专利名称：基因重组人胶原蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组胶原蛋白及其生产方法。
背景技术：
胶原蛋白是一种生物高分子物质，是维持肌肤和组织器官的形态和结构，也是修复各损伤组织的重要物质。主要存在于人和动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织中重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能。胶原蛋白对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用。胶原蛋白可以给予含有胶原蛋白的皮肤层所必需的养分，使皮肤中的胶原蛋白活性加强，保持角质层水分以及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增加循环，达到滋润皮肤延缓老化，美容，消皱，养发的目的。生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱或酶来处理动物组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮/鳞等)，从中提取胶原蛋白。这些方法虽然成本低廉、回收率较高，但是制取的胶原蛋白均为分子量很小且长度不等的混合胶原蛋白肽段，俗称明胶，很难起到保湿、滋养的效果；提取工艺简单粗放，产物纯度不佳，常有异味；动物来源，无法摆脱生物安全隐患，极大的限制了传统胶原在化妆品、食品、药品等各类产品中的广泛应用；加工提取时产生巨量废水严重伤害环境；技术门椹低，原料来源不易控制，造成皮鞋奶、毒胶囊横行，食品、药品安全隐患严重。为了解释传统动物胶原的一系列问题，许多学者开始着手应用生物技术来生产重组胶原，因微生物培养的种种便利，利用重组微生物生产胶原逐渐成为主流。产业化生产的，如范代娣应用大肠杆菌高密度发酵培养生产的重组类人胶原蛋白，并已成功应用到化妆品领域。但是细菌表达体系具有内毒素、热原等生物安全问题，使得产品的生产、检测成本高企，并存在隐患；表达的蛋白以包涵体形式存在细菌细胞内，产物纯化困难、回收率受限制；另外原核表达系统比较低级，不能完成表达产物的翻译后加工修饰，使产物不具有生物活性。因此，越来越多的学者开始利用真核微生物生产重组胶原:张凤龙等利用毕赤酵母合成几乎完全人源性的重组胶原，应用于化妆品。但其纯化方法仅采用了超滤、凝胶过滤、离子交换等传统非特异性的大分子分离技术，纯度不够高，杂蛋白和部分降解蛋白无法彻度去除，满足不了微创美容、整形美容对纯度的更高要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有重组胶原及其制备技术的不足，提供一种真核工程菌生产的完全人源化的重组胶原，其性能远优于动物胶原蛋白、原核微生物重组胶原；同时带有特异性亲和纯化标记，易于得到高纯度产品。基因重组人胶原蛋白全长474个氨基酸，由两段完全相同的人III型胶原片段串联而成，C末端连接6个组氨酸残基，其序列(SEQ ID N0.1)如下:AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARG 50 LAGPPGMPGPRGSPGPQGVK GESGKPGANG LSGERGPPGP QGLPGLAGTA 100 GEPGRDGNPG SDGLPGRDGSPGGKGDRGEN GSPGAPGAPG HPGPPGPVGP 150 AGKS⑶RGES GPAGPAGAPG PAGSRGAPGPQGPRGDKGET GERGAAGIKG 200 HRGFPGNPGA PGSPGPAGQQ GAIGSPGPAE FTAGNTGAPGSPGVSGPKGD 250 AGQPGEKGSP GAQGPPGAPG PLGIAGITGA RGLAGPPGMP GPRGSPGPQG
300
VKGESGKPGA NGLSGERGPP GPQGLPGLAG TAGEPGRDGN PGSDGLPGRD 350GSPGGKGDRG ENGSPGAPGA PGHPGPPGPV GPAGKS⑶RG ESGPAGPAGA 400 PGPAGSRGAPGPQGPRGDKG ETGERGAAGI KGHRGFPGNP GAPGSPGPAG 450 QQGAIGSPGP ADHHHHHHTGLARF474
蛋白为单链结构，其中I 229和233 461为相同的III型胶原肽段，两段人III型胶原蛋白片段之间有EFT连接，233 461的人III型胶蛋白原片段后采用DHHHHHHTGLARF进行修饰，其中463 468为亲和纯化标记6His。 生产上述蛋白的基因重组工程菌及蛋白制备方法由下述步骤组成:
(一)、重组表达载体的构建
从人新鲜胎盘中提取总RNA，反转录为cDNA，根据GenBank III型人胶原蛋白C0L3A1基因序列，设计 PCR 扩增引物 F (SEQ ID N0.2)、R (SEQ ID N0.3):
F: GAATCTGTGAATCATGCCCTACR: GAAGTCATAATCTCAT CGGTGTT
以cDNA为模版PCR扩增C0L3A1基因，产物长度为3295bp。回收特异性产物连接于pGM-T 载体，得到质粒 pGM-T- C0L3A1 ；
依照《分子克隆实验指南》中多重PCR的方法，以pGM-T- C0L3A1质粒为模板，使用引物F1、F2、R进行多重PCR扩增，得到产物为722bp的产物C0L3，引物为:
(SEQ ID N0.4) Fl:AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTG(SEQ ID N0.5) F2:TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT(SEQ ID N0.6) R: TTGAATTCTGCAGGTCCTGG 将产物C0L3和载体pPIC9K分别做EcoR 1、Xho I双酶切，并经T4 DNA连接酶连接成为 pPIC9K-C0L3 ；
以质粒pPIC9K-C0L3为模板，设计引物，再次扩增C0L3，同时添加6His标记。弓丨物为:(SEQ ID N0.7) F:CCCGAATTCACTGCGGGTAACACTGGTGC(SEQ ID N0.8) R:AAAACCGGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCTGCAGGTCCTGGACTG将二次扩增产物C0L3-6His和质粒pPIC9K-C0L3分别进行EcoR 1、Age I双酶切，并经T4 DNA连接酶连接成为pPIC9K-C0L3-C0L3-6His。目标蛋白的基因序列如下:
I GCGGGTAACA CTGGTGCTCC TGGCAGCCCT GGAGTGTCTG GACCAAAAGG 51 TGATGCTGGC CAACCAGGAG AGAAGGGATC GCCTGGTGCC CAGGGCCCAC 101 CAGGAGCTCC AGGCCCACTT GGGATTGCTG GGATCACTGG AGCACGGGGT 151 CTTGCAGGAC CACCAGGCAT GCCAGGTCCT AGGGGAAGCC CTGGCCCTCA 201 GGGTGTCAAG GGTGAAAGTG GGAAACCAGG AGCTAACGGT CTCAGTGGAG
权利要求
1.一种人源化基因重组胶原蛋白，其特征是序列如下:蛋白全长474个氨基酸，其中I 229和233 461为相同的人III型胶蛋白原片段，两段人III型胶原蛋白片段之间有EFT连接，233 461的人III型胶蛋白原片段后采用DHHHHHHTGLARF进行修饰；其氨基酸序列如下:(SEQ ID N0.1) AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARG 50 LAGPPGMPGPRGSPGPQGVK GESGKPGANG LSGERGPPGP QGLPGLAGTA 100 GEPGRDGNPG SDGLPGRDGSPGGK⑶RGEN GSPGAPGAPG HPGPPGPVGP 150 AGKS⑶RGES GPAGPAGAPG PAGSRGAPGPQGPRGDKGET GERGAAGIKG 200 HRGFPGNPGA PGSPGPAGQQ GAIGSPGPAE FTAGNTGAPGSPGVSGPKGD 250 AGQPGEKGSP GAQGPPGAPG PLGIAGITGA RGLAGPPGMP GPRGSPGPQG300 VKGESGKPGA NGLSGERGPP GPQGLPGLAG TAGEPGRDGN PGSDGLPGRD 350GSPGGK⑶RG ENGSPGAPGA PGHPGPPGPV GPAGKS⑶RG ESGPAGPAGA 400 PGPAGSRGAPGPQGPRGDKG ETGERGAAGI KGHRGFPGNP GAPGSPGPAG 450 QQGAIGSPGP ADHHHHHHTGLARF474。
2.—种生产权利要求1所述蛋白的工程菌，其特征在于该工程菌由下述步骤获得: (1)克隆人III型胶蛋白基因 从人新鲜胎盘中提取总RNA，反转录为cDNA，根据GenBank III型人胶原蛋白COL3A1基因序列，设计基因PCR扩增引物F、R:(SEQ ID N0.2) F: GAATCTGTGAATCATGCCCTAC(SEQ ID N0.3) R: GAAGTCATAATCTCATCGGTGTT以cDNA为模版扩增得到基因片段，产物长度为3295bp ；` (2)构建质粒pPIC9K-COL3-COL3-6His 利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按产品说明书，从普通的1.5%琼脂糖凝胶上回收特异性条带COL3A1 ;依照pGM-T克隆试剂盒说明书，将COL3A1连接于pGM_T载体上，得到质粒pGM-T-COL3Al ；以pGM-T_COL3Al质粒为模板，以F1、F2、R为引物进行多重PCR扩增，得到产物COL3长度为722bp，引物为:(SEQ ID N0.4) Fl:AGGCTGAAGCTGCGGGTAACACTG(SEQ ID N0.5) F2:TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT(SEQ ID N0.6) R: TTGAATTCTGCAGGTCCTGG 将产物COL3和质粒pPIC9K分别做EcoR 1、Xho I双酶切，并经T4 DNA连接酶连接成为质粒 pPIC9K-C0L3 ； 以质粒pPIC9K-C0L3为模板，再次扩增C0L3得到C0L3_6His，引物为:F:CCCGAATTCACTGCGGGTAACACTGGTGC (SEQ ID N0.7)R:AAAACCGGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCTGCAGGTCCTGGACTG (SEQ ID N0.8) 将二次扩增产物C0L3-6His和质粒pPIC9K-C0L3分别进行EcoR1、AgeI双酶切，并经T4DNA连接酶连接成为质粒pPIC9K-C0L3-C0L3-6His ； (3)基因重组构建表达人III型胶蛋白的毕赤酵母基因工程菌 将制备得到的质粒pPIC9K-C0L3-C0L3-6His用限制性内切酶I线性化，并制备毕赤酵母 SMDl 168( Invitrogen)感受态细胞，电击转化 pPIC9K-C0L3-C0L3_6His 质粒，以 G418梯度法挑选高拷贝阳性克隆，得到毕赤酵母基因工程菌。
3.制备权利要求1所述蛋白的方法，其特征在于用BMGY培养基于30°C250rpm培养权利要求2所述的毕赤酵母基因工程菌16 18小时，至0D6(i(i=2 6 ;室温下1500g 3000g离心5min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使0D_=1.0左右，将所得的菌液置于三角瓶中，用双层纱布封口，于30°C 250rpm继续生长；每24小时向培养基中添加甲醇至终浓度为1%开始诱导培养，直到100小时以上；发酵培养结束后，离心收集上清，在非变性条件下用N1-NTA His Bands树脂(Merck)吸附重组胶原，漂洗流出杂质，最后再洗脱重组胶原，收集洗脱液；洗脱液经超滤系统(PALL)脱盐、浓缩，浓缩液经冷冻干燥制得基因重组人胶原蛋白。
4.一种编码权利要求1所述蛋白的基因序列，其特征在于序列如下:(SEQ ID N0.9)
5.一种用于使用基因重组工程菌生产重组人源胶原蛋白时的重组胶原蛋白纯化方法，其特征在于在进行基因重组工程菌构建过程中，在进行重组人源胶原蛋白氨基酸序列设计时，使用附带有蛋白质修饰功能的核苷酸引物，对人源胶原蛋白氨基酸序列采用附加DHHHHHHTGLARF的方式进行修饰，并在从工程菌发酵液中提取重组人源胶原蛋白时通过N1-NTA His.Bind树脂吸附的方式纯化。
6.一种用于权利要求5所述的，附带有蛋白质修饰功能的核苷酸引物，其特征在于根据人源胶原蛋白氨基酸序列设计核苷酸引物时，在C端增加设计6个用于表达组氨酸的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述用于在C端增加6个用于表达组氨酸的核苷酸序列是GTGGTGGTGGTGGTGGTG。
8.权利要求6所述的附带有蛋白质修饰功能的核苷酸引物，其特征在于其核苷酸序列为F:CCCGAATTCACTGCGGGTAACACTGGTGCR:AAAACCGGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCTGCAGGTCCTGGACTG 。
9.权利要求1所述的基因重组人胶原蛋白在制备化妆品中的用途。
10.一种用于美容的外用护肤产品，其特征在于所制备的产品以水为溶剂，由以下质量配比的原料组成: 基因重组人胶原蛋白0.01 1% 透明质酸钠0.01 ~ 0.1% β-葡聚糖0.01 1%` 霍霍巴酯0.01 0.5% 丝氨酸0.01 1% 山梨醇I 5% 甜菜碱I 5% 乳酸钠0.1 3%。
11.一种用于美容的导入性产品，其特征在于分别由冻干粉和溶剂组成，冻干粉由以下质量配比的无菌原料配制而成，并冷冻干燥: 基因重组人胶原蛋白0.1% 甘露醇5% ； 溶剂由0.05 %无菌透明质酸钠溶液组成。
全文摘要
一种由真核菌生产的人源化基因重组人胶原蛋白，全长474个氨基酸，由两段完全相同的人Ⅲ型胶原片段串联而成，C端连接6个组氨酸残基作为特异性亲和纯化标记。基因重组人胶原蛋白性能优于动物胶原蛋白、原核工程菌重组胶原；带有特异性亲和纯化标记，易于得到高纯度产品。
文档编号A61K8/65GK103102407SQ201310033299
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者梁亮 申请人:西安益力欣生物科技有限公司