昆虫抗菌肽Thanatin衍生物及其制备方法与用途的制作方法

专利名称：：昆虫抗菌肽Thanatin衍生物及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗菌肽衍生物，具体地说涉及一组有抗菌作用的昆虫抗菌肽Thanatin衍生物及其适用于药用的盐，以及它的制备方法和用途。
背景技术：
：抗生素的发现在人类医学史上具有重要的意义，它的使用挽救了无数的生命，使人的预期寿命增加了十年以上。但是随着人们对抗生素的广泛使用，细菌也逐渐适应并对其产生了耐药性。虽然目前临床上使用的抗生素有上百种之多，但都属于化学小分子，新研制的抗生素一般也是其结构修饰物，很难解决细菌对抗生素耐药的问题。随着耐药菌问题的出现，新型的抗耐药菌的抗生素的研发已成为国际上广泛关注的问题。自然界中的许多生物，如昆虫、两栖类动物、植物和哺乳类动物都会产生保护机体的具有抗菌活性的小分子肽。这些抗菌肽能与生物体的细胞膜发生作用，从而达到杀死细菌、真菌和病毒的作用。昆虫抗菌肽都带有不同数量的正电荷，其作用机制在于，它所带的正电荷能与细菌细胞膜的磷脂双分子层的负电荷结合，从而影响膜上的离子通道，增加通透性，使细菌死亡，同时，抗菌肽还可以和膜上的脂多糖结合，减轻由细菌感染引起的临床症状。昆虫抗菌肽Thanatin是一种从昆虫中提取的有较好抗菌活性的抗菌肽。美国专利USP6770798公开了如何利用基因工程技术在植物中表达Thanatin(21个氨基酸)，增强植物对病原微生物抵抗能力的方法，专利保护其10个氨基酸的核心序列，以及其上游10个氨基酸和下游5个氨基酸序列，其氨基酸全长核心序列如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式中的Gly为甘氨酸，Ser为丝氨酸，Lys为赖氨酸，Pro为脯氨酸，Val为缬氨酸，Tyr为酪氨酸，Cys为半胱氨酸，Asn为天冬酰胺，Arg为精氨酸，Thr为苏氨酸，Gln为谷氨酰胺，Met为曱硫氨酸。目前，国际上已经报道的抗菌肽有数百种，其抗菌范围很广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒都有抑制作用，由于抗菌肽是利用生物体自身免疫机制而达到抗菌作用，与抗生素的作用有很大不同，故其对目前临床上的耐药菌仍具有杀菌作用，被国际上认为是一类具有广阔应用前景的新型抗菌药。但是直接利用天然抗菌肽作为抗菌药物的尝试很少。主要原因有很多天然抗菌肽的抗菌活性不高；化学合成天然抗菌肽的成本高，而且收率低；很多抗菌肽有很强的溶血副作用。如从蜜蜂毒液中提取的蜂毒肽，它具有很强的抗菌活性，但同时也具有溶血副作用，而使蜂毒肽作为抗菌药物的应用受到很大的限制。
发明内容本发明的目的是通过基因工程方法，以较低的生产成本合成了一组具有较高抗菌活性、较低溶血副作用的昆虫抗菌肽Thanatin衍生物。同时，将这些抗菌肽应用于制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌感染的药物中。本发明涉及一组具有如下结构的昆虫抗菌肽Thanatin衍生物及其适用于药用的盐①Gly隱Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr隱Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met;②Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met;③Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Thr-Ala-Lys-Cys-Gln-Arg-Met;④Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys隱Gln-Arg-Met;⑤Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr陽Ala-Lys匿Cys-Gln-Arg-Met;⑥Gly-Ser-Lys隱Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Ser隱Ala-Lys-Cys-Gln-Arg-Met。本发明的昆虫抗菌肽Thanatin衍生物与美国专利USP6770798公开的Thanatin的差别如下:①Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys画Gln-Arg-Arg-Thr-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met,将Thanatin第12位氨基酸Asn突变为Gin;②Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-$er-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met，将Thanatin第15位氨基酸Thr突变为Ser;③Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Thr-Aia-Lys-Cys-Gln-Arg-Met,将Thanatin第16位氨基酸Gly突变为Ala;④Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met,将Thanatin第12位氨基酸Asn突变为Gin,第15位氨基酸Thr突变为Ser;Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro画Ile隱Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr-Ala-Lys-Cys-Gln-Arg-Met,将Thanatin第12位氨基酸Asn突变为Gin,第16位氨基酸Gly突变为Ala;Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Ser-Ala-Lys-Cys-Gln-Arg-Met,将Thanatin第15位氨基酸Thr突变为Ser,第16位氨基酸Gly突变为Ala。本发明还涉及一组昆虫抗菌肽Thanatin衍生物的制备方法，该制备方法是基因工程方法，其步骤包括按昆虫抗菌肽衍生物的氨基酸序列合成基因片段，基因片段连接，质粒构建，克隆，发酵，分离纯化及冷冻干燥得产品。具体地讲，所述昆虫抗菌肽Thanatin衍生物的制备方法，包括以下步骤用PCR方法合成带有凝血酶切割位点的6种Thanatin衍生物基因，导入pET32a(+)载体，获得含编码Thanatin衍生物DNA序列的表达载体；将表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得转化子，用8mM乳糖37。C诱导表达6小时，获得的融合蛋白表达量分别占菌体总蛋白的48%(Tq)，50%(Ts)，42%(Ta),31%(Tqs)，27%(Tqa)和56%(Tsa);用10L发酵罐放大，种子液按5:100的比例接种，37°C,固定通气量4L/min,培养6小时后补料，0.1mmol/L的IPTG诱导5小时后放罐，融合蛋白表达量分别占菌体总蛋白的36%(Tq),32%(Ts)，40%(Ta),42%(Tqs)，21%(Tqa)和37%(Tsa);所得融合蛋白经凝血酶切割、阴离子交换柱分离，得到粗品，再经高效液相制备仪精制，获得Thanatin衍生物纯品，其纯度达到95%以上。本发明还涉及昆虫抗菌肽衍生物Thanatin及其适用于药用的盐的用途，将上述结构的昆虫抗菌肽衍生物及其适用于药用的盐单独或组合使用，作为治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌感染的药物。本发明还涉及昆虫抗菌肽衍生物Thanatin及其适用于药用的盐的用途，将上述结构的昆虫抗菌肽衍生物及其适用于药用的盐单独或组合使用，作为其它药物的辅料，或作为食品、化妆品和饲料的添加剂。有益效益本发明具有以下有益效益1.它们具有与天然昆虫抗菌肽相同或者更强的抗菌活性。2.提供了一组昆虫抗菌肽衍生物，扩大了昆虫抗菌肽衍生物的种类，获得了一组具有较高抗菌活性的昆虫抗菌肽衍生物。3.用基因工程技术制备具有较高抗菌活性的昆虫抗菌肽衍生物，适合于大规模工业化生产。4.采用基因工程技术制备，对环境友好，无任何有害物质产生。5.生产成本较低。化学合成每毫克肽(21个氨基酸)需560元人民币，而用本方法生产每毫克肽只需2元人民币，大规模制备时成本甚至更低。6.在昆虫抗菌肽Thanatin衍生物表达载体构建中，在目的基因的上游引入了凝血酶切割位点(LVPRGS)，当用凝血酶切割后生成LVPR和GS，而GS恰好是Thanatin衍生物的头2位氨基酸，巧妙的解决了工具酶切割后氨基酸剩余问题，大大简化了下游的纯化工艺。7.杀菌实验、溶血实验和急性局部刺激实验表明，Tq对大肠杆菌肺、白色念珠菌，Ts和Ta对大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌(ESBL)、白色念;朱菌，Tqa对金黄色葡萄球菌及白色念珠菌，Tqs、Tqa、Tsa对白色念珠菌的抗菌活性大于Thanatin;6种昆虫抗菌肽Thanatin衍生物的浓度在2.5mg/ml时均未发生溶血反应，产品安全性较高；具有较低的急性毒性刺激反应。具体实施例方式以下结合实施例，具体说明本发明。本发明所用内切酶、连接酶和其他分子生物学试剂购自Novagen公司。电泳、感受态细胞制备、转化等分子生物学方法，采用《分子克隆实验指南》的方法进行(萨姆布鲁克(Sambrook,J.)等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第3版)，北京，科学出版社，2002，8)。质粒提取，采用上海生工试剂盒K192，按照使用说明进行。实施例1表达载体的构建和转化子的获得按照常规方法分别合成引物(表l),根据引物不同配对用经PCR方法合成Tq、Ts、Ta、Tqs、Tqa、Tsa6个基因，琼脂lt电泳进4亍分离，胶回收，得到目的片段。将目的片段依照说明书用BamHI和Xhol分别进行双酶切，低熔点琼脂糖法回收相应片段(《分子克隆》)，按说明书用T4DNA连接酶与相同酶切并回收的pET32a(+)相应片段连接，获得含编码昆虫抗菌肽衍生物DNA序列的表达载体；将表达载体转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选并鉴定转化子，常规方法提取质粒，送上海Invitrogen公司测序，测序结果与预期序列一致。所构建的质粒命名为pET32/Tq,apET32a/Ts，pET32a/Ta,pET32a/Tqs，pET32a/Tqa，pET32a/Tsa。表l引物序列引物号_DNA序列_目的基因SEQID5，-GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCTqNO.1CTGTCCCGATAATCTACTGTCAACGT-3，_SEQID5,-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTACCTGACCNO.2TACGTTGACAGTAGATTATC-3,SEQID5，-GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCTsNO.3CTGTCCCGATAATCTACTGTAACCGT-3'SEQID5,-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTACCGCTCCNO.4TACGGTTACAGTAGATTATC-3，_SEQID5，-GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCTaNO.3CTGTCCCGATAATCTACTGTAACCGT-3，SEQID5'-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTCCGTGACCNO.5TACGGTTACAGTAGATTATC-3'SEQID5，-GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCTqsNO.1CTGTCCCGATAATCTACTGTCAACGT-3'SEQID5，-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTACCGCTCCNO.4TACGGTTACAGTAGATTATC-3，_SEQID5，-GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCTqaNO.1CTGTCCCGATAATCTACTGTCAACGT-3'SEQID5，-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTCCGTGACCNO.5TACGGTTACAGTAGATTATC-3，_SEQID5，陽GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCTsaNO.1CTGTCCCGATAATCTACTGTAACCGT-3'SEGID5，-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTCCGGCTCCN0.6TACGGTTACAGTAGATTATC-3，诱导表达，检测鉴定将编码6个Thanatin衍生物的阳性质粒分别转化BL21(DE3)感受态细胞，获得转化子，接种于含Amp(50pg/ml)的LB肉汤20ml中培养，当菌液OD值达到0.6时，加入乳糖至终浓度8mM,37。C诱导表达6小时。5000rpm离心10分钟，取沉淀。将沉淀溶于50mMTris-HCl和10mMNaCl(pH8.0)组成的緩冲液中，超声破碎20min。将超声后的溶液12000rpm离心20min，分别保留上清和沉淀用于电泳检测。在24KDa分子量附近有明显条带(分子量约为2.4KDa),即为融合蛋白，主要集中在溶液上清中。融合蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的48%(Tq),50%(Ts),42%(Ta)，31%(Tqs)，27%(Tqa)和56%(Tsa)。发酵罐中试放大按照下列条件，对工程菌进行中试放大实验发酵体系10LLB培养基(AmplOO)ig/mL)。发酵方案LB平板上(AmplOOpg/mL)保藏菌种单克隆转接至种子液，37°C,200r/min摇床培养7h,种子液按5:IOO的比例转接至发酵罐；37°C,固定通气量4L/min,培养约6小时至对数生长期，补料1LLB,同时加入诱导剂(IPTG0.1mmol/L)后继续培养，5小时后放罐。SDS-PAGE显示，融合蛋白表达量占菌体总蛋白的36%(Tq),32%(Ts),40%(Ta),42%(Tqs)，21%(Tqa)和37%(Tsa)。融合蛋白的酶切，分离纯化将融合蛋白加入凝血酶緩冲液中，按1mg/lU用凝血酶进行切割，酶切条件为25'C,16h。酶切完成后，用DEAE-sephadexA25阴离子交换柱分离，得到Thanatin衍生物粗品，冷冻干燥后，再经高效液相制备仪(HPLC，C18柱)精制，获得纯品，其纯度达到95%以上。以胰岛素为对照，将产品按照Tricine-SDS-PAGE电泳方法电泳，检测其分子量约为2.4KDa。实施例2抗菌活性的测定用灭菌生理盐水配制浓度为6mg/ml多肽样品溶液。试验用菌种分别接种于营养肉汤，于37。C培养24小时，临用前用无菌生理盐水作1:105倍稀释，取12支细菌培养管并编号，于第1管中加入营养肉汤1.8ml，其余11管中均加入l.Oml肉汤。于第1管加入0.2ml多肽溶液，混匀后取出l.Oml加入到第2管中，如此反复，依次稀释到第12管，每管各加菌液0.2ml，轻轻振摇均匀，置37。C培养24小时。以无菌生长的最低多肽浓度，作为抑制细菌生长的最低样品浓度(MIC)。表2为实施例1中制备的Thanatin衍生物对几种菌的最低抑菌浓度。表2昆虫抗菌肽Thanatin及其衍生物最低抑菌浓度MIC(mg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例3多肽溶血活性的测定将人血红细胞悬浮在磷酸盐緩冲液(pH7.4)中，得到红细胞悬浮液(5。/。v/v)。将多肽溶解在磷酸盐缓冲液中，配成约5mg/ml储备液，取14支1.5ml离心管，于第1支离心管中加lml多肽储备液，其余各管中加0.5ml磷酸盐緩冲液，从第1管中取出0.5ml多肽储备液加至第2管中，用微量混合仪混合均匀，再从第2管中取出0.5ml溶液加至第3管中混合均匀，以此类推，即以倍比稀释法依次稀释到第14管，弃去0.5ml，各管补加0.5ml配好的5。/。血红细胞悬浮液至终体积1.0ml,轻轻摇匀，37。C恒温箱中保温60min后，于4000rpm离心10分钟，取上清液在414nm下比色，以红细胞悬浮在磷酸盐緩冲液中为空白，以红细胞悬浮在l%TritonX-100中为100%溶血。溶血百分率用下式计算溶血百分率==，100%溶血样品的吸光度定义溶血百分率为50%时的多肽浓度为半数溶血剂量(HC5Q)。结果表明，Thanatin及其缺失突变体的HC5()>2.5mg/ml。实施例4兔眼结膜局部刺激实验取健康家兔6只，实验前先检查眼结膜血管、角膜透明度及眼分泌物等状况，选用正常者供试。将供试药物用生理盐水配制成等渗。取实施例1中制备的抗菌肽各0.1ml(5mg/ml)滴入左眼结膜嚢中，停留2min;右眼滴入同量生理盐水作为对照。使用放大镜观察给药后1、24、48、72h的眼部情况。结果显示，至72h时，兔眼角膜无浑浊，虹膜正常，结膜无充血水肿，无分泌物出现。表明药液对兔眼无急性刺激作用。SEQUENCELISTING<110>沈，子龙<120>昆虫抗菌肽Thanatin衍生物及其制备方法与用途<130>USP6770798<160>6<170>Patentlnversion3.4<210>1<211>21<212>PRT<213>昆虫抗菌肽Thanatin衍生物1<400>1GlySerLysLysProValProHelieTyrCysGinArgArgThrGly151015LysCysGinArgMet20<210>2<211>21<212>PRT<213>昆虫抗菌肽Thanatin衍生物2<400>2GlySerLysLysProValProlielieTyrCysAsnArgArgSerGly151015LysCysGinArgMet20<210>3<211>21<212>PRT<213>昆虫抗菌肽Thanatin衍生物3<400〉3GlySerLysLysProValProlielieTyrCysAsnArgArgThrAla151015LysCysGinArgMet20<210〉4<211>21<212>PRT<213>昆虫抗菌肽Thanatin衍生物4<400>4GlySerLysLysProValProlielieTyrCysGinArgArgSerGly151015LysCysGinArgMet20<210>5<211>21<212>PRT<213>昆虫抗菌肽Thanatin衍生物5<400>5GlySerLysLysProValProHeHeTyrCysGinArgArgThrAla151015LysCysGinArgMet-20<210>6<211>21<212>PRT<213〉昆虫抗菌肽Thanatin衍生物6<400>6GlySerLysLysProValProlielieTyrCysAsnArgArgSerAla151015LysCysGinArgMet20<210>7<211>59<212>DNA<213〉引物l<400>7gcggatccctggtgccgcgcggcagcaagaagcctgtcccgataatctactgtcaacgt59<210>8<211>54<212>DNA<213>引物2<400>8cgctcgagttacatacgctggcacttacctgacctacgttgacagtagattatc54<210>9<211>59<212>DNA<213>引物3<400>9gcggatccctggtgccgcgcggcagcaagaagcctgtcccgataatctactgtaaccgt59<210>10<211>54<212>DNA<213>引物4<400>10cgctcgagttacatacgctggcacttaccgctcctacggttacagtagattatc54<210>11<211>54<212>DNA<213>引物5<400>11cgctcgagttacatacgctggcacttccgtgacctacggttacagtagattatc54<210>12<211>54<212>DNA<213>引物6<400>12cgctcgagttacatacgctggcacttccggctcctacggttacagtagattatc5权利要求1.一组具有如下结构的昆虫抗菌肽Thanatin衍生物及其适用于药用的盐①Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met(Tq)；②Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met(Ts)；③Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Thr-Ala-Lys-Cys-Gln-Arg-Met(Ta)。④Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met(Tqs)；⑤Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Gln-Arg-Arg-Thr-Ala-Lys-Cys-Gln-Arg-Met(Tqa)；⑥Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Ser-Ala-Lys-Cys-Gln-Arg-Met(Tsa)。2.根据权利要求1所述的昆虫抗菌肽Thanatin衍生物及其适用于药用的盐，其特征在于组成上述结构的昆虫抗菌肽衍生物的氨基酸是L型或者D型异构体。3.昆虫抗菌肽Thanatin衍生物的制备方法，该制备方法是基因工程方法，其步骤包括编码昆虫抗菌肽衍生物氨基酸DNA序列的合成，基因片段的连接，表达质粒构建，转化，发酵，分离纯化及冷冻干燥得产品。4.根据权利要求3所述的昆虫抗菌肽Thanatin衍生物的制备方法，其特征在于用PCR方法合成带有凝血酶切割位点的6种Thanatin衍生物基因，将表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得转化子，用8mM乳糖3^C诱导表达6小时，获得的融合蛋白表达量分别占菌体总蛋白的48%(Tq)，50%(Ts),42%(Ta)，31%(Tqs),27%(Tqa)和56%(Tsa);用IOL发酵罐放大，种子液按5:IOO的比例接种，37°C,固定通气量4L/min,培养6小时后补料，O.lmmol/L的IPTG诱导5小时后放罐，融合蛋白表达量分别占菌体总蛋白的36%(Tq)，32%(Ts),40%(Ta)-，42%(Tqs),21%(Tqa)和37%(Tsa);所得融合蛋白经凝血酶切割、阴离子交换柱分离，得到粗品，再经高效液相制备仪精制，获得Thanatin衍生物纯品，其纯度达到95%以上。5.昆虫抗菌肽Thanatin衍生物及其适用于药用的盐的用途，其特征在于将上述结构的昆虫抗菌肽衍生物及其适用于药用的盐单独或组合使用，作为治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌感染的药物。6.昆虫抗菌肽Thanatin衍生物及其适用于药用的盐的用途，其特征在于将上述结构的昆虫抗菌肽衍生物及其适用于药用的盐单独或组合使用，作为其它药物的辅料，或作为食品、化妆品和饲料的添加剂。全文摘要本发明涉及一组有抗菌作用的昆虫抗菌肽Thanatin衍生物及其适用于药用的盐，以及它的制备方法和用途。杀菌实验、溶血实验和急性局部刺激实验结果表明，昆虫抗菌肽Thanatin衍生物对大肠杆菌肺、白色念珠菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌的抗菌活性大于Thanatin；浓度为2.5mg/ml时未发生溶血反应，无急性毒性刺激反应。文档编号C07K14/435GK101173005SQ20071016520公开日2008年5月7日申请日期2007年10月30日优先权日2007年10月30日发明者吴国球,沈子龙申请人:沈子龙