一种人源pdl2hsa系列融合蛋白及其制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种人源PDL2HSA系列融合蛋白，包括人体PDL2蛋白的部分结构域与人体白蛋白直接连接的融合蛋白，序列为SEQ?ID?N0.1的氨基酸序列和SEQ?ID?N0.2的核苷酸序列,以及人体PDL2蛋白的部分结构域与人体白蛋白通过短肽连接的融合蛋白。本发明人通过PDL2HSA系列融合蛋白在D121肺癌肿瘤免疫模型的药效研究试验，以及PDLHSA系列融合蛋白在转移型乳腺癌基因的转殖模型(MMTV-PyVmT)肿瘤模型的药效研究，结果显示人源PDLHSA系列融合蛋白具有良好的抑制肿瘤生长和转移的药效。因此，本发明首次提供了PDLHSA系列融合蛋白可以用于制备检测PD-1结合的试剂和T细胞体外体内活化的试剂/试剂盒，以及制备抗肿瘤的免疫药物或疫苗制剂。为临床治疗肿瘤疾病和慢性感染提供新的有效的生物药物，有较大的应用价值。
【专利说明】—种人源PDL2HSA系列融合蛋白及其制备与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种人体免疫检查点调节性融合蛋白，尤其涉及一种人源TOL2HSA系列融合蛋白及其制备与应用。
【背景技术】
[0002]已有文献报道，主要在T细胞上表达的编程性死亡I (PD-1)能够与不同抗原递呈细胞(APC)上编程性死亡配体II (PD-L2)蛋白相结合。抗原递呈细胞APC表达的TO-L2能通过ro-Ι的连接抑制T细胞激活，从而帮助肿瘤逃脱免疫应答。(Shin等.J.Exp.Med.201:1531)。目前已公开了 ro-1和TO-L2的结构，以及这些分子在调控T细胞激活和耐受性情况中的信号传导特征和功能(Kier等(2008)Ann.Rev.1mmunol.26:677)。
[0003]本发明人通过科学研究和多种重组融合蛋白表达，发现不同类型或短肽连接的蛋白质通过与ro-L2部分结构域融合后，产生新型的蛋白对ro-1的结合能力各不相同。说明其融合蛋白通过形成新的蛋白构象，改变结合区域部位的分子间作用力后，会对融合蛋白ro-1的结合产生重要影响。依据融合蛋白新的构效关系和ro-1结合筛选实验，以及动物模型进行T细胞增殖筛选，我们得到了目前最可能有治疗效果的人源TOL2HSA系列融合蛋白。并进一步在肿瘤免疫模型和自发性肿瘤模型的动物试验中得到验证，这类蛋白的免疫激活作用优于TOL2与抗体结晶区融合蛋白(TOL2-FC)和抗H) — I抗体，且呈更少的自身免疫反应的副作用，为临床治疗肿瘤疾病的免疫治疗或慢性感染等疾病，逆转T细胞衰竭提供新的药物。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题在于研究设计人源TOL2HSA系列融合蛋白及其制备方法和在制药中的应用。
[0005]本发明提供了一种人源H)L2HSA系列融合蛋白。所述
[0006]人源TOL2HSA系列融合蛋白包括人体TOL2蛋白的部分结构域与人体白蛋白直接连接的融合蛋白(H)L2-HSA)和人体TOL2蛋白的部分结构域与人体白蛋白通过短肽连接的融合蛋白(roL2-n-HSA，η = O~12个氨基酸短肽的融合蛋白)。
[0007]本发明提供了一种人源TOL2蛋白的部分结构域与人体白蛋白直接连接的TOL2-HSA融合蛋白所对应的氨基酸序列SEQ ID N0.1和核苷酸序列SEQ ID N0.2。本发明还提供了人源roL2-n-HSA融合蛋白所对应的连接短肽的序列和核苷酸序列，以及在SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.2的插入位置。
[0008]本发明的另一目的是提供了所述一种人源TOL2HSA系列融合蛋白的制备方法，该方法包括下列步骤:
[0009](I)制备分离的人源TOL2HSA系列融合蛋白的核酸分子:
[0010]用聚合酶链式反 应(PCR)技术获得分离的编码H)L2HSA系列融合蛋白质的核酸；或直接合成TOL2HSA系列融合蛋白质的核酸分子；或通过酶切连接不同片段的核酸分子到表达载体而获得TOL2HSA系列融合蛋白质的核酸分子。
[0011](2)制备人源TOL2HSA系列融合蛋白质
[0012]通过宿主细胞中的重组获得:用含有编码多肽的核苷酸序列的核酸转化、转导、或转染细菌或真核宿主细胞，利用多种基于病毒的表达系统来表达TOL2HSA融合蛋白质，制备人源TOL2HSA融合蛋白质
[0013](3)纯化人源TOL2HSA系列融合蛋白质。
[0014]本发明方法所述步骤(2)的真核宿主细胞为昆虫、酵母、或哺乳动物细胞。对于表达和制备多肽有用的真核系统是本领域公知的，包括例如哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞。对于真核宿主细胞，可利用多种基于病毒的表达系统来表达H)L2-HSA融合蛋白质。基于病毒的表达系统是本领域公知的，而且包括但不限于杆状病毒、猿猴病毒40(SV40)、逆转录病毒或基于痘苗的病毒载体。使用具有适宜调控元件和选择标志的表达载体来制备稳定表达变体共刺激多肽的哺乳动物细胞系，例如，PDL2HSA系列融合蛋白质可以用Lonza公司的谷氨酰胺合成酶加压筛选(GS)真核表达系统，Invitrogen公司的二氢叶酸还原酶(DHFR)筛选真核表达系统，Invitrogen公司的毕赤酵母(Pichia)酵母表达系统来进行表达和制备。
[0015]本发明方法所述步骤(3)的纯化人源TOL2HSA系列融合蛋白质可以使用例如层析方法来分离I3D-1拮抗剂多肽，诸如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石层析。例如，可以使用蛋白G柱来分离细胞培养物上清液或细胞质提取物中的共刺激多肽。在一些实施方案中，可以“工程化改造”变体共刺激多肽以含有容许多肽被捕捉到亲和基质上的氨基酸序列。例如，可以使用标签来帮助多肽纯化，诸如原癌基因蛋白c-myc、血凝素、多组氨酸或FlagTM(Kodak)。此类标签可以插入多肽内的任何处，包括羧基或氨基端任一。其它可能有用的融合包括帮助检测多肽的酶，诸如碱性磷酸酶。也可以使用免疫亲和层析来纯化共刺激多肽。
[0016]本发明的又一目的是提供了所述一种人源TOL2HSA系列融合蛋白用于制备检测PD-1结合的有关试剂和T细胞体外体内活化的有关试剂/试剂盒。
[0017]本申请实施例2中，PDL2HSA融合蛋白能够直接结合ro-Ι，因此可以直接用于制备检测I3D-1结合的有关试剂/试剂盒。实施例3中，PDL2HSA融合蛋白能够刺激T细胞增多，因此TOL2HSA融合蛋白可以直接应用于T细胞体活化的的激活试剂/或与激活有关的试剂盒中，PDL2HSA系列融合蛋白也可以应用于体外培养，激活或增殖T细胞。TOL2与抗体结晶区融合蛋白(H)L2-FC)因为含有抗体结晶区(FC)部分，具有FC受体细胞一般有B细胞、杀伤细胞、巨噬细胞，这些细胞能够通过FC受体结合TOL2-FC融合蛋白，因此仍可能传递免疫抑制信号。并且因为TOL2-FC融合蛋白结合FC受体后会发生细胞的内吞作用，能够降低细胞外TOL2-FC融合蛋白的浓度，从而减少与I3D-1结合并刺激T细胞增殖的作用。本发明人发现由于人源H)L2HSA系列蛋白能够在肿瘤免疫模型和自发性肿瘤模型的动物试验中具有疗效，表明只有人源TOL2HSA系列蛋白能够才能满足临床药物开发过程中需要有动物实验的药效要求。
[0018]本发明还有一 个目的是提供了所述一种人源TOL2HSA系列融合蛋白在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用。
[0019]在肿瘤病人中，肿瘤细胞，或带有肿瘤抗原的抗原递呈细胞(APC)通过结合T细胞，而部分或完全抑制宿主的针对肿瘤的免疫杀伤力。而TOL2HSA系列融合蛋白质在实施例3中能够促经T细胞增加，因此TOL2HSA系列融合蛋白质可用于提高T细胞的针对抗原的特异性增殖，在肿瘤病人中应用TOL2HSA系列融合蛋白作为药物可以直接治疗或作为辅助治疗都将促经T细胞增殖，最终将导致有力的针对肿瘤抗原的免疫杀伤力。本发明人通过人源TOL2HSA系列融合蛋白在转移型乳腺癌基因的转殖模型(MMTV-PyVmT)肿瘤模型的药效研究(实施例4)，结果显示与模型对照组，PDL2-FC组(TOL2与抗体结晶区融合蛋白)和roL2-transferrin组(TOL2与转铁蛋白融合蛋白)组相比较，PDL2HSA融合蛋白治疗组能够大大提高抑制肿瘤生长效果，具有良好的治疗肿瘤药效。
[0020]本发明人通过在多种肿瘤模型中应用人源TOL2HSA系列融合蛋白发现，人源PDL2HSA系列融合蛋白能够刺激肿瘤部位CD8阳性T细胞的增多，从而提高宿主的针对肿瘤的免疫杀伤力。因此人源TOL2HSA系列融合蛋白是可运用于不同癌症类型的治疗。本发明所述癌症类型包括但不限于下述:膀胱、脑、乳房/乳腺、宫颈、结肠-直肠、食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮肤、胃、子宫、卵巢、睾丸和血液学的。可以治疗的恶性肿瘤在本文中依据衍生肿瘤的组织的胚胎起源来归类。癌瘤(Carcinoma)为源自内胚层或外胚层组织的肿瘤，诸如皮肤或内脏和腺的上皮层。不太频繁产生的肉瘤(Sarcoma)衍生自中胚层结缔组织，诸如骨、脂肪和软骨。白血病(leukemia)和淋巴瘤(lymphoma)为骨髓的造血细胞的恶性肿瘤。白血病作为单细胞来增殖，而淋巴瘤趋于作为肿瘤块来生长。恶性肿瘤可以在身体的多种器官或组织处显露出来以产生癌症。
[0021]本发明所述人源TOL2HSA融合蛋白可以单独的使用于促进和提高宿主的针对肿瘤产生持久的免疫杀伤力，而抗肿瘤化疗药物能够直接杀死肿瘤细胞,直接杀死和通过促经免疫细胞杀伤的治疗并不矛盾。因此人源H)L2HSA融合蛋白可以应用于抗肿瘤化疗药物的辅助治疗和组合 药物。代表性的抗肿瘤化疗药物包括但不限于安吖唳(amsacrine)、博来霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、卡培他滨(capecitabine)、卡钥(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺钥(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)'O, 3/4'*3/4 (clofarabine)>crisantaspase> <t 丫1:1V4 (cyclophosphamide)>阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霄素(daunorubicin)、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(印irubicin)、依托泊苷(etoposide)、氟达拉滨(f Iudarabine)、氟尿嘧丨淀(f Iuorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基服(hydroxycarbamide)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、亚叶酸(Ieucovorin)、多柔比星月旨质体(liposomal doxorubicin)、柔红霄素月旨质体(liposomal daunorubicin)、洛莫司汀(1mustine)、美法仑(melphalan)、疏嘌呤(mercaptopurine)、美司钠(mesna)、甲氛蝶吟(methotrexate)、丝裂霄素(mitomycin)、米托惠酉昆(mitoxantrone)、奥沙利钥(oxaliplatin)、中白立他塞(paclitaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、喷司他 T (pentostatin)、丙卡巴餅(procarbazine) > 雷替曲塞(raltitrexed)、沙怕(satraplatin)、链唑星(str 印 tozocin)、替加氟-尿嘧唳(tegafur-uracil)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊昔(teniposide)、塞替派(thiot印a)、硫L鸟口票吟(tioguanine)、托泊替康(topotecan)、曲奥舒凡(treosulfan)、长春喊(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)或其组合。代表性的促凋亡剂包括但不限于氟达拉滨(f Iudarabine)、牛黄斯坦(taurosporine)、环己酰亚胺(cycloheximide)、放线菌素 D (actinomycin D)、乳糖苷神经酰胺(Iactosylceramide)。
[0022]本发明所述抗肿瘤的免疫药物或疫苗制剂是由人源TOL2HSA系列融合蛋白作为活性成分与药用载体按常规方法制成。
[0023]本发明所述人源TOL2HSA系列融合蛋白免疫药物可直接用于提高患者的针对癌症的免疫力，及由此治疗癌症。实施例3是人源TOL2HSA系列融合蛋白在D121肺癌肿瘤免疫模型中的研究试验。分次注射死亡的肿瘤细胞进行抗肿瘤免疫或疫苗。而在分次注射死亡的肿瘤细胞同期，注射人源H)L2-HSA融合蛋白，能够促经宿主的抗肿瘤免疫或疫苗，导致更有力针对肿瘤的杀伤力。结果显示与对照免疫组和H)L2-FC免疫组(TOL2与抗体结晶区融合蛋白)和FOI^-transferrin免疫组(roL2与转铁蛋白融合蛋白)，F1D-1抗体组相比较，含有TOL2HSA融合蛋白疫苗组在C57小鼠的肿瘤生长抑制效果被大大提高，说明其具有良好的抗肿瘤的免疫治疗或疫苗效果。ro-Ι抗体组疗效并不好，其可能原因是ro-1抗体可使多种肿瘤产生免疫反应，从而产生针对ro-1抗体的抗体，体内免疫系统能够抑制或清除ro-Ι抗体的作用。ro-1抗体治疗已被报道会发生相关性不良反应事件，产生针对ro-l抗体免疫反应会造成免疫性肠炎和肺毒性损伤，而TOL2HSA系列融合蛋白因为都是来源于人体本身的蛋白，不会刺激引发免疫副作用。
[0024]另外在宿主中诱导表达编码TOL2HSA融合蛋白的核酸，同样能够产生与注射PDL2HSA融合蛋白相近的免疫治疗或疫苗效果。例如可以工程化改造细胞以携带编码PDL2HSA融合蛋白的核酸，让人体自发表达TOL2HSA融合蛋白，然后对受试者实施肿瘤的免疫治疗。 [0025]本发明人通过大规模的融合蛋白表达和筛选工作，首次获得了具有与ro-1高亲合力和促进T细胞增殖的人源TOL2HSA系列融合蛋白，并在自发性肿瘤模型的动物试验中得到更有效的治疗结果，特别这种新型融合蛋白能够运用到肿瘤疫苗或肿瘤免疫治疗中，为临床治疗肿瘤疾病提供新的有效的生物药物，有较大的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1人源TOL2-HSA融合蛋白的确证。
[0027]左图为用抗TO-L2抗体进行蛋白免疫印迹检测结果。右图为用抗HSA抗体进行蛋白免疫印迹检测结果。1，4的电泳上样为roL2-HAS转化细胞的培养上清液。2，3是电泳的分子标记。
[0028]图2人源PDL2HSA系列融合蛋白结合Η)_Ι
[0029]通过ELISA评估实施例1得到的人源TOL2HSA系列融合蛋白的ro-l结合活性。横坐标为450nm检测的OD值。纵坐标依次为结合1:roL2_HSA融合蛋白，2:roL2_GSGS_HSA融合蛋白，3:PDL2-GSGSGSGS-HSA 融合蛋白，4:PDL2-GSGSGSGSGSGS-HSA 融合蛋白5: PDL2-GSGSGSGSGSGSGSGS-HAS 融合蛋白 6: PDL2-FC 融合蛋白 7: PDL2-tranferin 融合蛋白
[0030]图3人源TOL2HSA系列融合蛋白在肿瘤免疫模型对⑶8阳性T细胞的影响横坐标为⑶45阳性白细胞中⑶8阳性T细胞的百分比。纵坐标依次为治疗组肿瘤组织1:H)L2-HSA, 2:PDL2-GSGS-HSA, 3:PDL2-GSGSGSGS-HSA, 4:PDL2-GSGSGSGSGSGS-HSA5:PDL2-GSGSGSGSGSGSGSGS-HAS6: PDL2-FC7: PDL2-tranferin 治疗组【具体实施方式】
[0031 ] 实施例1人源TOL2-HSA融合蛋白的表达和确证
[0032]细胞外分泌的人源H)L2-HSA融合蛋白的表达使用Invitrogen公司的二氢叶酸还原酶(DHFR)筛选真核表达系统进行表达。转染步骤:1.转染前24小时，CHO-S细胞以 5X105 ~6X IO5CelΙ/mL 密度传代到新鲜 CD FortiCHO 培养基。(Invitrogen) 130 ~150rpm，37°C，8% 0)2培养箱中培养。2.转染时，细胞用⑶FortiCHO培养基稀释到细胞密度为1\106细胞/毫升，1251!^瓶$1&810装301^细胞液。3.取50ug质粒到1.5mLOptiPRO SFM 培养基(Invitrogen)中，轻轻混匀。4.取 50uL 转化试剂(FreeStyle MAXReagent, Invitrogen)到 1.45mL0ptiPR0 SFM 培养基(Invitrogen)中，轻轻混匀。5.将质粒溶液与FreeStyle MAX Reagent溶液混合，室温放置10分钟。缓慢的加入125mL摇瓶，130~150rpm，37°C ,8% CO2培养箱中培养。6.进行补料培养:第3天，补加4g/L葡萄糖；第5天,补加4g/L葡萄糖；第7天,补加6g/L葡萄糖。纯化步骤:1.20mM磷酸缓冲液，IOOmMNaCl, pH7.2平衡蓝色琼脂糖快速凝胶(Blue Sepharose Fast Flow)。2.收集的表达上清以lmL/min的速度过柱。3.洗脱缓冲液:20mM磷酸缓冲液，2M NaCl，pH7.2。最终每升上清可以得到大于400mg蛋白。收集中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)的表达分泌液，浓缩至1/5体积，上样进行蛋白质凝胶电泳(型号Tanon公司VE-180微型垂直电流槽、条件150V，I小时30分钟)，然后转膜(具体方法采取湿转的方法，转膜缓冲液IL配方:Tris3.03g, Glycinel4.4g, SDS0.lg、条件 200mA, 2 小时)，利用抗 Η)-?2 抗体(Rabbit monoclonal antibodyto Human PD-L2, lug/mL北京义翅神州生物技术有限公司)和抗HSA抗体(Rabbit antiHSA IgG, lug/mL上海卒瑞生物技术有限公司)进行蛋白质免疫印迹检测(具体方法、条件膜在5%脱脂奶粉溶液中室温 孵育I小时以封闭膜上的非特异结合。封闭过的膜加入一抗室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。然后用磷酸吐温缓冲液(PBST)洗膜，5minX4次。加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按1:3000稀释比例用5%脱脂奶粉溶液稀释)，平稳摇动，室温2h。弃二抗，用PBST洗膜，5minX4次。加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。)。结果说明抗TO-L2抗体检测说明得到的人源TOL2-HSA融合蛋白具有抗PD-L2抗体的结合域，而抗HSA抗体检测说明融合蛋白同时也具有抗HSA抗体的结合域。见图1
[0033]PDL2-GSGS-HSA, PDL2-GSGSGSGS-HSA，PDL2-GSGSGSGSGSGS-HSA
[0034]PDL2-GSGSGSGSGSGSGSGS-HSA 和 PDL2-GSGSGSGSGSGSGSGS-HSA 融合蛋白的表达纯化于与H)L2-HSA融合蛋白方法一致，只是在合成核酸序列时的插入的核酸序列不同。见下表
【权利要求】
1.一种人源TOL2HSA系列融合蛋白，其特征在于，所述人源TOL2HSA系列融合蛋白包括人体TOL2蛋白的部分结构域与人体白蛋白直接连接的融合蛋白H)L2-HSA和人体TOL2蛋白的部分结构域与人体白蛋白通过短肽连接的融合蛋白FOI^-n-HAS ;所述η = O~12个氨基酸短肽的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种人源TOL2HSA系列融合蛋白，其特征在于，所述一种人源TOL2蛋白的部分结构域与人体白蛋白直接连接的H)L2-HSA融合蛋白为氨基酸序列SEQID N0.1和核苷酸序列SEQ ID N0.2。
3.根据权利要求1所述的一种人源TOL2HSA系列融合蛋白，其特征在于，所述人体PDL2蛋白的部分结构域与人体白蛋白通过短肽连接的融合蛋白FOI^-n-HSA ;所述η = O~12个氨基酸短肽的融合蛋白和对应的核苷酸序列。
4.制备如权利要求1所述一种人源TOL2HSA系列融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤: (1)制备分离的人源TOL2HSA系列融合蛋白的核酸分子: 用聚合酶链式反应技术获得分离的编码TOL2HSA系列融合蛋白质的核酸；或直接合成PDL2HSA系列融合蛋白质的核酸分子；或通过酶切连接不同片段的核酸分子到表达载体而获得TOL2HSA系列融合 蛋白质的核酸分子； (2)制备人源TOL2HSA系列融合蛋白质 通过宿主细胞中的重组获得:用含有编码多肽的核苷酸序列的核酸转化、转导、或转染细菌，昆虫，酵母、或哺乳动物细胞，利用多种基于病毒的表达系统来表达TOL2HSA融合蛋白质，制备人源TOL2HSA融合蛋白质。 (3)纯化人源TOL2HSA系列融合蛋白质。
5.如权利要求1所述一种人源TOL2HSA系列融合蛋白在制备检测I3D-1结合的试剂和T细胞体外体内活化的试剂/试剂盒中的应用。
6.如权利要求1所述一种人源H)L2HSA系列融合蛋白在制备抗肿瘤药物或疫苗制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤的免疫药物或疫苗制剂是由人源TOL2HSA系列融合蛋白作为活性成分与药用载体组成。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为人源TOL2-HSA融合蛋白在制备治疗肺癌疾病或乳腺癌疾病中的应用。
9.如权利要求1所述一种人源TOL2HSA系列融合蛋白用于制备抗病毒药物、抗脑膜炎、抗肝炎或抗HIV病毒的药物或疫苗制剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗病毒药物、抗脑膜炎、抗肝炎或抗HIV病毒的药物或疫苗制剂是由人源TOL2HSA系列融合蛋白作为活性成分与药用载体组成。
【文档编号】G01N33/68GK103965364SQ201410210929
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月19日 优先权日:2014年5月19日
【发明者】刘辰, 刘源 申请人:亚飞（上海）生物医药科技有限公司