一株短乳杆菌及其应用
【专利摘要】一株短乳杆菌，命名为短乳杆菌AR-123，其保藏编号为CGMCC 9761。该短乳杆菌AR-123能够高效降解亚硝酸盐，作为蔬菜发酵剂应用，可以很好的保持蔬菜原有的风味及营养，发酵结束后的发酵蔬菜中亚硝酸盐含量仅为1.6mg/L。CGMCC No.976120141013
【专利说明】
_株短乳杆菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物，特别涉及一株短乳杆菌及其应用。 技术背景
[0002] 发酵蔬菜是指经过发酵的可以长期储藏的蔬菜，是我国传统发酵食物的典型代表 之一，具有独特的风味特点。发酵蔬菜主要是将白菜、萝卜、黄瓜等蔬菜在一定浓度的食盐、 水和调料的作用下，利用天然附着在蔬菜表面的微生物或是人工接种乳酸菌等发酵剂，厌 氧条件下分解蔬菜中的可发酵糖类等营养物质并产生大量乳酸的过程。在发酵过程中，在 大量的乳酸和盐胁迫条件下，蔬菜中的一些腐败微生物和其它厌氧微生物生长会受到强烈 抑制，同时会产生乙醇、乙醛、甘露醇等风味物质，从而形成特有风味的发酵食品。发酵蔬菜 的主要原料是营养丰富的各种新鲜蔬菜，富含维生素、钙、铁、磷等营养元素及乳酸。味美嫩 脆，不仅能促进食欲，而且具有一定的保健功效，比如预防高血压、调节胆固醇含量以及缓 慢老化。有研究表明，发酵蔬菜对癌症也有一定的预防活性。
[0003] 发酵蔬菜是我国食用历史悠久的乳酸发酵蔬菜制品，具有良好的风味和保健功 能，但是亚硝酸盐含量超标问题始终限制着此类腌制食品的快速发展。近年来，由于氮肥的 大量使用，导致蔬菜中硝酸盐含量大量增加，而蔬菜是一种易于富集硝酸盐的植物性食物， 在发酵蔬菜腌制过程中，蔬菜中的硝酸盐可以被腌制蔬菜中的部分细菌还原成亚硝酸盐。 研究表明，腌制蔬菜中的亚硝酸盐含量比同种新鲜蔬菜高出几倍甚至几十倍之多，而且，由 于腌制蔬菜在存储、运输过程中可能存在保存条件不当，导致产品中的污染杂菌增多，使得 其中的亚硝酸盐含量进一步升高。因此，如何严格控制腌制泡菜中的亚硝酸盐的含量，确保 泡菜这种传统食品的使用安全性，使其在市场上更好的流通是急需解决的问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的，就是针对现有技术中缺乏安全、高效的降解亚硝酸盐的乳酸菌的 不足，提供一株能高效降解亚硝酸盐的短乳杆菌及其应用，本发明的菌株在适宜条件下发 酵泡菜，可以很好的保持蔬菜原有的风味及营养，发酵结束后泡菜中亚硝酸盐含量仅为 1. 6mg/L〇
[0005] 为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：一株短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)，命名为短乳杆菌AR-123,该菌株已于2014年10月13日在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号） 保藏，其保藏编号为CGMCC 9761，其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 本发明的短乳杆菌AR-123菌株筛选自传统泡菜。对泡菜样品进行分离筛选，利用 梯度稀释法，将稀释后的样品液涂布于MRS平板，37°C恒温培养，经过划线分离后对分离获 得的乳酸菌进行形态观察，结合降解亚硝酸盐发酵实验确定为高效降解亚硝酸盐菌株，其 降解效率高达99. 5%。
[0007] 上述短乳杆菌AR-123作为蔬菜发酵剂的应用。
[0008] 上述短乳杆菌AR-123作为蔬菜发酵剂的应用方法如下：
[0009] (1)将短乳杆菌AR-123活化为接种液；
[0010] (2)向灭过菌的容器中加入300mL盐水、佐料和经清洗、切块的蔬菜；
[0011] (3)将接种液按5-15% (v/v)的接种量接种于上述放有蔬菜的容器中，25°C静置 发酵7天，得到低亚硝酸盐含量的发酵蔬菜。
[0012] 步骤（1)中所述的活化是指：将短乳杆菌AR-123接种于MRS培养基中，37°C静置 培养24h，同样条件下进行二次扩大培养，4000rpm离心8min收集菌体，再用生理盐水悬浮 菌体，调制成短乳杆菌AR-123浓度为10 scfu/mL的接种液。
[0013] 步骤⑵中所述的盐水中盐的重量百分比浓度为3-10%，加入蔬菜的量为 75-200g〇
[0014] 本发明筛选出的短乳杆菌AR-123能够高效降解亚硝酸盐，在适宜条件下发酵泡 菜，可以很好的保持蔬菜原有的风味及营养，发酵结束后泡菜中亚硝酸盐含量仅为1. 6mg/ L。利用该菌株发酵蔬菜，具有独特的风味，鲜香嫩脆，口感好，且亚硝酸盐含量极低。本发 明的短乳杆菌AR-123用于制备发酵蔬菜过程简单，可以实现大规模工业化应用。
【附图说明】
[0015] 图1为短乳杆菌AR-123的生长曲线。
[0016] 具体实施方法
[0017] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材 料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选 择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
[0018] 下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、 试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0019] MRS固体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物5g/L，K2HP0 42g/L，柠 檬酸二铵 2g/L，乙酸钠 5g/L，葡萄糖 20g/L，吐温 801mL，MgS04 ? 7H200. 58g/L，MnS04 ? 4H20 0? 25g/L，琼脂 20g/L，调节 pH 至 6. 4。
[0020] 实施例1短乳杆菌AR-123的筛选与鉴定
[0021] 1. 1样品稀释液制备及菌株分离
[0022] 采集来自四川农家自制的发酵蔬菜样品，剪碎，加入15mL无菌水，剧烈震荡 20min。采用浓度梯度稀释法（10 LlO 4)，取稀释液100uL涂布于MRS琼脂培养基平板上， 37°C厌氧培养48h，挑选菌落大、生长快的菌株，进一步划线分离纯化。
[0023] 1. 2菌株筛选
[0024] 将步骤1. 1中的菌株接种至MRS液体培养基中37°C静置培养24h，制备成种子液， 按照5%的接种量接入含有0. 2mg/mL亚硝酸盐的MRS液体培养基中，37°C静置培养48h，培 养结束后，4000rpm，10min离心培养液，取上清液。采用盐酸奈乙二胺法测定培养液中残留 的NaN0 2的含量。实验结果如表1所示。
[0025] 表1初筛菌株降解亚硝酸盐筛选
[0026]
[0028] 1. 3菌株鉴定
[0029] 将分离得到的一株菌命名为AR-123。菌落椭圆形或类圆形，边缘整齐，菌落大小一 般为2~3mm，乳白色。通过16SrDNA序列对比分析，结果显示该序列与NCBI数据库中短乳 杆菌的同源性达99%，可以鉴定该菌为短乳杆菌（Lactobacillusbrevis)，命名为短乳杆 菌 AR-123。
[0030] 1. 4菌株生长特性
[0031] 将活化好的短乳杆菌AR-123按1% (v/v)接种量接入MRS液体培养基中，37°C静 置培养24h，每隔2h在600nm测定培养液的菌浓。以菌浓对时间作图得到菌株AR-123在 MRS中的生长曲线，其结果如图1所示。实验结果表明，短乳杆菌AR-123在MRS培养基中生 长迅速，在6h左右进入对数期，12h左右进入稳定期。
[0032] 实施例2短乳杆菌AR-123制备低亚硝酸盐发酵蔬菜
[0033] (1)向灭过菌的容器中加入300mL浓度为3%的无菌盐水和佐料，取新鲜白菜，清 洗，沥干多余水分，无菌条件下切分成长度和宽度为5*3cm的小块装入容器中，放入蔬菜重 量为75g ;
[0034] (2)向容器中接入5% (v/v)经活化的短乳杆菌AR-123,加水密封后置于25°C下， 发酵7d，即得发酵蔬菜。经检测，本实施例所得产品的亚硝酸盐含量为8. 4mg/L。结果表明， 所得发酵蔬菜的亚硝酸盐含量较低，且产品具有独特风味，口感鲜香嫩脆。
[0035] 实施例3短乳杆菌AR-123制备低亚硝酸盐发酵蔬菜
[0036] (1)向灭过菌的容器中加入300mL浓度为7%的无菌盐水和佐料，取新鲜白菜，清 洗，沥干多余水分，无菌条件下切分成长度和宽度为5*3cm的小块装入容器中，放入蔬菜 重量为150g ;
[0037] (2)向容器中接入10% (v/v)经活化的短乳杆菌AR-123,加水密封后置于25°C 下，发酵7d，即得发酵蔬菜。经检测，本实施例所得产品的亚硝酸盐含量为1.6mg/L。结果 表明，所得发酵蔬菜的亚硝酸盐含量较低，且产品具有独特风味，口感鲜香嫩脆。
[0038] 实施例4短乳杆菌AR-123制备低亚硝酸盐发酵蔬菜
[0039] (1)向灭过菌的容器中加入300mL浓度为7%的无菌盐水和佐料，取新鲜白菜，清 洗，沥干多余水分，无菌条件下切分成长度和宽度为5*3cm的小块装入容器中，放入蔬菜重 量为200g ;
[0040] (2)向容器中接入15% (v/v)经活化的短乳杆菌AR-123,加水密封后置于25°C 下，发酵7d，即得发酵蔬菜。经检测，本实施例所得产品的亚硝酸盐含量为1.8mg/L。结果 表明，所得发酵蔬菜的亚硝酸盐含量较低，且产品具有独特风味，口感鲜香嫩脆。
[0041] 实施例5短乳杆菌AR-123制备低亚硝酸盐发酵蔬菜
[0042] (1)向灭过菌的容器中加入300mL浓度为10%的无菌盐水和佐料，取新鲜白菜，清 洗，沥干多余水分，无菌条件下切分成长度和宽度为5*3cm的小块装入容器中，放入蔬菜重 量为200g ;
[0043] (2)向容器中接入15% (v/v)经活化的短乳杆菌AR-123,加水密封后置于25°C 下，发酵7d，即得发酵蔬菜。经检测，本实施例所得产品的亚硝酸盐含量为2. 6mg/L。结果 表明，所得发酵蔬菜的亚硝酸盐含量较低，且产品具有独特风味，口感鲜香嫩脆。
[0044] 序列表 <110>丨?.海评丨:人学 <12〇> -株短乳杆菌及其应用 <160> 1 < 17()> Patentl n version. <210> 1 <211> 1059 <212> DNA <213>短乳杆菌AR-I23 <400> 1
【主权项】
1. 一株短乳杆菌（Lactobacillus brevis)，命名为短乳杆菌AR-123,其保藏编号为 CGMCC 9761，其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 短乳杆菌AR-123作为蔬菜发酵剂的应用。3. 根据权利要求2所述的短乳杆菌AR-123作为蔬菜发酵剂的应用，其特征在于： 应用方法如下： (1) 将短乳杆菌AR-123活化为接种液； (2) 向灭过菌的容器中加入300mL盐水、佐料和经清洗、切块的蔬菜； (3) 将接种液按5-15% (v/v)的接种量接种于上述放有蔬菜的容器中，25°C静置发酵 7天，得到低亚硝酸盐含量的发酵蔬菜。4. 根据权利要求3所述的短乳杆菌AR-123作为蔬菜发酵剂的应用，其特征在于：步骤 ⑴中所述的活化是指：将短乳杆菌AR-123接种于MRS培养基中，37°C静置培养24h，同样 条件下进行二次扩大培养，4000rpm离心8min收集菌体，再用生理盐水悬浮菌体，调制成短 乳杆菌AR-123浓度为10 scfu/mL的接种液。5. 根据权利要求3所述的短乳杆菌AR-123作为蔬菜发酵剂的应用，其特征在于：步骤 (2)中所述的盐水中盐的重量百分比浓度为3-10%，加入蔬菜的量为75-200g。
【文档编号】C12R1/24GK105820967SQ201510005242
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月4日
【发明人】艾连中, 夏永军, 王光强, 林祥娜, 马佳莹, 陈卫, 郭本恒
【申请人】上海理工大学