专利名称：一种重组人釉原蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白，尤其是涉及一种重组人釉原蛋白及其制备方法。
背景技术：
釉基质蛋白(enamel matrix proteins，EMPs)是牙齿发育到钟状期，由内釉上皮细胞分化而来的成釉细胞合成和分泌一系列细胞外基质蛋白。自1975年首次提出来自赫特威氏上皮根鞘的釉质相关蛋白可以诱导牙根部无细胞性牙骨质形成以后，体外实验和临床治疗广泛证实EMPs能有效促进牙周韧带、牙骨质、牙槽骨再生，形成类似正常的牙周组织的排列，达到真正的牙周再生。发育中EMPs最主要的成分——釉原蛋白(amelogenin，Am)，也是EMPs中促进牙周再生的主要活性成分。但Am的组成不是单一的，至少有9种成分，分子量范围5～27kD。目前广泛应用于牙周再生的基础研究和临床应用的EMPs基本为提取的猪釉基质蛋白，其主要的成分是分子量为20kD、13kD、11kD的Am。现有的唯一釉基质蛋白市售商品——
的有效成分也是从猪牙胚组织中提取的釉原蛋白的衍生物。
目前国内尚未见有人工合成的单一组分的人Am。Am是成釉细胞中Am基因的表达产物。人有两个Am基因，一个定位于X染色体p22.1-p22.3区域，另一个在Y染色体q11处。逆转录PCR证实主要的转录本来自于X染色体。人Am基因至少包括7个外显子，存在至少有9种选择剪切的方式，编码的九种不同Am在组织中的含量并不相等。剪切去掉外显子4是最常见的一种剪切方式，由它编码的Am在发育的釉质中最多见。研究证实成熟的人Am的主要成分是X染色体上Am基因的翻译产物——由175个氨基酸残基组成的Mr1.96×104蛋白。
发明内容
本发明的目的在于 (1)提供一种重组人釉原蛋白； (2)提供一种重组人釉原蛋白制备方法。
本发明的技术方案如下 1、一种重组人釉原蛋白，通过下列方法制得 a、克隆X染色体编码的人釉原蛋白成熟肽基因hAm； b、构建含有上述基因的重组原核表达质粒PGEX4T1-hAm； c、将步骤b获得的重组原核表达质粒PGEX4T1-hAm转化表达菌株E.coli.Rosetta； d、诱导步骤c获得的克隆表达菌株表达融合蛋白GST-hAm； e、通过GST亲和层析纯化融合蛋白。
在步骤a中克隆位点的两个内切酶EcoR I和Sal I作为将目的基因克隆入载体的内切酶。所述内切酶EcoR I和Sal I酶切位点的引物序列如下Am-EcoR I 5’CCG GAA TTC ATG CCT CTA CCA CCT CAT CCT G3’；Am-Sal I 5’ACGC GTC GAC TTA ATC CAC TTC CTC CCG CTT G3’。步骤a所述的人釉原蛋白成熟肽基因由人X染色体编码，来源于人胚胎的乳牙牙胚组织，步骤b所述的重组原核表达质粒是将人釉原蛋白成熟肽编码序列插入原核表达质粒PGEX4T1而得到的，步骤c所用的是专门用于含有稀有密码子的真核蛋白在大肠杆菌中的表达宿主菌E.coli.Rosetta，步骤d所述的含有重组质粒的克隆表达菌株用异丙基硫代-β-D半乳糖苷诱导表达融合蛋白GST-hAm，步骤e所表达的融合蛋白通过GST亲和层析纯化。
2、一种重组人釉原蛋白的制备方法，包括以下步骤 a、克隆X染色体编码的人釉原蛋白成熟肽基因hAm； b、构建含有上述基因的重组原核表达质粒PGEX4T1-hAm； c、将步骤b获得的重组原核表达质粒PGEX4T1-hAm转化表达菌株E.coli.Rosetta； d、诱导步骤c获得的克隆表达菌株表达融合蛋白GST-hAm； e、通过GST亲和层析纯化融合蛋白。
在步骤a中克隆位点的两个内切酶EcoR I和SalI作为将目的基因克隆入载体的内切酶。所述内切酶EcoR I和SalI酶切位点的引物序列如下Am-EcoR I 5’CCG GAA TTC ATG CCT CTA CCA CCT CAT CCT G3’；Am-Sal I 5’ACGC GTC GAC TTA ATC CAC TTC CTC CCG CTT G3’。步骤a所述的人釉原蛋白成熟肽基因由人X染色体编码，来源于人胚胎的乳牙牙胚组织，步骤b所述的重组原核表达质粒是将人釉原蛋白成熟肽编码序列插入原核表达质粒PGEX4T1而得到的，步骤c所用的是专门用于含有稀有密码子的真核蛋白在大肠杆菌中的表达宿主菌E.coli.Rosetta，步骤d所述的含有重组质粒的克隆表达菌株用异丙基硫代-β-D半乳糖苷诱导表达融合蛋白GST-hAm，步骤e所表达的融合蛋白通过GST亲和层析纯化。
依照上述技术方案本发明的具体实施方法是 将冻存的牙胚组织在液氮中磨成粉末，抽提总RNA。将总RNA逆转录合成cDNA第一链。选择hAm成熟肽基因序列中不存在而在质粒PGEX4T1中存在克隆位点的两个内切酶EcoR I和Sal I作为将目的基因克隆入载体的内切酶。设计带有酶切位点的引物，序列如下Am-EcoRI 5’CCG GAA TTC ATG CCT CTA CCA CCT CAT CCT G 3’；Am-SalI 5’ACGC GTC GAC TTA ATC CAC TTC CTC CCG CTT G 3’。以1ststrand cDNA为模板，扩增出hAm成熟肽基因，同时用管家基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为对照检测总RNA的完整性和逆转录的效率。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，紫外灯下迅速切割目的基因hAm凝胶条块，用小量胶回收试剂盒(天根)提取纯化PCR产物。目的基因hAm与质粒PGEX4T1分别用ECoR I和Sal I在37℃H型通用缓冲液中进行双酶切4h，酶切产物分别割胶回收。回收的目的片段和载体质粒用T4DNA ligase连接过夜后转化E.coli.DH5α感受态细菌。重组质粒PGEX4T1-hAm经ECoR I和Sal I双酶切初步筛选阳性克隆，送上海生工生物工程技术服务有限公司(以下简称为上海生工)测序鉴定。将经鉴定的重组载体质粒PGEX4T1-hAm和空白质粒PGEX4T1分别转化表达菌株E.coli.Rosetta感受态细胞，得到克隆表达菌株和空白对照菌株。接种单克隆到含有氨卞青霉素100μg/ml和氯霉素340μg/ml的液体LB培养基中，37℃振荡过夜活化，将活化的细菌按20％接种到含有双抗的液体LB培养基中37℃振荡培养2h，当OD600值达到0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.3mmol/L，诱导4h。将诱导后的细菌沉淀用10倍体积的PBS于冰上重悬菌体后超声破菌，加入20％TrixtonX-100至终浓度为1％，反复吹打溶解后10000rpm离心1小时。取上清上谷胱甘肽-琼脂糖树脂柱(Glutathione Sepharose 4B Medium)弃去流下的液体，再用含有TrixtonX-100的PBS反复漂洗，彻底清除未结合的杂蛋白，最后洗脱蛋白。
本发明所公开一种重组人釉原蛋白及其制备方法，其优点表现在 (1)首次从人乳牙胚组织中克隆得到X染色体来源的人釉原蛋白成熟肽的编码序列，并通过原核表达质粒在大肠杆菌中成功表达的融合蛋白，人工合成的重组人釉原蛋白可以通过GST亲和层析纯化获得。
(2)本发明所得的克隆表达菌株可长期保存，并随时大量复制，能够较为方便快捷的大量人工合成重组人釉原蛋白，也为将来釉原蛋白的批量化生产以及商品化提供了可能。
(3)本发明使用PGEX4T系列质粒所表达的融合蛋白带有谷胱甘肽S转移酶(GST)标记。GST本身是解毒过程中重要的转移酶，由于其高度可溶，可利用它来增加外源蛋白的可溶性；其在大肠杆菌中可以大量表达，起到一种促进表达量提高的作用。同时在GST与多克隆位点之间存在可以将GST切除的Thrombin蛋白酶识别位点，可通过凝血酶将GST切除。Rosetta是专门设计用于增强含有稀有密码子的真核蛋白在大肠杆菌中的表达。它以一个可兼容的氯霉素抗性质粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA等6种tRNA，实现在天然大肠杆菌中进行原核蛋白和真核蛋白“通用型”翻译。该菌种源于BL21lacZY突变，保留了通过改变IPTG诱导浓度精确控制表达水平的优点；同时具有BL21的lon和ompT缺陷型特点，增加蛋白稳定性。
图1载体质粒PGEX4T1的结构示意图。
图2人釉原蛋白基因(hAm)RT-PCR产物RT-PCR扩增后样品组特异性扩增产物大小约540bp，与预期所得的hAm mRNA成熟肽编码区碱基长度一致。管家基因对照组约400bp，而阴性对照无特异性产物。
图3空白对照用质粒PGEX4T1(1#)转化大肠杆菌DH5α作为空白对照，以此检验本转化系统。照片显示平皿上布满单菌落，说明转化效率符合要求。
图4阴性对照将新鲜过夜的DH5α菌液涂布含有抗生素的LB平皿，作为阴性对照，用来检验此转化系统。照片显示平皿上没有菌落，说明转化系统可靠。
图5样品取200μl样品(2#)涂布平皿。照片显示由平皿上有散在单菌落，说明转化成功。
图6重组质粒PGEX4T1-hAm序列分析图用DNA Star软件分析结果显示重组质粒中插入片段编码的氨基酸序列与文献报道的hAm成熟肽序列完全一致。片段两端酶切位点、起始密码及终止密码均准确无误。
图7重组人釉原蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图转化了空白质粒PGEX4T的对照菌株诱导后在约26KD处有一明显的新生蛋白带，说明它是经IPTG诱导后产生的蛋白，其蛋白质大小与GST的大小基本一致。而重组菌株诱导后的样品在约46KD有一明显新生蛋白条带，与预计的融合蛋白大小基本相同(GST大小为26KD，Am大小约为20KD)。对表达蛋白的可溶性分析表明融合蛋白表达产物以包涵体形式存在。M低分子量标准蛋白；1、2转化了空白质粒PGEX4T1的对照菌株诱导前后的样品；3-10分别为4个不同表达克隆诱导前后的样品，其中单号为诱导前，双号为诱导后；11超声破菌后上清样品；12超声破菌后的沉淀。
图8重组人釉原蛋白的纯化与鉴定图通过谷胱甘肽-琼脂糖树脂亲和层析可以纯化表达的融合蛋白GST-hAm，经Westen-blot验证纯化后的融合蛋白可与特异性抗人釉原蛋白多克隆抗体发生亲和反应。1未纯化前细菌总蛋白；2纯化后蛋白样品；3纯化后的融合蛋白GST-hAm的Westen-blot图谱。
具体实施例方式 下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1 一种重组人釉原蛋白制备 I、克隆X染色体编码的人釉原蛋白成熟肽基因hAm的材料与方法 一、主要实验材料 1.人牙胚组织上海第二医科大学附属第九人民医院实验室备用。
2.主要试剂及溶液 (1)总RNA抽提试剂盒(博彩生物科技有限公司) (2)c DNA第一链合成试剂盒(博彩生物科技有限公司) (3)小量胶回收试剂盒(天根公司) (4)PCR试剂Taq DNA聚合酶、10×扩增缓冲液、MgCL2、10mmol/L 4×dNTP(Pr omeg公司) (5)DEPC(博彩生物科技有限公司) (6)DNA marker (7)6×琼脂糖电泳上样液由下列组成2.5g/L的溴酚兰(用0.5mol/L Na OH 调至深蓝色PH＝8.0)、400g/L的蔗糖、10mmol/L的EDTA(PH＝8.0)。
(8)50×TAE缓冲液由下列组成242g的Tris碱、57.1ml的冰乙酸、100ml的0.5mol/L EDTA PH＝8.0，加双蒸水定容至1L。
1.实验仪器 (1)台式离心机GB7676-87(上海离心机械厂) (2)U-3000分光光度计(Hitachi公司) (3)9600-PCR仪(PE公司) (4)稳流稳压电泳仪DY-501(Pharmacia公司) 二、实验方法 1.取材人胚胎牙胚组织取材和冻存4～6个月胎龄的合法引产胎儿，无菌条件下暴露牙弓部位，挑开牙龈组织，挖取乳切牙、乳尖牙和乳磨牙的牙胚，按口内的分区将牙胚分装为四管，立即置液氮中冻存，-80℃长期保存。
2.引物设计 (1)Am基因序列特点如下 1-68位包含有5’帽结构、5’非翻译区及启动子等结构，69-117位编码信号肽，117-644位编码成熟肽(mature peptide)，645-793位为3’非翻译区，不包括PolyA尾，因此靶基因的扩增范围为117-644位。选取Am成熟肽基因序列中不存在酶切位点而在质粒中存在克隆位点的两个内切酶作为将目的基因克隆入载体中内切酶。设计带有酶切位点的引物，确保PCR产物在包含完整的Am成熟肽基因序列的同时引入酶切位点。
以DNA Star软件对Am成熟肽基因序列进行分析，此序列117-644位间不存在酶切位点的内切酶如下 AarI，AatII，AccI，AclI，AflII，AflIII，AhdI，AloI，ApaI，ApoI，AscI，AvaI，AvrII，BaeI，BaeI，BamHI，BbsI，BbvCI，Bce83I，BcefI，BcgI，BcgI，BciVI，BclI，BglI，BglII，BplI，BplI，BpmI，Bpu10I，BsaI，BsaAI，BsaBI，BsaHI，BsaWI，BsaXI，BseRI，BsiEI，BsmI，BsmAI，BsmBI，Bsp24I，Bsp24I，BspEI，BspGI，BspLU11I，BspMI，BsrBI，BsrDI，BsrFI，BsrGI，BssHII，BssSI，BstEII，BstXI，BstYI，BstZ17I，Bsu36I，BtrI，BtsI，CjeI，CjeI，CjePI，CjePI，ClaI，DraI，DraIII，DrdI，DrdII，EagI，EarI，Eco47III，EcoNI，EcoRI，EcoRV，FseI，FspI，GdiII，HaeII，HaeIV，HgaI，HgiEII，Hin4I，HincII，HpaI，MboII，MluI，MspAlI，MunI，NarI，NdeI，NgoAIV，NheI，NotI，NruI，NsiI，NspI，NspV，PacI，Pfl1108I，PflMI，PinAI，PmeI，PmlI，PpiI，PshAI，PsiI，PvuI，PvuII，RcaI，RleAI，RsrII，SacI，SacII，SalI，SanDI，SapI，SbfI，ScaI，SexAI，SfiI，SgfI，SgrAI，SmaI，SmlI，SnaBI，SpeI，SphI，SrfI，Sse8647I，SspI，StuI，SunI，SwaI，TaqII，TatI，Tth111I，Tth111II，VspI，XbaI，XcmI，XhoI，XmnI (2)载体质粒PGEX4T1的结构示意图见图1。
比较Am成熟肽基因序列中不存在的酶切位点和质粒中存在的克隆位点后，选取EcoR I和Sal I作为将目的基因克隆入载体中内切酶。按 照上述引物设计要求设计引物如下Am-EcoR I 5’CCG GAA TTC ATGCCT CTA CCA CCT CAT CCT G 3’；Am-Sal I 5’ACGC GTC GAC TTA ATCCAC TTC CTC CCG CTT G 3’。设计了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物G15’CAC CAT CTT CCA GGA GGG AG 3’G25’TCA CGCCAC AGT TTC CCG GA 3’ 3.牙胚组织总RNA的提取(Trizol Total RNA Isolation Kit) (1)用液氮将牙胚组织磨成粉末，在样品中加入Trizol(每50mg组织加0.5m 的Trizol)，用枪头反复抽吸混匀后转移到1.5ml离心管中。
(2)加入200μl chloroformIsoamyl alcohol，剧烈振荡30秒。
(3)用台式离心机，12000rpm，室温离心5分钟。
(4)将上清液(约350μl)小心转移到无菌Rnase-free1.5ml的离心管中，加入150μl无水乙醇，混匀。
(5)小心取出3s柱和收集管，将步骤4中的溶液全部转移到3s柱里，室温放置2分钟，台式离心机10000rpm，室温离心1分钟。
(6)小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回同一根收集管中，加入500μl溶液W，12000rpm，室温离心1分钟。
(7)重复步骤(6)一次。
(8)小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回同一根收集管中，10000r pm，室温离心1分钟。
(9)小心取出柱子，放到无菌Rnase-free1.5ml的离心管中，在柱内膜的中央小心加入DEPC-H2O 50μl，50℃放置2分钟。
(10)10000rpm，室温离心1分钟。收集管内的溶液为RNA样品。
(11)RNA的分析和定量测定样品在λ＝260nm和λ＝280nm的吸收值确定RNA的质量。按1OD260＝40ugRNA计算RNA的产率；OD260/OD280在1.8-2.0是为抽提的RNA纯度很高。
4.应用RT-PCR的方法获得人釉原蛋白成熟肽基因序列hAm (1)逆转录多聚酶链式反应获得1st strand cDNA a)在无菌Rna se-free 1.5ml的离心管中加入2μl总RNA，加入DEPC-H2O 6μl使总体积为8μl。
b)加入0.5μl Ribonuclease inhibitor，2μl Oligo(dT)18primer，小心混匀。
c)65℃保温5分钟。
d)室温放置10分钟，10000rpm，15秒，将溶液收集到管底。
e)按次序分别加入下列试剂4μl 5×First-Strand Buffer；0.5μl Ribonuclease inhibitor；2μl dNTP mix；2μl DTT；1μl MMμlV Reverse Transcriptase f)小心混匀，37℃保温1小时。
g)90℃处理5分钟。冰上冷却，室温高速离心15秒，将所有溶液收集到管底。此溶液即为1st strand cDNA。
(2)PCR扩增人釉原蛋白成熟肽基因hAm 以1st strand cDNA为模板，扩增人釉原蛋白成熟肽基因片段hAm。同时用GAPDH引物进行PCR作为对照，检验总RNA抽提和1st standcDNA合成的产物。以无菌水代替DNA模板，作为阴性对照。产物上样进行琼脂糖凝胶电泳检验。反应体系如下ddH2O 9.8μl；10×Buffer2μl；MgCl2 1.2μl；4dNTPs 2μl；模板cDNA 2μl；引物Am-EcoR I 1μl；Am-Sal I 1μl；Taq酶1μl。反应参数94℃，5分钟；(94℃，30秒；56℃，30秒；72℃，45秒)×30循环；72℃，5分钟，反应结束。
5.琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 (1)将胶槽放好，架好梳子备用。
(2)称取350mg琼脂糖至100ml三角烧瓶中，加入50mlTAE缓冲液。
(3)加热熔化至无颗粒状琼脂糖，冷却至60℃左右加入E.B.(终浓度为0.5μg/μl)。
(4)摇匀后倒入准备好的胶槽，待凝固。
(5)拔去梳子，取出胶槽放入电泳槽，倒入适量TAE。
(6)取0.5μl 6×点样液在点样板上，加入2μl样品混匀。
(7)上样，80V，30min。
(8)紫外灯下观测电泳结果。
6.PCR产物回收(割胶回收试剂盒)对PCR扩增产物进行回收 (1)将PCR产物电泳条带在紫外灯下割下含DNA的琼脂糖块，使其尽可能小。放入1.5m l离心管内，秤重(胶重＝总重量-空管重量)。
(2)按每100mg琼脂糖加入300μl Buffer S1的比例加入S1液，50℃水浴10分钟，每2分钟摇匀一次，直至胶完全溶解。
(3)加入1/3Buffer S1体积的异丙醇，50℃水浴1分钟，混匀。
(4)将溶解的胶液转移到吸附柱内，15000rpm，离心1分钟。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管。如胶液体积大于柱容量，则离心完后，再次移液于同一柱内，再次离心。
(5)在柱内加入500μl BufferW1，10000rpm，离心15秒。弃去离心液，柱子重新置于同一回收管内。
(6)在柱内加入500μl BufferW1，静置1分钟，10000rpm离心1分钟。弃去离心液，柱子重新置于同一回收管内。
(7)将柱子以10000rpm再次离心1分钟。
(8)将柱子置于一个新的1.5ml离心管内，柱模中央加30μl无菌水，50℃水浴或室温放置2分钟。
(9)15000rpm，离心1分钟，收集离心液。
(10)取2μl离心液，琼脂糖凝胶电泳检测，电泳步骤同前。
7.测序鉴定目的基因 对割胶回收的PCR产物送上海生工测序，并用DNA Star软件将测序结果与Gene Bank公布的标准序列比对。
三、结果 1.RNA的分析和定量 OD260/280＝1.8881，因此认为抽提的总RNA纯度较高。浓度为196ng/u l。
2.目的基因的鉴定 RT-PCR扩增后样品组特异性扩增产物大小约540bp，与预期所得的hAm mRNA成熟肽编码区碱基长度一致。管家基因对照组约400bp，而阴性对照无特异性产物。
测序证实PCR的扩增产物与Gene Bank公布的人釉原蛋白标准序列完全一致。见图2 II、构建含有hAm基因的重组原核表达质粒PGEX4T1-hAm的材料与方法 一、主要实验材料 1.原料 (1)PGEX4T 1载体质粒GE healthcare公司 (2)大肠杆菌DH 5α感受态细菌上海生工 2.主要试剂 (1)限制性内切酶EcoR I，Sal I，10×K Buffer(TakaRa公司，大连) (2)T4DNA Ligase(TakaRa公司，大连) (3)氨苄青霉素(Roche公司) (4)氯霉素 (5)小量质粒抽提试剂盒(天根公司，北京)使用前将试剂盒中提供的RnaseA全部加入溶液P1，混匀后2-8℃保存。使用前漂洗液PW中加入4倍体积无水乙醇。
(6)小量凝胶回收试剂盒(天根公司，北京) (7)液体LB培养基细菌培养用胰化蛋白胨10g；细菌培养用酵母提取物5g；NaCl 10g。上述成分配制后，加入适量双蒸水，磁力加热搅拌器上充分溶解，5M NaOH调节pH至7.0，补双蒸水至1000ml。121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却后4℃冰箱保存。
(8)固体LB培养基细菌培养用胰化蛋白胨10g；细菌培养用酵母提取物5g；NaCl 10g；琼脂(agarose)15g。上述成分配制后，加入适量双蒸水，磁力加热搅拌器上充分溶解，5M NaOH调节pH至7.0，补双蒸水至1000ml。121℃高压蒸汽灭菌20分钟，取出后在超净工作台中加入氨苄青霉素至终浓度为100μg/ml，浇制平皿，冷却后4℃冰箱保存。
3.主要仪器 (1)YJ-1FB医用净化工作台(吴江市净化设备总厂) (2)台式离心机GB 7676-87(上海离心机械厂) (3)U-3000分光光度计(Hitachi公司) (4)9600-PCR仪(PE公司) (5)Molecular
Fx和Quantity One软件(Bio-Rad公司) (6)恒温摇床(YHZ-22江苏太仓王秀试验设备厂) 二、实验方法 1.载体的制备PGEX4T1质粒抽提 (1)将购买的含有质粒PGEX4T1的E.Coli.DH5α菌株用划线法接种于含氨苄青霉素100μg/ml的LB固体培养基平皿上，37℃温箱孵育过夜，活化菌种。
(2)次日下午挑取4个单菌落接种于4支含5ml LB液体培养基(氨苄青霉素100μg/ml)的烧瓶内，摇床内37℃，200rpm过夜。
(3)将以上菌液转入4个1.5ml离心管，10000rpm，离心1分钟，弃上清，吸干残液。
(4)在离心管内加入250μl溶液P1，振荡混匀。
(5)加入250μl溶液P 2，温和地上下翻转4-6次充分裂解菌体。
(6)加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，见白色絮状沉淀后12000rpm，离心10分钟。
(7)柱平衡将吸附柱CB3放入收集管中，加入500μl平衡液BL，12000rpm，离心1分钟。倒掉收集管中废液。
(8)小心的将步骤6中的上清吸取至吸附柱CB3中，室温放置1-2分钟，12000rpm离心1分钟。倒掉收集管中废液。
(9)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，12000rpm离心1分钟。倒掉收集管中废液。
(10)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心1分钟。倒掉收集管中废液。
(11)将吸附柱CB3重新放回收集管中，12000rpm离心2分钟，除尽残液。
(12)将吸附柱CB3放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央加50μl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟。12000rpm离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中。
2.重组质粒的构建 (1)目的基因hAm及质粒PGEX4T1的双酶切 目的基因hAm与质粒PGEX4T1分别用ECoR I和Sal I在37℃H型通用缓冲液中进行双酶切4h。反应体系见下表1、2。
表1目的基因酶切反应体系(μl)
表2PGEX4T1酶切反应体系(μl)
酶切产物分别割胶回收，操作步骤同前。取1μl回收产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳步骤、条件同前，Molecular
Fx扫描电泳后的琼脂糖块，Quantity One软件确定酶切产物的浓度。
(2)酶切产物的连接 将目的片段hAm与载体质粒PGEX4T1的双酶切产物用T4DNA ligase在14℃(12℃～16℃)连接过夜。反应体系见表3。
表3连接反应体系(μl)
(3)感受态细菌的转化 用连接液转化感受态细菌作为样品组；以质粒PGEX4T1转化感受态细菌作为空白对照组；将细菌DH5α接种于含有抗生素的LB培养基上作阴性对照。
a)在超净工作台内取两个1.5ml离心管，编号1#、2#。分别加入100μl感受态细菌。1#管内加1μl质粒PGEX4T1混匀(空白对照)。2#管内加20μl连接液混匀(样品)。
b)0℃冰浴0.5～1小时。
c)42℃水浴90秒。
d)迅速0℃冰浴2分钟。
e)超净工作台中向管内加入800μl液体LB培养基(不含抗生素)。
f)37℃，200rpm振荡培养45分钟。
g)将一定量的菌液以无菌铺菌器涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平皿表面。
h)阴性对照取新鲜过夜的DH5α菌液100μl涂平皿。(见图3)空白对照取1#管菌液100μl涂平皿。(见图4) 样品2#管10000rpm离心3分钟，吸取有沉淀的菌液200μl涂平皿。(见图5) i)平放20分钟后，37℃倒置培养10～14小时。
3.重组质粒的检验 挑取样品平皿中的单菌落抽提质粒，以空白对照平皿中的单菌落及质粒PGEX4T1作为对照，分别运用双酶切来检验目标片段hAm是否插入质粒PGEX4T1，筛选出的阳性克隆送上海生工测序鉴定。
(1)小量抽提质粒 在样品平皿/空白对照平皿中分别挑取2个单菌落，分别转入含有5ml LB液体培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)的试管内，摇床内37℃，200rpm过夜。抽提质粒方法同前。
(2)酶切检验 以2种克隆的酶对样品重组质粒PGEX4T1-hAm进行酶切，并且用空质粒PGEX4T1作对照。反应体系如下表，酶切产物上样琼脂糖电泳检测。
表4酶切反应体系(μl)
(3)测序检验 将经双酶切初步筛选的样品重组质粒送上海生工测序，并通过DNAStar软件与Gene Bank公布的Am基因标准序列对比，同时鉴定插入片段两侧的酶切位点、起始及终止密码。
四、结果 1.质粒转化结果 大肠杆菌转化成功，空白对照布满单菌落；阴性对照无菌落生长；样品平皿可见散在单菌落。
2.重组质粒PGEX4T1-hAm酶切鉴定 重组原核表达载体质粒PGEX4T1-hAm经EcoR I和Sal I双酶切的凝胶电泳图谱显示大小约为540bp的目的基因hAm条带和4.9kbp的载体质粒条带，分别与目的基因hAm和质粒PGEX4T1经双酶切后的电泳条带平齐。。
3.重组质粒测序结果(见图6) 测序报告示重组质粒中插入的片段与文献报道的hAm成熟肽基因序列完全一致，片段两端酶切位点、起始密码及终止密码均准确无误。
III、制备含有重组质粒PGEX4T1-hAm的克隆表达菌株的材料与方法一、主要实验材料 1.主要试剂 (1)PGEX4T1载体质粒GE healthcare公司 (2)大肠杆菌Rosetta感受态细菌上海生工 (3)氨苄青霉素(Roche公司) (4)氯霉素(Roche公司) 2.主要仪器 (1)YJ-1FB医用净化工作台(吴江市净化设备总厂) (2)台式离心机GB 7676-87(上海离心机械厂) (3)恒温摇床(YHZ-22江苏太仓王秀试验设备厂) 二、实验方法 1.感受态细菌的转化 将经鉴定的重组表达质粒PGEX4T1-hAm和空白质粒PGEX4T1分别转化表达菌株E.coli.Rosetta感受态细胞，得到克隆表达菌株和空白对照菌株。
(1)在超净工作台内取两个1.5ml离心管，编号1#、2#。分别加入100μl感受态细菌。1#管内加1μl空白质粒PGEX4T1混匀(空白对照)。2#管内加1μl重组质粒PGEX4T1-hAm混匀(样品)。
(2)0℃冰浴0.5～1小时。
(3)42℃水浴90秒。
(4)迅速0℃冰浴2分钟。
(5)超净工作台中向管内加入800μl液体LB培养基(不含抗生素)。
(6)37℃，200rpm振荡培养45分钟。
(7)将一定量的菌液以无菌铺菌器涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平皿表面。
(8)空白对照取1#管菌液200μl涂平皿。
样品取2#管菌液200μl涂平皿。
平放20分钟后，37℃倒置培养10～14小时。
IV重组人釉原蛋白的诱导表达、分离纯化和鉴定 一、主要实验材料 1.主要试剂 (1)异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(Biolab公司) (2)SDS-PAGE低分子量标准蛋白质(上海生物化学研究所) (3)Glutathione Sepharose 4B Medium column (4)Triton X-100 (5)10×PBS 1.4M NaCl 27mM KCl 100mM Na2HPO4 18mM KH2PO4 上述成分配制后，加入适量双蒸水，磁力加热搅拌器上充分溶解，5MNaOH调节pH至7.3，补双蒸水至1000ml。121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
(6)Elution buffer 50mM Tris-HCl 10mM还原型谷胱甘肽reduced glutathione(pH 8.0) (7)聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂 a)30％丙烯酰胺溶液 丙稀酰胺(Acr)37.5g 甲叉双丙稀酰胺(Bic)1g 超纯水至100ml，溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
b)1.5mol/L Tris(PH8.8)Tris(MW121.14)45.43g；超纯水200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温保存。
c)1.0mol/L Tris(PH6.8)Tris(MW121.14)15.14g；超纯水200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温保存。
d)10％十二烷基硫酸钠(SDS) e)10％过硫酸铵 f)TEMED(N，N，N，N-tetra methylethlene diamine，N，N，N，N-四甲基乙二胺) g)1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液6g Tris，8g甘氨酸，1g SDS，ddH2O定容到1L(25mmol/L Tris碱；250mmol/L电泳级甘氨酸，PH8.30；1％SDS) h)脱色液甲醇∶冰乙酸∶水＝5∶1∶4 i)染色液脱色液中加0.25％的考马斯亮蓝R250 j)2×SDS-PAGE电泳上样液 100mmol/L Tris-HCL PH6.8 200mmol/L DTT 4％SDS 0.2％溴酚蓝 20％甘油 k)转移缓冲液 甘氨酸(MW75.07)2.9g；Tris(MW121.14)5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；蒸馏水至1000ml。
1)10×丽春红染液 丽春红S 2g；三氯乙酸30g；磺基水杨酸30g，蒸馏水至100ml。
m)洗脱抗体缓冲液PBST 含有0.1％Tween-20的1×PBS。
2.主要仪器 (1)YJ-1FB医用净化工作台(吴江市净化设备总厂) (2)台式离心机GB7676-87(上海离心机械厂) (3)恒温摇床(YHZ-22江苏太仓王秀试验设备厂) (4)Cole-Parmer instrument co.超声破碎仪 (5)Mettler AZ260电子天平 (6)Bio-RAD垂直电泳仪 二、实验方法 1.重组人釉原蛋白融合蛋白的诱导表达 (1)挑选实施例3得到的克隆表达菌株的单克隆4株和空白对照菌株1株，接种到2m l含有双抗的液体LB培养基(氨卞青霉素100μg/ml和氯霉素)中，37℃200rpm振荡过夜活化。
(2)将上述过夜活化的细菌按20％接种到含有4m l双抗的液体LB培养基中37℃250rpm振荡培养，每隔1小时测OD600值。
(3)当OD600值达到0.6～0.8时，超净台中取1m l菌液，12000rpm离心1分钟收菌，标记为诱导前，加入25μlH2O和25μl 2×上样缓冲液重悬菌体，-20℃保存。
(4)加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.3mmol/L，继续37℃200rpm振荡培养，诱导4小时。
(5)取1m l菌液12000rpm离心1分钟收菌，标记为诱导后，加入25μlH2O和25μl 2×上样缓冲液重悬菌体。
(6)收集剩余的3ml菌液，12000rpm离心1分钟收集菌体，加入原体积的1×PBS，反复超声粉碎，离心并定量转移上清至另一管，即为上清样品(S)；用同量的缓冲液悬浮沉淀样品，即为沉淀样品(I) (7)诱导前后的所有样品沸水浴加热5min，5000rpm离心3min后进行12％SDS-PAGE电泳检测。
2.SDS-PAGE凝胶电泳 (1)清洗玻璃板一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
(2)灌胶玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。然后胶上加一层水液封。当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。按前面方法配4％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后，将其放入电泳槽中，加足够的电泳液后两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
(3)上样取出上样样品至200μl的EP管中，加入2×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。样品于沸水中煮5-10min使蛋白变性，10000rpm离心3分钟。用微量进样器贴壁吸取样品至加样孔中缓慢加入样品。
(4)电泳恒定电压为100V，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳 (5)染色与脱色将玻璃板撬掉将浓缩胶轻轻刮去，小心剥下分离胶。用染色液在脱色摇床上染色约45min，然后用水冲洗掉没染上的染液。换脱色液在脱色摇床上脱色。
3.重组hAm融合蛋白的亲和层析纯化 (1)将hAm表达菌株接种到50ml含有双抗的液体LB培养基(氨卞青霉素100μg/ml和氯霉素)中，37℃200rpm振荡过夜活化。
(2)将上述过夜活化的细菌按4％接种到含有1L双抗的液体LB培养基中37℃250rpm振荡培养，每隔1小时测OD600值。
(3)当OD600值达到0.8～1.0时，加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2mmol/L，继续37℃200rpm振荡培养，诱导4小时。
(4)收集菌液至500m l离心瓶中，4℃5000rpm离心30分钟收集菌体。
(5)冰上进行如下操作，用1×PBS重悬菌体，转移到50ml离心管中，4℃12000rpm离心30分钟。
(6)用1×PBS于冰上再次洗涤菌体沉淀。
(7)电子天平称量细菌沉淀，重3克。
(8)用30ml(10倍体积)的1×PBS于冰上重悬菌体，加入溶菌酶30μl，反复吹打混匀。
(9)在冰上超声破菌，程序设置(总工作时间100秒；脉冲方式打1秒，停1秒)。重复2～3次至菌悬液呈半透明状。
(10)加入20％TritonX-100至终浓度为1％，反复吹打溶解，室温放置30分钟帮助溶解。
(11)4℃10000rpm离心1小时，收集上清。
(12)将上清过Glutathione Sepharose 4B柱，弃去流出液。
(13)用10倍柱体积的含有TrixtonX-100的PBS反复漂洗，彻底清除未结合的杂蛋白。
(14)用最后用Elution buffer洗脱，洗脱蛋白样品-80℃保存。
(15)取25μl洗脱后样品加入25μl 2×上样缓冲液，沸水浴加热5min，5000rpm离心3min后进行SDS-PAGE电泳检测。
4.重组hAm融合蛋白的鉴定 (1)电泳步骤同SDS-PAGE凝胶电泳 (2)转膜 a)转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜，将切好的硝酸纤维素膜置于转移缓冲液中浸湿。在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
b)小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，将膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
c)将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2h或250mA转移2h。
d)转完后将膜用1×丽春红染液染5min(于脱色摇床上摇)。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。
(3)免疫反应 将膜用含有0.5％脱脂奶粉的PBS从下向上浸湿后，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
将一抗(羊抗人Amelogenin，Santa Cruz)用含有0.5％脱脂奶粉的PBS稀释至适当浓度(1∶200)；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持 平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；4℃孵育过夜，用PBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。
同上方法准备二抗稀释液(抗羊IgG，Rock Land，1∶5000)并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用PBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。
凝胶图象分析将膜用Odyssay红外荧光扫描系统(Genecompany limited)扫描并分析图像。
三、实验结果(见图7，8) 1.重组hAm融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳检测 转化了空白质粒PGEX4T的对照菌株诱导后较诱导前在约26KD处多出一明显的新生蛋白带，说明它是经IPTG诱导后产生的蛋白，其蛋白质大小与亲和标记谷胱甘肽S转移酶(GST)的大小基本一致。而重组菌株诱导后的样品在约46KD有一明显新生蛋白条带，与预计的融合蛋白大小基本相同(GST大小为26KD，Am大小约为20KD)。对表达蛋白的可溶性分析表明融合蛋白表达产物以包涵体形式存在。
2.融合蛋白GST-hAm的亲和层析纯化 重组表达质粒PGEX4T1-hAm经IPTG诱导表达产物——融合蛋白GST-hAm可通过通过谷胱甘肽-琼脂糖树脂亲和层析纯化。
3.重组hAm融合蛋白的鉴定 纯化得到的融合蛋白GST-hAm经Westen-blot验证可与特异性抗人釉原蛋白多克隆抗体发生亲和反应，证实通过诱导表达并纯化得到的蛋白是重组人釉原蛋白。
权利要求
1、一种重组人釉原蛋白，其特征在于通过下列方法制得
a、克隆X染色体编码的人釉原蛋白成熟肽基因hAm；
b、构建含有上述基因的重组原核表达质粒PGEX4T1-hAm；
c、将步骤b获得的重组原核表达质粒PGEX4T1-hAm转化表达菌株E.coli.Rosetta；
d、诱导步骤c获得的克隆表达菌株表达融合蛋白GST-hAm；
e、通过GST亲和层析纯化融合蛋白。
2、根据权利要求1所述的重组人釉原蛋白，其特征在于在步骤a中克隆位点的两个内切酶EcoR I和Sal I作为将目的基因克隆入载体的内切酶。
3、根据权利要求2所述的重组人釉原蛋白，其特征在于所述内切酶EcoRI和Sal I酶切位点的引物序列如下Am-EcoR I 5’CCG GAA TTC ATGCCT CTA CCA CCT CAT CCT G 3’；Am-Sal I 5’ACGC GTC GAC TTAATCCAC TTC CTC CCG CTT G 3’。
4、根据权利要求3所述的重组人釉原蛋白，其特征在于步骤a所述的人釉原蛋白成熟肽基因由人X染色体编码，其组织来源为人胚胎的乳牙牙胚组织，步骤b所述的重组原核表达质粒是将人釉原蛋白成熟肽编码序列插入原核表达质粒PGEX4T1而得到的，步骤c所用的是专门用于含有稀有密码子的真核蛋白在大肠杆菌中的表达宿主菌E.coli.Rosetta，步骤d所述的含有重组质粒的克隆表达菌株用异丙基硫代-β-D半乳糖苷诱导表达融合蛋白GST-hAm，步骤e所表达的融合蛋白通过GST亲和层析纯化。
5、一种重组人釉原蛋白的制备方法，包括以下步骤
a、克隆X染色体编码的人釉原蛋白成熟肽基因hAm；
b、构建含有上述基因的重组原核表达质粒PGEX4T1-hAm；
c、将步骤b获得的重组原核表达质粒PGEX4T1-hAm转化表达菌株E.coli.Rosetta；
d、诱导步骤c获得的克隆表达菌株表达融合蛋白GST-hAm；
e、通过GST亲和层析纯化融合蛋白。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于在步骤a中克隆位点的两个内切酶EcoR I和Sal I作为将目的基因克隆入载体的内切酶。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述内切酶EcoR I和SalI酶切位点的引物序列如下Am-EcoR I 5’CCG GAA TTC ATG CCT CTACCACCT CAT CCT G 3’；Am-Sal I 5’ACGC GTC GAC TTAATC CAC TTCCTC CCG CTT G 3’。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤a所述的人釉原蛋白成熟肽基因由人X染色体编码，其组织来源为人胚胎的乳牙牙胚组织，步骤b所述的重组原核表达质粒是将人釉原蛋白成熟肽编码序列插入原核表达质粒PGEX4T1而得到的，步骤c所用的是专门用于含有稀有密码子的真核蛋白在大肠杆菌中的表达宿主菌E.coli.Rosetta，步骤d所述的含有重组质粒的克隆表达菌株用异丙基硫代-β-D半乳糖苷诱导表达融合蛋白GST-hAm，步骤e所表达的融合蛋白通过GST亲和层析纯化。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白，尤其是涉及一种重组人釉原蛋白及其制备方法。本发明的技术方案如下一种重组人釉原蛋白，通过下列方法制得a.克隆X染色体编码的人釉原蛋白成熟肽基因hAm；b.构建含有上述基因的重组原核表达质粒PGEX4T1-hAm；c.将步骤b获得的重组原核表达质粒PGEX4T1-hAm转化表达菌株E.coli.Rosetta；d.诱导步骤c获得的克隆表达菌株表达融合蛋白GST-hAm；e.通过GST亲和层析纯化融合蛋白。本发明首次从人乳牙胚组织中克隆得到人釉原蛋白成熟肽的编码序列，并通过原核表达质粒在大肠杆菌中成功表达的融合蛋白，人工合成的重组人釉原蛋白可以通过GST亲和层析纯化获得。
文档编号C07K14/435GK101565463SQ20081003647
公开日2009年10月28日 申请日期2008年4月22日 优先权日2008年4月22日
发明者蓉 束, 岚 程 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院