专利名称：复方制剂黄连解毒汤在制备抑制ido活性药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属中医药领域，涉及复方制剂黄连解毒汤的新的药物用途，特别是复方制剂黄连解毒汤在制备抑制IDO活性药物中的用途。
背景技术：
IDO (吲哚胺-2，3-双加氧酶；MW 48,000 ;EC 1. 13. 11. 42)是一种细胞内含亚铁 血红素的酶，是肝脏以外唯一可催化色氨酸使其沿犬尿氨酸途径分解代谢的限速酶。IDO存 在于人和动物的许多组织和细胞中，在正常状态下呈低水平表达，在炎症或感染过程中表 达显著增加，细胞因子IFN-Y和脂多糖LPS可诱导其表达。研究显示，IDO通过降解色氨酸造成细胞微环境内色氨酸的缺失，从而抑制病原 微生物如肿瘤细胞以及病毒、细菌等的增殖(Bodaghi B et al. J. Immunol, 1999,162 (2) 957)。IDO与神经系统疾病密切相关，IDO至少可通过两种机制影响脑的功能1)在炎症 反应时通过代谢色氨酸，降低了循环的色氨酸浓度，从而使5-羟色胺水平降低，导致抑郁； 2)催化色氨酸循犬尿氨酸途径代谢使犬尿氨酸和神经毒性喹啉酸累积，导致神经紊乱疾病 (Roye J，et al. Neuroscience Letters, 2005, 387 (2) :95)。IDO 活性还涉及与年龄相关的 核性白内障的发生。IDO是晶状体中紫外线滤器生物合成中的第一个酶并且是限速酶。来 自色氨酸降解的紫外线滤器化合物(犬尿氨酸和3-羟基犬尿氨酸葡萄苷)修饰存在于人 晶状体中的蛋白质。这些紫外线滤器加合物的量随年龄而增加(Takikawa et al. Adv. Exp. Med. Biol. 1999,241,467)并会导致与年龄相关的核性白内障的晶状体逐渐浑浊。IDO还参 与调节T细胞的反应。因为T细胞对色氨酸耗竭特别敏感，在色氨酸浓度较低时，T细胞增 殖就会静止在Gl期，IDO通过降解色氨酸，可切断T细胞的活化。基于这种机制，在胎盘中 表达的IDO保护了胎儿免遭母体排斥；而在肿瘤中表达的IDO介导了肿瘤的免疫逃逸。抗 原呈递细胞如巨噬细胞、树突状细胞上的IDO均可通过抑制T细胞增殖来诱导T细胞对肿 瘤抗原的免疫耐受。因此，IDO与多种疾病的发病机制密切相关，已被证实是阿尔茨海默病、 白内障、癌症等重大疾病的靶标(ffirleitner,Curr. Med. Chem. 2003，10，1581)。IDO抑制剂 可用于心境障碍的抑制以及其他具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病的 治疗，这些疾病包括诸如AIDS等病毒感染、诸如莱姆病和链球菌感染等细菌感染、神经退 行性病症(例如阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病)、抑郁症、癌症、白内障以及自身免疫 性疾病。现有技术公开了寻找高效IDO抑制剂的工作主要以合成化学为手段，以IDO的底 物色氨酸为模板，在研究构效关系的基础上对其进行结构修饰。发表的文章和注册的专利 几乎覆盖了所有能修饰的基团，但缺乏高活性的抑制剂目前被报道的最有效的IDO非竞 争性抑制剂是3-butyl- β -carboline (Ki = 3. 3 μ Μ)和竞争性抑制剂1_ΜΤ，后者被广泛使 用于体内外实验。大多数已知的IDO抑制剂，包括I-MT都是色氨酸衍生物，有效浓度都在 ΙΟμΜ以上，难以作为药物应用。从天然产物中寻找具有新结构骨架、高活性的IDO抑制 剂是解决现状的一个新思路2006年Andersen等从海绵Neopetrosia exigua中提取了Exiguamine A (Ki = 0. 21 μ Μ)；从海水螅中提取了 Annulin C(Ki = 0. 14 μ Μ) ；Malachowski 等发现来自十字花科植物的BrassininOa = 97. 7 μ M)具有中等活性。文献检索表明，从中药及其方剂中筛选IDO抑制剂的工作还是空白。复方制剂黄 连解毒汤由黄连，黄柏，黄芩和桅子组成，对血管性痴呆和老年性痴呆有良好的治疗作用。 研究显示，长期服用黄连解毒汤可抑制由局部缺血引起的脑内色氨酸代谢发生的变化。患老年痴呆症的老鼠其细胞因子IFN-Y等含量较高，而服用黄连解毒汤可以降低IFN-Y等 的含量。另一方面，黄连解毒汤有很好的体内抗肿瘤作用，但是黄连解毒汤抗肿瘤的物质基 础及作用机制尚不清楚。关于黄连解毒汤的药理作用的报道有不少，但尚未有其具有IDO抑制活性的报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决高效、新型IDO抑制剂药物匮乏的问题，提供复方制剂 中药黄连解毒汤新的药用用途，具体涉及复方制剂黄连解毒汤在制备抑制IDO活性药物中 的用途。尤其是用于抑制IDO并在治疗或预防具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特 征的疾病中的用途。所述的疾病包括但不限于肿瘤性疾病、癌症、眼睛疾病、自身免疫性疾 病、心境障碍、抑郁症和焦虑症。本发明所述的用途包括体内和体外应用，以及在制造药物和IDO抑制剂组合物中 的用途。本发明所述的复方制剂黄连解毒汤根据中国药典2000年版一部所规定制备，其 中的原料药为中国药典2000年版一部所收载中药，并符合药典质量要求。本发明采用复方制剂黄连解毒汤的浓缩物进行抑制IDO活性实验，结果表明，所 述的黄连解毒汤浓缩物具有IDO抑制活性。本发明提出的复方制剂黄连解毒汤浓缩物，以如下方法取得黄连、黄芩、黄柏和 桅子按3 2 2 3重量分配比煎煮两次，分别加10倍和8倍的水煎煮60和40分钟， 合并煎煮液，浓缩至相当于每毫升1克生药。本发明中，组成黄连解毒汤的黄连、桅子、黄柏三味单味药具有IDO抑制活性，其 中黄连活性最强。技术方案如下各味生药以十倍体积甲醇浸泡七天，浸泡液浓缩为膏状， 溶于适量甲醇，使每毫升溶液相当于1克生药。本发明中，黄连中具有IDO抑制活性的有效部位。技术方案如下黄连以十倍体积 甲醇浸泡七天，浸泡液浓缩为浸膏。浸膏分为不溶于水的分化1和水溶部分，后者用乙醚萃 取得到乙醚萃取分化2，水溶液调成碱性再用乙醚萃取得到分划4，萃取时得到部分固体为 分划3，经乙醚萃取后的水溶液用NH4Cl调至弱酸性，有大量固体(分划5)析出，过滤后酸 性水溶液用氯仿萃取，分为氯仿分划6，和水母液分划7。其中分化3，6，7具有显著的IDO 抑制活性。本发明中，黄连的单一化学组分盐酸黄连素，黄岑素具有优良的IDO抑制活性。本发明使用重组人IDO酶，建立了体外IDO活性检测系统，研究了黄连解毒汤及其 组成单味药、单一化学组分的IDO抑制活性。结果表明，所述的黄连解毒汤及其组成单味药可用于抑制IDO，并可作为药物原料，制备治疗或预防具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病的药物。下述通过实施例进一步说明本发明，但不能限制本发明的内容。
具体实施例方式实施例1重组IDO的制备按文献所述进行。IDO活性检测在96孔板上进行，先将50mM磷酸钾缓冲液(pH 6. 5)，40mM维生素C， 400 μ g/ml过氧化氢酶，20 μ M亚甲基蓝和IDO酶混合。再向上述混合液内加入底物L-色 氨酸和待测样品。反应在37°C下进行60分钟，加入30% (w/v)三氯乙酸使反应终止。96 孔板在65°C下加热15分钟，使之完成从甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后6000g旋转 5分钟。每孔取出ΙΟΟμΙ上清液转移到新的96孔板内，加入2% (w/v)对_( 二甲基氨基) 苯甲醛的乙酸溶液，犬尿氨酸与之反应产成的黄颜色可使用酶标仪在490nm观测。 实施例2.黄连解毒汤的IDO抑制活性黄连、黄芩、黄柏和桅子按原方比例(3:2:2:3)煎煮两次，分别加10倍和8 倍的水煎煮60和40分钟，合并煎煮液，浓缩至每毫升相当于1克生药。将黄连解毒汤与 IDO抑制剂1-甲基色氨酸(I-MT)进行IDO抑制活性检测对比，结果显示，所述的黄连解毒 汤对IDO的有明显抑制效率。表1.黄连解毒汤对IDO的抑制效率 实施例3.黄连解毒汤中各单味药的IDO抑制活性各味生药以十倍体积甲醇浸泡七天，浸泡液浓缩为膏状，溶于适量甲醇，使每毫升 溶液相当于1克生药。将各味生药与IDO抑制剂I-MT进行IDO抑制活性检测对比，结果显 示，所述的黄连解毒汤中各单味药显现了对IDO活性的抑制，其中黄连对IDO活性有明显抑 制效率。。表2.黄连解毒汤中各单味药对IDO的抑制效率
实施例4.黄连中有效部位的IDO抑制活性黄连以十倍体积甲醇浸泡七天，浸泡液浓缩为浸膏。浸膏分为不溶于水的分化1
和水溶部分，后者用乙醚萃取得到乙醚萃取分化2，水溶液调成碱性再用乙醚萃取得到分划
4，萃取时得到部分固体为分划3，经乙醚萃取后的水溶液用NH4Cl调至弱酸性，有大量固体
(分划5)析出，过滤后酸性水溶液用氯仿萃取，分为氯仿分划6，和水母液分划7。将各分划
进行IDO抑制活性检测。表3.黄连各部位对IDO的抑制效率 实施例5.黄连的单一化学组分盐酸黄连素，黄岑素的IDO抑制活性实验将盐酸盐酸黄连素，黄岑素等中药成分标准品进行抑制IDO活性的检测，各标准
品及I-MT的浓度均为500 μ M。结果表明，黄连的单一化学组分盐酸黄连素，黄岑素具有优
良的IDO抑制活性。表4.盐酸黄连素等单一化学组分对IDO的抑制效率
权利要求
复方制剂黄连解毒汤在制备抑制IDO活性药物中的用途，其中所述制剂通过下述方法制得取3∶2∶2∶3重量份配比的中药材黄连、黄芩、黄柏和栀子，煎煮两次，分别加10倍和8倍的水煎煮60和40分钟，合并煎煮液，浓缩至相当于每毫升1克生药。
2.按权利要求1所述的用途，其中所述制剂中的黄连制成盐酸黄连素或黄岑素。
3.按权利要求1所述的用途，其中所述制剂中的黄连制成抑制IDO活性的有效部位， 所述有效部位通过下述方法制备黄连以十倍体积甲醇浸泡七天，浸泡液浓缩为浸膏；所 述浸膏分为不溶于水的分化1和水溶部分，后者用乙醚萃取得到乙醚萃取分化2，水溶液调 成碱性再用乙醚萃取得到分划4，萃取时得到部分固体为分划3，经乙醚萃取后的水溶液用 NH4Cl调至弱酸性，有大量固体析出，为分划5，过滤后酸性水溶液用氯仿萃取，分为氯仿分 划6，和水母液分划7。
4.按权利要求1所述的用途，其中所述盐酸黄连素或黄岑素制成治疗或预防具有IDO 介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病药物中的用途。
5.按权利要求4所述的用途，其中所述的具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特 征的疾病包括但不限于肿瘤性疾病、癌症、眼睛疾病、自身免疫性疾病、心境障碍、抑郁症或 焦虑症。
全文摘要
本发明属中医药领域，涉及复方制剂黄连解毒汤的新的药物用途，特别是复方制剂黄连解毒汤在制备抑制IDO活性药物中的用途。本发明使用重组人IDO酶，建立了体外IDO活性检测系统，实验结果表明，由中药材黄连、黄芩、黄柏和栀子组成的黄连解毒汤及其组成单味药、单一化学组分具有IDO抑制活性。所述的黄连解毒汤及其组成单味药可用于抑制IDO，并可作为药物原料，制备治疗或预防具有IDO介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病的药物。
文档编号A61P35/00GK101837066SQ200910047739
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月18日 优先权日2009年3月18日
发明者匡春香, 杨青, 黄伟达 申请人:复旦大学