专利名称：人重组蛋白pdcd5在治疗自身免疫病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制品以及免疫学领域，尤其涉及人重组蛋白ro⑶5在诱导⑶4+CD25+Foxp3+调节性T细胞分化、抑制Thl7细胞的分化，抑制炎症细胞因子IL-17A和TNF-α的产生，预防和/或治疗自身免疫病中的应用。
背景技术：
PDCD5 (程序性细胞死亡分子5, programmed cell death 5),以前被称为TFAR19 (TF-1 细胞凋亡相关基因 19, TF-Icell apoptosis-re lated gene 19),是一种新的程序性细胞死亡调控基因(中国专利98101869. 6 ;Biochem Biophy Res Comm, 1999,254 203-210)。该基因进化保守，表达广泛，其编码的H)⑶5蛋白由125个氨基酸组成。前期的功能研究证明TOCD5在多种肿瘤组织中表达下调，人重组蛋白TOCD5可以利用窖蛋白 (caveolae) / 脂筏介导的胞吞作用进入细胞(J. Biol. Chem. 2006，281 =24803-24817)，加入外源性人重组H)⑶5蛋白，细胞内吞后还可到达细胞核。进入细胞的重组人H)⑶5能够增强多种肿瘤细胞对多种化疗药的敏感性，促进化疗药引起的肿瘤细胞的死亡(ChineseScience Bulletin,2009,54(21) :3981-3989 ；Biochem Biophys Res Commun,2010,96(2)224-230 ；中国实验血液学杂志，2010 ；18(2) :277-281 ；Apoptosis, 2010,15 :805-813)，是一种潜在的新的抑癌基因，其效应机制是通过结合组蛋白乙酰转移酶Tip60(TatInteractive Protein 60kD, Tip60)发挥促进肿瘤细胞凋亡的作用(Neoplasia, 2009,10(4) :345-354)。Tip60是进化上保守的组蛋白乙酰化转移酶，其在转录调控、DNA损伤修复、细胞周期阻滞和凋亡等过程中发挥重要作用。最近的研究发现Tip60能够与F0XP3相互作用，促进F0XP3的乙酰化，从而介导F0XP3的转录抑制活性(Proc Natl Acad Sci USA, 2007,104(11) :4571-4576)。Foxp3分子是赋予调节T细胞细胞免疫抑制功能的主要分子，也是其最具特异性的标志分子。F0XP3+调节性T细胞(F0XP3+Tregs)属于T淋巴细胞中表达⑶4、⑶25及转录因子F0XP3的一类T细胞亚型，其正常功能对于人体免疫稳态的动态调节必不可少。调节性T细胞的发育及功能失调，与多种重大免疫相关性疾病，包括自身免疫性疾病、炎症反应、急性及慢性传染性疾病、肿瘤免疫耐受、移植排斥以及过敏性疾病的生理病变进程密切相关(Cell, 2008,133(5) :775-87, Cell, 2010,140 (6) :845-58)。F0XP3+Tregs 主要可分为两类:自然性 F0XP3+Treg (natural Treg, nTre g)和诱导性 F0XP3+Treg (induced Treg, iTreg)。nTreg免疫调节功能的发挥与Foxp3分子的持续表达密切相关。这些胸腺产生的nTreg细胞释放到外周后能够保持Foxp3分子的稳定表达，在特异性抗原的刺激下，此群细胞被激活，从而发挥免疫抑制作用。iTreg稳定发挥免疫抑制作用也需要维持Foxp3分子的稳定表达。Treg细胞抑制免疫反应的调节作用的机制包括分泌细胞因子(如IL-10，TGF-β，IL-35等)和细胞接触抑制。多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)是一种以血脑屏障遭破坏,伴有炎症、髓鞘损害为特征的中枢神经系统慢性自身免疫性疾病。好发于青壮年，发病年龄多在20 40岁，女性多见,具有高致残率、高复发性的特点，部分患者病情呈进行性加重,甚至死亡,对社会和家庭造成严重的影响。数据显示，在西方一些国家，该病患病率高达十万分之一百到三百；而在我国，据不完全统计，该病患病率也已达约十万分之五，并呈逐年上升趋势。MS的病理学改变由于自身反应性效应CD4+T细胞透过血-脑屏障，在中枢神经系统中浸润，诱发组织损伤。自身反应性效应T细胞(Thl和Thl7)既存在于MS患者血液中，也存在于健康人群的血液中。调节T细胞(Regulatory T cell, Treg)在控制自身抗原反应性T细胞以及介导外周耐受过程中起着非常关键的作用。Treg与MS的免疫病理学改变相关，成为治疗MS潜在的靶标。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmune encephalomyelitis,EAE)是发生在动物中枢神经系统内，由CD4+T淋巴细胞所介导的自身免疫性疾病，是目前被公认为人类多发性硬化症(MS)的理想动物模型，EAE与MS在临床、生化、免疫及病理等方面具有相同的特征，在研究MS的发病机制、治疗和预防复发中具有重要意义。
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种慢性反复发作的系统性的自身免疫性疾病。该病在世界范围内普遍存在，其病理机制目前还不清楚，许多研究已经表明淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、滑膜细胞等多种炎症细胞介导的异常细胞免疫、体液免疫，导致关节局部和全身的免疫功能紊乱，在RA的病理中起着重要作用。为了进一步探讨RA的病因、病理、免疫学、临床等方面的机制，以便寻找更有效的治疗RA的方案，国内外学者进行了大量的动物实验，并建立了一些比较成熟的整体动物病理模型，目前应用较广泛的且较成熟的整体动物实验模型主要有II型胶原诱导的关节炎(Type II collageninduced arthritis, CIA)模型。这些动物模型在临床表现、病理学、免疫学改变和病理机制等方面与人RA有许多相似特征，目前国际上广泛用于RA发病机制的研究以及创新药物的研发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人重组H)⑶5蛋白在促进⑶4+CD25+Foxp3+调节性T细胞分化，免疫抑制中的应用。上述所说的人重组H)⑶5蛋白具有增强⑶4+CD25+Foxp3+调节性T细胞抑制效应的作用，可在制备增强⑶4+⑶25+FoXp3+调节性T细胞抑制效应的药物中应用。上述所说的人重组H)⑶5蛋白具有促进抑制性细胞因子IL-10和TGF-β产生的作用，可在制备促进抑制性细胞因子IL-10和TGF-β产生的的药物中应用。上述所说的人重组ro⑶5蛋白具有抑制炎症性Thl7细胞分化的作用，可在制备抑制炎症性Thl7细胞分化的药物中应用。上述所说的人重组H)⑶5蛋白具有抑制炎症性细胞因子IL-17、IFN-Y和TMF-α产生的作用，可在制备抑制炎症性细胞因子IL-17、IFN-Y和TMF-α产生的药物中应用。上述所说的人重组TOCD5蛋白具有预防和治疗多发性硬化症和/或其他脱髓鞘疾病的药物中的应用。上述所说的人重组ro⑶5蛋白具有预防和治疗类风湿关节炎的药物中的应用。上述所说的人重组ro⑶5蛋白在制备预防和治疗自身免疫病的药物中的应用。
人重组ro⑶5蛋白可用于治疗Foxp3+调节性T细胞失调介导的自身免疫疾病EAE，人重组TOCD5蛋白在预防和治疗上都是有效的。因此人重组H)CD5蛋白可用于治疗的Foxp3+调节性T细胞介导的自身免疫病的实例包括多发性硬化症和/或其他脱髓鞘疾病、迟发型超敏反应、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、胰岛素依赖性的糖尿病、自身免疫性心肌炎、桥本氏病、Grave’ s病、重症肌无力等。发明人经过研究表明，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(M0G35_55)成功诱导了小鼠EAE模型，腹腔注射人重组蛋白TOCD5能够延缓EAE模型小鼠的发病，减轻病情；组织病理学分析发现，人重组蛋白TOCD5处理能够减少炎性细胞在中枢神经系统的浸润，减少脊髓的脱髓鞘病变；进一步研究显示人重组蛋白TOCD5在小鼠体内能够上调抑制性细胞因子IL-IO和TGF-β的产生，增加⑶4+⑶25+FoXp3+调节性T细胞的数量，减少Thl7的数量，降低炎症细胞因子IL-17、IFN-Y和TNF-α的产生。体外实验的结果证明，人重组蛋白H)⑶5处理的小鼠淋巴细胞和脾细胞对自身抗原M0G35_55的增殖能力显著低于对照小鼠；人重组蛋白H)⑶5体外处理naive小鼠的淋巴结细胞，能够促进⑶4+⑶25+Foxp3+调节性T细胞的分化。研究还发现，在II型胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠模型中，腹腔注射人重组蛋白TOCD5 能够减轻CIA模型大鼠的病情；进一步研究显示人重组蛋白TOCD5在大鼠体内能够增加⑶4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的数量，抑制炎症细胞因子IL-17A和TNF-α的产生。体外实验的结果证明，人重组蛋白H)CD5处理的大鼠淋巴细胞和脾细胞对II型胶原的增殖能力显著低于对照小鼠。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图I显示人重组蛋白H)⑶5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠临床评分。图2显示人重组蛋白H)⑶5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠的发病率。图3显示人重组蛋白H)⑶5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠脊髓的H&E染色。图4显示人重组蛋白H)⑶5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠脊髓的luxol fastblue染色。图5显示ELISA方法检测人重组蛋白H)⑶5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠血清的细胞因子水平。图6显示流式细胞术分析人重组蛋白H)⑶5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠淋巴结和脾细胞中⑶4+⑶25+Foxp3+细胞的数目。图7显示流式细胞术分析人重组蛋白H)⑶5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠淋巴结细胞中CD4+IL-17A+细胞的数目。图8显示[3H]掺入法检测人重组蛋白H)⑶5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠脾细胞和淋巴结细胞对mog35_55的反应性。图9显示ELISA方法检测人重组蛋白H)⑶5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠淋巴结细胞与mog35_55反应的培养上清中细胞因子的水平。图10显示ELISA方法检测人重组蛋白H)⑶5和阴性对照PBS处理的EAE小鼠脾细胞与mog35_55反应的培养上清中细胞因子的水平。图11显示流式细胞术分析人重组蛋白ro⑶5对小鼠淋巴结细胞中⑶4+CD25+Foxp3+细胞的诱导分化作用。图12显示人重组蛋白H)⑶5、卵白蛋白(OVA)处理的CIA大鼠以及生理盐水对照大鼠的发病情况。A :人重组蛋白TOCD5组、OVA对照组和生理盐水组大鼠的足跖肿胀程度；B :人重组蛋白H)⑶5组、OVA对照组和生理盐水组大鼠的临床评分；c:人重组蛋白ro⑶5组、OVA对照组和生理盐水组大鼠的足部图片。图13显示[3H]掺入法检测人重组蛋白H)⑶5和OVA处理的CIA大鼠脾细胞和淋 巴结细胞对胶原的反应性。图14显示ELISA方法检测人重组蛋白H)⑶5、OVA处理的CIA大鼠以及生理盐水对照大鼠的炎性细胞因子的水平。A :人重组蛋白TOCD5组、OVA对照组和生理盐水组大鼠血清和关节液中TNF-α的水平；Β :人重组蛋白H)⑶5组、OVA对照组和生理盐水组大鼠血清和关节液中IL-17A的水平。图15显示流式细胞术分析人重组蛋白H)⑶5和OVA处理的CIA大鼠大鼠的淋巴结、外周血以及脾细胞中⑶4+⑶25+FoXp3+细胞的数目。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。实施例I、人重组蛋白PD⑶5 (rhPD⑶5)作为蛋白重组药物，可延缓EAE樽型小鼠的发病，减轻病情，减少发病率方法EAE模型的建立与临床评分6-8周的雌性C57BL/6小鼠，饲养于北京大学医学部实验动物部，SPF级饲养，所用垫木、饮水、饲料及其与动物接触的物品均经高压灭菌处理。所有的动物实验操作和流程都符合北京大学实验动物管理制度。实验时，每只小鼠给予用完全弗氏佐剂乳化的mog35_m抗原20(^1(1.511^/1111)背部皮下三点免疫，同时尾静脉注射200μ Ulyg/ml)百日咳毒素(PT)，第2天，再次尾静脉注射200 μ I PT。同时将小鼠随机分成2组，每组8-10只小鼠。rhPDCD5 处理组第 0、2、4、6、8、10 天腹腔注射 200 μ g 的 rhPDCD5 ；阴性对照PBS组第0、2、4、6、8、10天腹腔注射200 μ L的PBS。第6天开始观察EAE临床体征的严重性，给出临床评分，观察发病率。临床评分标准0分无症状；1分尾部无力；2分前肢或后肢中度瘫痪和运动失调；4分前肢或后肢严重瘫痪或运动失调，人为翻转不能恢复；5分濒死状态或者死亡。结果如图I所示，阴性对照PBS组小鼠在第9天开始发病，症状呈进行性加重；而在rhro⑶5处理组，小鼠在第12天发病，发病时间明显延迟，症状减轻；同时如图2所示，rhH)⑶5处理小鼠的发病率明显低于PBS阴性对照组，因此，给小鼠施用rhH)⑶5能够延缓小鼠诱发的EAE。实施例2、rhPDCD5作为蛋白重组药物，能够减少炎症细胞在中枢神经系统的浸润，减少脊髓白质脱髓鞘病变方法
I EAE模型的建立与临床评分同见实施例I。2 :组织化学染色实验小鼠麻醉后打开胸腔，PBS心脏灌注，用4%多聚甲醛灌注内固定，再取出脊髓，放入装有4%多聚甲醛的玻璃瓶中固定，再将标本做脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、捞片、烘片。然后进行H&E染色和勒克索尔固蓝(Luxol Fast Blue)染色，封片进行观察。H&E染色结果如图3所示，rhTO⑶5处理的小鼠脊髓白质区炎性细胞浸润要比阴性对照PBS组轻；说明施用rhH)CD5减少炎症细胞在EAE小鼠中枢神经系统的浸润。Luxol Fast Blue染色如图4所示，在rhH)⑶5处理组脊髓的白质区致密，脱髓鞘现象很轻，而在PBS阴性对照组脊髓的白质区脱髓鞘现象明显。说明施用rhro⑶5减少EAE小鼠的脊髓脱髓鞘反应。 实施例3、rhPDCD5作为蛋白重组药物，能够减少EAE小鼠Thl7细胞的数目，减少血·清中炎症细胞的水平；同时促进调节性T细胞0^4￥025午0#3)的分化，增加抑制性细胞因子的水平方法I EAE模型的建立与临床评分同实施例I。2 =ELISA方法检测血清中的细胞因子rhH)⑶5和PBS处理的EAE小鼠，行麻醉处死，收集血清，按照Biolegend公司的说明书操作。3 :流式细胞术分析T细胞亚群rhH)⑶5和PBS处理的EAE小鼠，行麻醉处死，分别摘取体内淋巴结和脾脏，制成细胞悬液，加入合适浓度抗鼠CD16/32抗体，封闭免疫球蛋白Fe受体，4°C lOmin。1200rpm,离心洗一遍。细胞重悬100 μ I PBS,分别加入合适浓度的抗CD4和抗CD25表面荧光抗体，40C，避光孵育20min。PBS洗两遍，加Iml Fix/Perm buffer重悬细胞，混勻，避光20min,离心，弃上清。用Iml perm buffer洗一遍。重悬Iml permbuffer,避光15min。离心,加100 μ I perm buffer,加入合适浓度抗IL-17A抗体或抗F0XP3抗体，避光30min。PBS洗两遍。重悬于400 μ IPBS中，流式细胞计进行分析。ELISA分析的结果如图5所示，rhH)⑶5处理的EAE小鼠血清中炎性细胞因子如IL-17A和IFN- Y含量明显低于PBS阴性处理组；同时，rhH)⑶5处理的EAE小鼠血清中抑制性细胞因子如IL-IO和TGF-β含量明显高于PBS阴性处理组。说明施用rhPD⑶5减少EAE小鼠炎症细胞因子水平。流式细胞计的分析结果如图6所示，rhH)⑶5处理的EAE小鼠淋巴结中⑶4+CD25+Poxp3+的细胞为26. 9%,PBS阴性处理组则为7. 4%，在小鼠脾细胞中，rhH)⑶5处理组⑶4+CD25+Poxp3+的细胞为14. 9%,PBS阴性处理组则为9. 1%。因此，rhH)⑶5处理小鼠外周免疫器官⑶4+⑶25+Ρ0χρ3+细胞数目显著高于PBS阴性处理组；说明施用rhH)⑶5能够增加外周免疫器官⑶4+CD25+FOXp3+细胞的数目。另外如图7所示，rhH)⑶5处理的EAE小鼠淋巴结中⑶4+IL-17A+的细胞为8. 5%, PBS阴性处理组则为14. 62%, rhPD⑶5处理小鼠Thl7细胞数目显著低于PBS阴性处理组。说明施用rhH)⑶5能够减少外周免疫器官CD4+IL-17A+细胞的数目。实施例4、rhPDCD5作为蛋白重组药物，能够抑制MOG-特异性脾细胞和淋巴细胞
增葙方法
I EAE模型的建立与临床评分同实施例I。2 [3H-TdR]掺入法检测细胞的增殖RhH)⑶5和PBS处理的EAE小鼠，行麻醉处死，分别摘取体内淋巴结和脾脏，制成细胞悬液。将小鼠脾细胞或者淋巴结细胞重悬于10% FBS-RPMI 1640中，加200 μ I细胞悬液于96孔板中(每孔4 X IO5的细胞)，每个标本三个复孔，细胞培养液中加入20 μ g/ml的M0G35_55。在含有5% CO2的37°C培养箱中培养40小时，在培养时间到达40小时每孔加Λ IyCi 3H-甲基胸腺嘧啶([3H]-TdR)。培养时间到达48h时，将细胞摄取的同位素转移到玻璃纤维素膜。膜烘干后加入闪烁液，计数仪上读取cpm值，检测3H的掺入量。结果如图8所示，rhH)⑶5处理的EAE小鼠淋巴结细胞对M0G35_55的反应性明显低于PBS阴性处理组，显示[3H]-TdR掺入量的明显降低，两者有显著性差异；同时，rhro⑶5处理的EAE小鼠脾细胞对M0G35_55的反应性明显低于PBS阴性处理组，两者有显著性差异。说明施用rhH)⑶5能够抑制M0G35_55特异的淋巴细胞增殖反应。
实施例5、rhPDCD5作为蛋白重组药物，能够促进MOG^5特异性脾细胞和淋巴结细胞产生抑制性细胞因子，抑制MOG^5特异性脾细胞和淋巴结细胞产生炎症性细胞因子方法I EAE模型的建立与临床评分同实施例I。2 =ELISA方法检测细胞培养上清中的细胞因子RhH)⑶5和PBS处理的EAE小鼠，行麻醉处死，分别摘取体内淋巴结和脾脏，制成细胞悬液。将小鼠脾细胞或淋巴结细胞重悬于10% FBS-RPMI 1640中，加200 μ I细胞悬液于96孔板中(每孔4Χ IO5的细胞)，每个标本三个复孔，细胞培养液中加入20 μ g/ml的M0G35_55。在含有5% CO2的37°C培养箱中培养48小时,收集细胞上清,Flow Cytomix(按照e Bioscience公司的说明书操作)方法或ELISA(按照Biolegend公司的说明书操作)方法检测培养上清中的细胞因子。结果如图9所示，M0G35_55与淋巴结细胞一起培养的上清中，与PBS处理组相比较，Rhro⑶5处理组的细胞因子如IL-2、IL-17A以及IFN- Y的水平明显下调，甚至检测不到，而抑制性细胞因子IL-10明显上调。说明施用rhH)⑶5能够抑制M0G35_55特异的淋巴结细胞分泌炎症因子。在M0G35_55与脾细胞一起培养的上清中，与PBS处理组相比较，RhH)⑶5处理组的细胞因子如TNF-α、IL-17A以及IFN-Y的水平明显下调(图10)，说明施用rhH)⑶5能够抑制M0G35_55特异的脾细胞分泌炎症因子。实施例6、rhPD⑶5作为蛋白重组药物，能够促讲小鼠⑶细胞的分化方法I :细胞培养用160 μ I的抗-CD3抗体(10 μ g/ml)包被48孔板，4°C过夜，用PBS洗两遍；麻醉处死的6-8周雌性C57BL/6小鼠，摘取体内淋巴结，制成细胞悬液(含10%FBS-RPMI 1640)，加500 μ I培养液于预先包被抗-⑶3抗体的48孔板，每孔为I X IO6的细胞，同时加入抗⑶28抗体(5 μ g/ml)、TGF-β (5ng/ml)、IL-2 (2ng/ml)以及加入不同浓度的rhH)⑶5蛋白，在含有5% CO2的37°C培养箱中培养72小时，收集细胞。2 :流式细胞分析收集不同处理的培养细胞，加入合适浓度的抗鼠⑶16/32抗体，封闭免疫球蛋白Fe受体，4°C lOmin。1200rpm，离心洗一遍。细胞重悬ΙΟΟμΙ PBS，分别加入合适浓度的抗⑶4和抗⑶25表面荧光抗体，40C，避光孵育20min。PBS洗两遍，加ImlFix/Perm buffer重悬细胞，混勻，避光20min,弃上清。用Iml perm buffer洗一遍。重悬Iml permbuffer,避光15min,弃上清。加入合适浓度抗F0XP3抗体,避光30min。PBS洗两遍。重悬于400μ1 PBS中，流式细胞计进行分析。结果如图11所示，rhH)⑶5后以浓度依赖的方式增加⑶4+CD25+FOXp3+细胞数目。说明施用rhro⑶5能够体外增加NaiVe淋巴结细胞分化为⑶4+CD25+Foxp3+细胞的数目。实施例7、rhPDCD5作为蛋白重组药物，可延缓CIA模型大鼠的发病，减轻病情。
方法CIA大鼠模型的建立与临床评分6-8周的雌性SD大鼠,饲养于北京大学医学部实验动物部,SPF级饲养,所用垫木、饮水、饲料及其与动物接触的物品均经高压灭菌处理。所有的动物实验操作和流程都符合北京大学实验动物管理制度。实验时，将胶原醋酸溶液与不完全佐剂4°C过夜充分溶解后I I均质混合，于大鼠尾根部皮下注射O. 2ml/只，7天后避开上次注射部位强化免疫一次。同时将大鼠随机分成3组，每组8只大鼠。CIA大鼠rhH)CD5处理组从模型制备当天起，腹腔注射rhH)CD5 (14mg/kg)，隔日一次,第30天结束。ClA大鼠OVA无关蛋白对照组从模型制备当天起，腹腔注射卵白蛋白(OVA)(14mg/kg),隔日一次,第30天结束。阴性对照生理盐水组从模型制备当天起，腹腔注射生理盐水，隔日一次，第30天结束。足跖肿胀度测量采用容积法测定大鼠膝关节容积。测量前于每只大鼠膝关节上
O.5cm作一标记线，每次测定以标记线为标准，每只大鼠每次测量3次取其平均值为当前容积。在造模前I天测定双侧后足爪容积，以后每周对大鼠双侧足爪容积进行测量，记录容积值。肿胀程度用当前容积减去造模前容积的差值表示。临床评分按照关节炎指数评分办法进行评估病变程度多发性关节炎评分如下O分，无肿胀；1分，I个趾关节受累；2分，多趾关节受累；3分，踝关节以下受累；4分全爪受累。造模I天后，隔日评分。结果如图12A所示，阴性对照生理盐水组大鼠不出现足跖肿胀，OVA无关蛋白对照组大鼠的足跖肿胀明显，而在rhH)CD5处理组，大鼠的足跖肿胀度明显减轻，在第三和第四周，比较OVA无关蛋白对照组和rhPDCD5处理组大鼠的足跖肿胀度，两者有明显的差异，*P
<O. 05。同时如图12B所示，与OVA无关蛋白对照组相比，rhH)⑶5处理组大鼠的临床症状明显减轻，有统计学意义。*P < O. 05，#P < O. 01。图12C是分别代表生理盐水组、OVA无关蛋白对照组和rhH)CD5处理组大鼠的足部照片。实施例8、rhPD⑶5作为蛋白重组药物，能够抑制胶原(collagen)特异件脾细胞和淋巴细胞增殖方法I CIA大鼠模型的建立与临床评分同实施例7。2 [3H-TdR]掺入法检测细胞的增殖同实施例4。结果如图13所示，在体外的培养体系中，rhH)⑶5处理的CIA大鼠淋巴结细胞对胶原的反应性明显低于OVA处理组，显示[3H]-TdR掺入量的明显降低，两者有显著性差异，*P
<O. 05 ;同时，rhH)⑶5处理的CIA大鼠脾细胞对胶原的反应性明显低于OVA处理组。说明施用rhH)CD5能够抑制胶原特异的淋巴细胞增殖反应。
实施例9、rhPDCD5作为蛋白重组药物，能够减少血■清和关节滑液中炎症细胞的水平；同时增加调节性T细胞(CDfCDZSiF0xPSi)的数暈方法I CIA大鼠模型的建立与临床评分同实施例7。2 =ELISA方法检测血清和关节液中的细胞因子rhH)⑶5和OVA处理的CIA大鼠，以及生理盐水(空白)对照组大鼠，行麻醉处死，收集血清和关节液，按照Biolegend公司的说明书操作。3 :流式细胞术分析T细胞亚群rhH)⑶5和OVA处理的CIA大鼠，行麻醉处死，分别摘取体内淋巴结和脾脏，制成细胞悬液，同时制备外周血淋巴细胞，加入合适浓度抗鼠CD16/32抗体，封闭免疫球蛋白Fe受体，4°C IOmin0 1200rpm，离心洗一遍。细胞重悬100 μ I PBS，分别加入合适浓度的抗⑶4和抗⑶25表面荧光抗体，4°C，避光孵育20min。PBS洗两遍,加Iml Fix/Perm buffer重悬细胞，混勻，避光20min,离心，弃上清。用Iml perm buffer洗一遍。重悬Iml perm buffer,避光15min。离心，加100 μ lperm buffer,加入合适浓度抗F0XP3抗体，避光30min。PBS洗两遍。重悬于400 μ I PBS中，流式细胞计进行分析。ELISA分析的结果如图14Α所示，rhH)⑶5处理的CIA大鼠血清以及关节滑液中TNF-α含量明显低于OVA处理组，#P < O. 01，< O. 001 ;同时如图14B所示，rhH)CD5处理的CIA大鼠血清以及关节滑液中IL-17A含量明显低于OVA处理组，*P < O. 05，#P
<O. 01。说明施用rhH)⑶5减少CIA大鼠炎症细胞因子水平。流式细胞计的分析结果如图15所示，rhH)⑶5处理的CIA大鼠淋巴结、外周血以及脾脏中⑶4+⑶25+Ρ0χρ3+的细胞均高于OVA处理组，说明施用rhH)⑶5能够增加外周免疫器官以及外周血中⑶4+⑶25+FoXp3+细胞的数目。
权利要求
1.人重组ro⑶5蛋白在制备增强⑶4+CD25+FOXp3+调节T细胞免疫抑制效应的药物中的应用。
2.人重组ro⑶5蛋白在制备促进抑制性细胞因子IL-IO和TGF-P产生的药物中的应用。
3.人重组H)CD5蛋白在制备抑制炎症性Thl7细胞分化的药物中的应用。
4.人重组ro⑶5蛋白在制备抑制炎症性细胞因子IL-17、IFN-Y和TNF-a产生的药物中的作用。
5.人重组TOCD5蛋白在制备预防和治疗多发性硬化症和/或其他脱髓鞘疾病的药物中的应用。
6.人重组ro⑶5蛋白在制备预防和治疗类风湿关节炎的药物中的应用。
7.人重组蛋白ro⑶5在制备预防和治疗自身免疫病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述自身免疫病为迟发型超敏反应、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、胰岛素依赖性的糖尿病、自身免疫性心肌炎、桥本氏病、Grave’ s病或重症肌无力。
全文摘要
本发明提供一种人重组蛋白PDCD5在治疗自身免疫病中的应用。人重组蛋白PDCD5能够诱导CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞分化、抑制Th17细胞的分化、抑制炎症细胞因子IL-17A和TNF-α的产生，具有免疫抑制作用。因此人重组蛋白PDCD5在诱导自身免疫抑制，应用于治疗自身免疫性疾病如多发性硬化症和/或其他脱髓鞘疾病、迟发型超敏反应、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、胰岛素依赖性的糖尿病、自身免疫性心肌炎、桥本氏病、Grave’s病、重症肌无力等具有广阔的前景。
文档编号A61P21/04GK102755633SQ20111020419
公开日2012年10月31日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年4月28日
发明者宋泉声, 张颖妹, 肖娟, 许兰俊, 许冬, 陈英玉, 马大龙 申请人:北京大学