C的比值平均计算出蓖麻毒素试纸条的定阈值。
2、 其次利用定阈值来用金标仪机器检测蓖麻毒素试纸条能达到的最低浓 度。
3、 判读结果时大于或等于定阈值为阳性，小于定阈值为阴性。
检测蓖麻毒素标准品各个浓度下，判定值(CUT-0FF )为O. 037的T/C 读值(表l )。每个浓度检测两次取平均值。可见，0. 925pg /ml ~ 14. 8ng/ml 结果为阳性;检测灵敏度为O. 925pg/ml。
ii表l 蓖麻毒素试纸条不同浓度样品半定量检测结果
样品浓度检测值T (V)质控值C (V)T/C结果
TjT2c2T/CiT/C2T/C平判读
00.0110.0071.11.1010.0100—
0.925ng/ml0.1280.0130.5500.7230. 230.010.012+
1.85pg/ml0.0260.0220.67O馬0.030.040.035+
3.7ng/ml0.0250.0260.5230.5220.040.050.05+
7.4ng/ml0.0320.0330.6170.5540.050.060.055+
14.8ng/ml0.0540.0560.7290.6800.070.080.075+
本发明所述的试纸可以配合小型仪器进行半定量检测，不需专业培 训，结果清晰易辨并能客观保存数据，操作简单，易于推广，适合基层， 适合于突发事件的现场检测，适合流行病学调查，并对蓖麻毒素的感染 诊断起到辅助作用。
权利要求
1、一种检测试纸，其特征在于，它包含(1)反应支持物；(2)吸水垫；(3)硝酸纤维膜，该膜包被有重组蓖麻毒素A链抗体和质控抗体的检测条带和质控条带；(4)金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的重组蓖麻毒素A链抗体。
2、 根据权利要求1所述的试纸，其中，它还包含样品垫，该样品垫的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。
3、 根据权利要求1所述的试纸，其中，所述吸水垫选用滤纸；所述反应支持物选用PVC板；所述金标抗体保护膜的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，其上均匀涂布有胶体金标记的抗体。
4、 根据权利要求3所述的试纸，其中，所述金标抗体保护膜由将胶体金标记的鼠抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体均匀涂布在聚脂膜、玻璃纤维膜或滤纸纤维膜上来制成。
5、 根据权利要求l-4任一项所述的试纸，其中，所述反应支持物(5)位于底层，硝酸纤维膜(2)位于反应支持物(5)上的中部，该膜的T处是兔抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体包被的检测条带，并且C处是羊抗鼠IgG包被的质控条带；金标拔体保护膜(3 )位于硝酸纤维膜上部的一侧并与之部分重叠，该膜含有胶体金标记的鼠抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体；所述吸水垫(1)位于硝酸纤维膜(2 )上部的相对于金标抗体保护膜(3 )而言的另一側并与硝酸纤维膜(2 )部分重叠；所述样品垫(4 )位于硝酸纤维膜(2 )上与吸水垫(1)相反的一侧并与金标抗体保护膜(3)部分重叠。
6、 根据权利要求5所述的试纸，其中，所述吸水垫一侧为起始端，所述样品垫一侧为末端，所述检测抗体的条带位于接近末端，所述质控条带接近于起始端。
7、 根据权利要求5所述的试纸，其中，所述蓖麻毒素的抗体可以是兔抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体；所述质控抗体根据金标抗体的免疫源可选羊抗鼠IgG。
8、 根据权利要求5所述的试纸，其中所述兔抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体标记lml胶体金的量为8-15 ug。
9、 一种制备权利要求1-8任一项所述的炭疽芽孢杆菌的检测试纸的制备方法，该方法包括(1)用隔流喷金划线机以一定喷膜速度喷涂抗蓖麻毒素抗体和质控抗体两个条带的硝酸纤维膜；(2 )制备一种含有胶体金标记的抗重组蓖麻毒素抗体的金标抗体保护膜，将胶体金标记的抗重组蓖麻抗体均匀涂布在玻璃纤维膜上，并烘干或冷冻干燥，制成金标抗体保护膜。
10、 根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，该喷涂包^皮膜的步骤中，喷膜速度优选是10-100mm/s。
11、 根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述兔抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体，其加入量为l-5mg/ml，该多克隆抗体的稀释液可以为5mM PBS。
12、 根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述质控羊抗鼠IgG的浓度为0. 1-5 mg/ml。
13、 根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，将胶体金标记的兔抗重组蓖麻毒素A链多克隆抗体均匀涂布在玻璃纤维膜上，其中PH为7-9。
14、 权利要求1-8任一项所述的试纸在检测蓖麻毒素中的应用，其中包括将待测标本与样品稀释液混匀，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果。
15、 由权利要求9 - 13任一项所述的方法制备的检测蓖麻毒素的试纸。
全文摘要
本发明公开了一种检测试纸，该试纸包含(1)反应支持物；(2)吸水垫；(3)硝酸纤维膜，该膜包被有兔抗重组蓖麻毒素A链抗体和质控抗体的检测条带和质控条带；(4)金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的鼠抗重组蓖麻毒素A链抗体；(5)样品垫。本发明试纸可以配合小型仪器进行半定量检测，不需专业培训，结果清晰易辨并能客观保存数据，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的现场检测，适合流行病学调查，并对蓖麻毒素的感染诊断起到辅助作用。
文档编号G01N33/52GK101561434SQ20091008496
公开日2009年10月21日 申请日期2009年6月5日 优先权日2009年6月5日
发明者孙肖红, 张晓龙, 宇 杨, 静 王, 王景林, 聪 聂, 胡孔新, 姗 高 申请人:中国检验检疫科学研究院